实验一食品中蛋白质含量测定凯氏定氮法

实验一食品中蛋白质含量测定凯氏定氮法
实验一食品中蛋白质含量测定凯氏定氮法

营养技能实训指导

≤烹饪营养与安全≥课程组

福州黎明职业技术学院药学系

2007年02月

目录

1、实训一食物中蛋白质含量测定(凯氏定氮法)

2、实训二食物中脂肪含量的测定(索氏抽提法)

3、实训三荧光法测定食物中维生素B2

4、实训四大学生食谱编制与计算

5、实训五用配餐软件配制幼儿园一周食谱

6、实训六烹饪营养配餐与菜单设计

7、实训七厨房用具砧板的卫生调查(细菌菌落总数测定)

8、实训八厨房卫生调查(大肠菌群快速检测法)

实训一食物中蛋白质含量测定(凯氏定氮法)

一、目的与要求

1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2、掌握凯氏定氮法的操作技术,包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。

二、实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化,使蛋白质分解,产生的氨与

硫酸结合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,再用盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外,还含有其它含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋白

三、仪器与试剂

(一)试剂

1、硫酸铜(CuSO4·5H20)

2、硫酸钾

3、硫酸(密度为1.8419g/L)

4、硼酸溶液(20g/L)

5、氢氧化钠溶液(400g/L)

(整理)6种方法测定蛋白质含量.

6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏(kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1) 2NH3+H2SO4――(NH4)2 SO4(2) (NH4)2 SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材 1.试剂: (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(bsa)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05NaOH配制。 (2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4?5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6?4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。 2.器材: 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 (三)操作方法 1.标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(20~25℃)下放置30分

食品中蛋白质的测定实验报告

1.目的 掌握凯氏定氮法测蛋白质的原理、操作、条件、注意事项。 2.原理 蛋白质是含氮有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解。分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后在以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量计算含氮量再乘以换算系数,即为蛋白质含量。 3.试剂 3.1浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾,所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制 3.2混合指示液 1份(1g/L)甲基红乙醇溶液与5份1g/L溴甲酚氯乙醇溶液临用时混合。 也可用2份甲基红乙醇溶液与1份1g/L次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 3.3氢氧化钠溶液(400g/L) 3.4标准滴定溶液 硫酸标准溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L]或盐酸标准溶液[c(HCl) 0.0500mol/L] 3.5硼酸溶液(20g/L) 4.仪器 定氮蒸馏装置 5.样品 全蛋(2.47g) 6.操作 6.1样品处理 准确称取2—5g半固体样品,小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中,然后加入研细的硫酸铜0.5g,硫酸钾10g和浓硫酸20mL,轻轻摇匀后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45°角斜放于加有石棉网的电炉上,小火加热,待内容物全部炭化后,泡沫完全消失后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色呈请透明后,再继续加热0.5h,取下放冷,慢慢加入20mL水。 放冷后,移入100mL容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用。取与处理样品相同的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。 6.2连接装置 装好定氮装置,于水蒸气发生器内装水至2/3处,加甲基红指示剂数滴及少量硫酸,以保持水呈酸性,加入数滴玻璃珠以防暴沸,用调压器控制,

几种测蛋白含量方法的比较

蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 (一)蛋白质测定方法的比较(原理、优缺点)蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry 法)和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry 法)和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法(GB 5009.5-2010) 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高,适用于0.2~ I.Omg氮,误差为土2%;操作复杂费时,整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。,测得结果为总氮含量,包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广,几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法

物质含氮量的测定——微量凯氏定氮法

生物物质含氮量的测定——微量凯氏定氮法 一、目的 1、了解微量凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理。 2、掌握本试验的操作步骤。 二、原理 1.生物材料中含有许多含氮的有机物,如蛋白质、核酸、氨基酸等,故含氮量 的测定在生化研究中十分重要。知道了含氮量,就可推知蛋白质量。本法适于测定0.2~2.0毫克的氮。 2.有机物与浓硫酸共热,有机物转变为氨,氨与硫酸作用生成硫酸铵,后者与强 碱作用释放出氨,借蒸汽将氨蒸至硫酸液中和的浓度,即可计算出样品的含氮量。 3.本实验用直接法来判断中和程度。用硼酸作为氨的吸收溶液,结果使溶液中 氢离子降低,混合指示剂(pH4.3~pH5.4)由黑紫色变成绿色。再用标准酸来滴定,使硼酸恢复到原来的氢离子的浓度为止,指示剂出现淡紫色终点,此时所耗的盐酸量为氨的量。 NH 3+H 3 BO 4 → NH 4 H 2 BO 4 NH 4 H 2 BO 4 +HCl —→ NH 4 Cl+H 3 BO 4 4.为了加速消化,可加入CuSO4作催化剂,硫酸钾或硫酸钠可提高溶液的沸点。 此外硒汞混合物或钼酸钠可作为催化剂,且缩短作用时间,H2O2也可加速反应。 三、试剂和器材 1、试剂的配制 (1)样液 7.5g蛋清溶于0.9% NaCl液,并以生理盐水稀释至100ml。如有不溶物,离心取上清备用,即为7.50%的鸡蛋清溶液。 (2)30% 氢氧化钠溶液 (3)2% 硼酸溶液 (4)混合指示剂 (5)1mol/L标准盐酸溶液 2、材料 硫酸(A.R.)、硫酸钾:硫酸铜=3:1(W:W)混匀研成粉末、凯氏定氮管、凯

氏定氮仪。 四、操作 1、消化 每人1支凯氏定氮管编号,第1、2组加1.0ml蒸馏水作为空白对照,其他各组加1.0ml鸡蛋清样液。然后加硫酸钾-硫酸铜混合物约20mg及浓硫酸2ml,并放入3-4粒玻璃珠,放在消化炉上加热消化。开始时应控制火力,将消化温度控制在150℃5 min,然后再增加至200℃,消化10 min。注意勿使瓶内液体冲至瓶颈。待瓶内水汽蒸完,硫酸开始分解释放出SO2白烟后,适当加强火力至300℃消化10 min,然后增加火力至450℃,直至消化液透明并呈淡绿色为止(1.5-2 h),冷却,准备蒸馏。 2、蒸馏 每人取50-100ml锥瓶1个,先按一般方法洗净,再用蒸汽洗涤3次,每次15-20s,冷却,用吸管各加入2%硼酸溶液5.0ml及指示剂2-3滴。如瓶内液体呈葡萄紫色,盖好备用。如锥形瓶内液体呈绿色,需要蒸汽重新洗涤。 将装有消化液的消化管,加入定氮仪左边反应室,再在冷凝管下置一盛有硼酸液及指示剂的锥形瓶,并使冷凝管口插入酸液面下约0.5 cm处。 打开碱开关,通入10-15ml的30%NaOH溶液,让NaOH液缓缓流入反应室内的消化管中。关掉通碱开关,打开通气阀开始蒸馏。开始蒸馏后,即应注意硼酸溶液颜色的变化。当酸液由葡萄紫色变成绿色后,再蒸馏20s,若绿色不变,降低锥形瓶,使冷凝管口离开酸液液面约1cm,再通气数秒钟(让凝管口上的溶液进入锥形瓶)后关掉通气阀,移去锥形瓶,盖好,准备滴定。 3、滴定 用0.01mol/L的HCl溶液滴定锥形瓶中的硼酸溶液至浅葡萄紫色,记录所耗HCl溶液的量。 4、计算 蛋白量=(A-B)×10-3×M×14.008×6.25 ×100/7.5 即为每g鸡蛋清中所含的蛋白质的量 A=滴定样品用去的HCl液ml数; B=滴定空白用去的HCl液ml数; M=滴定所用盐酸的摩尔浓度; 14.008=氮之原子量。

凯氏定氮仪的使用方法

摘要:叙述了凯氏定氮仪在使用过程中的几点注意事项,浅谈凯氏定氮仪的维护与保养。 关键词:凯氏定氮仪;使用经验;保养方法 全自动凯氏定氮仪作为测定蛋白质的首选仪器,广泛应用于乳与乳制品中蛋白质的含量的测定。全自动凯氏定氮仪具有高灵敏度,分析速度快,应用范围广,所需试样少,设备和操作比较简单等特点它是目前使用最广泛测定乳与乳制品中蛋白质的仪器。 全自动凯氏定氮仪的简单分析装置流程由四个基本部分组成:(1)蒸馏装置;(2)滴定装置;(3)检测装置; (4)排废装置。下面就本人在工作中的心得,分别谈谈对这四部分的维护与保养的认识。 特别提示:反复认真地阅读仪器使用说明书,做到对仪器的主要部件如蒸馏装置、滴定装置、检测装置和排废装置的功能、特点及其相互关联匹配情况,熟悉、理解,融会贯通。严格按照说明书和仪器操作规程的要求,进行规范操作,这是正确使用和科学保养仪器的前提。 1使用经验 1.1开机之前,保证各个溶液能够满足此次试验测定,检查去离子水,碱液和接收液的使用情况,以及废液桶中废液得到了及时的清理。如果在去离子水,碱液和接收液的液位低于液位传感器的话,或废液的液位高于液位传感器的话,仪器将报警,正在进行的试验将被停止,影响测定工作的正常进行。 1.2 开机之前,保证冷却水的开关是打开了。如果冷却水开关关闭,仪器虽然能自检通过,但是在蒸馏过程中,由于蒸馏装置的温度太高,仪器将报警,提示打开冷却水开关。打开冷却水开关后,仪器将继续工作。但此次试验被停止,影响正常测定的同时,在没有冷却水保护的情况下,对蒸馏装置具有损伤。 1.3 等1.1和1.2确认无误后开机,仪器自检,自检通过后,仪器进入等待选择程序阶段。首先进入手动模式对滴定器中的气泡进行排除。气泡的存在会影响测定结果,因为气泡进入后,会占据标准滴定酸的体积,使标准滴定酸的体积减小,测定结果偏低。 排除气泡的方法是;首先打开仪器前盖,仪器报警,提示仪器前盖被打开,找一块小磁铁放在仪器前面的触点上,按面板上回车键,此时仪器默认前盖关闭。将仪器功能选择滴定器充液,滴定器活塞向上移动停止后,用收捏住滴定器的塑料软管,选择滴定器排空,滴定器活塞向下移动,等移动3~5秒后立刻松手,滴定器中气泡将上浮至滴定器上端,选择滴定器充液,气泡被排除滴定器,反复2~3次,将气泡排净后开始测定。 1.4空白的测定 在空白测定时,首先测定水空白,水空白的测定是为了检查仪器的稳定程度。当前后两次空白测定值小于0.05且水空白值小于0.2时,仪器稳定。测定试剂空白,并将空白值输入仪器。如果不先测定水空白而直接测试剂空白,即在仪器不稳定的情况下就进行试剂空白的测定,将会得到偏高的试剂空白值,测定结果将偏低。 1.5样品测定 牛乳样品需要混合均匀后取样,因为牛乳样品容易脂肪上浮,不事先混合而直接从上层取样的话,测定结果将偏低。乳粉样品混合均匀后用称量纸称量,并用镊子送如消化管底部。因操作不当残留在管壁上的样品,在加入硫酸的时候用硫酸冲入消化管底部。如果残留在管壁上而不用硫酸冲入的话,将会使测定结果偏低。 在加酸的过程中,要考虑到样品的组成对消耗酸量的影响。酸量小,样品消化不完全,测定结果偏低;酸量大,在上机过程中与碱中后酸过量,游离胺不能被蒸馏出来,严重影响测定结果。所以,要严格控制硫酸的用量,表1列出了乳与乳制品中各个组分对酸的消耗量。 表1 乳与乳制品中各个组分对酸的消耗量 样品的成分消耗的酸量(ml硫酸/g) 脂肪9.7 蛋白质 4.9

环境监测实验报告

分数 环境监测实验报告 姓名:陈志杰 班级:10级环工一班 院系:水建院 任课教师:杜丹 2012年12 月16 日

内蒙古农业大学西区宿舍楼生活饮用水水质检测分析报告一、西区宿舍楼生活饮用水水质监测目的 1掌握水质现状及其变化趋势。 2为开展水环境质量评价和预测、预报及进行环境科学研究 提供基础数据和技术手段。 3为国家政府部门制定水环境保护标准、法规和规划提供有关 数据和资料。 4对环境污染纠纷进行仲裁监测,为判断纠纷原因提供科学依据。 二、水质监测项目指标 物理指标:水温,臭和味,色度,浊度,透明度,固体物(总固体物,溶解固体物,悬浮物),矿化度,电导率,氧化还原电位。 金属化合物:铝,汞,镉,铅,铜,锌,铬,砷,其他金属化合物如镍、铁、锰、钙、镁、铀。 非金属无机化合物:酸度和碱度,pH,溶解氧(DO),氰化物(简单氰化物,络合氰化物,有机氰化物),氟化物,含氮化合物(氨氮,亚硝酸盐氮,硝酸盐氮,凯氏氮,总氮),硫化物,含磷化合物,其他非金属无机化合物,如氯化物、碘化物、硫酸盐、余氯、硼、二氧化硅。 有机污染物:综合指标和类别指标化学需氧量(COD),高锰酸盐指数,生化需氧量(BOD),总有机碳(TOC),挥发酚,油类。 特定有机污染物:挥发性卤代烃,挥发性有机物(VOCs),多

环芳烃(PAHs)。 底质和活性污泥(污泥沉降比,污泥浓度,污泥容积指数) 二、水质检测方法 实验一pH值的测定 pH值是水中氢离子活度的负对数。pH=-log10αH+。 pH值是环境监测中常用的和最重要的检验项目之一。饮用水标准的pH值的范围是6.5~8.5。由于pH值受水温影响而变化,测定时应在规定的温度下进行,或者校正温度。通常采用玻璃电极法和比色法测定pH值。比色法简便,但受色度、浊度、胶体物质、氧化剂、还原剂及盐度的干扰。玻璃电极法基本不受上述因素的干扰。然而,pH在10以上时,产生“钠差”,读数偏低,需选用特制的“低钠差”,玻璃电极,或使用与水样的pH值相近的标准缓冲溶液对仪器进行校正。 本实验采用玻璃电极法测定pH值。 (一)实验目的 掌握玻璃电极法测定pH的方法及原理 (二)实验原理 以玻璃电极为指示电极,与参比电极组成电池。在25℃理想条件下,氢离子活度变化10倍,使电动势偏移59.16mv,根据电动势的变化测量出pH值。两种电极结合在一起能组成复合电极。pH计测量出玻璃复合电极的电压,电压转换成pH值,其结果被显示出来。(三)实验仪器 pH计(PB-21) (四)实验试剂 1.pH=4.003缓冲液(邻苯二甲酸氢钾) 2.pH=6.864缓冲液(混合磷酸盐) 3.pH=9.182缓冲液(硼砂) (五)实验步骤 1.将电极浸入到缓冲溶液中,搅拌均匀,直至达到稳定。 2.按mode(转换)键,直至显示出所需要的pH值测量方式。

蛋白质含量测定方法及其比较资料2

蛋白质含量测定法(一) 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩脲法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较

值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(Biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材

蛋白质含量测定 凯氏定氮法

食品中蛋白质含量测定(凯氏定氮法) 一、目的与要求 1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。 2、掌握凯氏定氮法的操作技术,包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化,使蛋白质分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后,再用盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量。 因为食品中除蛋白质外,还含有其它含氮物质,所以此蛋白质称为粗蛋白。 三、仪器与试剂 硫酸铜(CuSO4·5H20)硫酸钾硫酸(密度为L)硼酸溶液(20g/L) 氢氧化钠溶液(400g/L)L盐酸标准滴定溶液。 混合指示试剂:%甲基红乙溶液液1份,与%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。 微量定氮蒸馏装置:如图3-所示。 图3-微量凯氏定氮装置 1、电炉; 2、水蒸气发生器(2L平底烧瓶); 3、螺旋夹a; 4、小漏斗及棒状玻璃塞(样品入口处); 5、反应室; 6、反应室外层; 7、橡皮管及螺旋夹b;8、冷凝管;9、蒸馏液接收瓶。 四、实验步骤 1、样品消化 称取样品约(±),移入干燥的100mL凯氏烧瓶中,加入硫酸铜和6g硫酸钾,稍摇匀后瓶口放一小漏斗,加入20mL浓硫酸,将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上,使用万用电炉,在通风橱中加热消化,开始时用低温加热,待内容物全部炭化,泡沫停止后,再升高温度保持微沸,消化至液体呈蓝绿色澄清透明后,继续加热,取下放冷,小心加20mL水,放冷后,无损地转移到100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀备用,即为消化液。 试剂空白实验:取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸,按以上同样方法进行消化,冷却,加水定容至100mL,得试剂空白消化液。 2、定氮装置的检查与洗涤

蛋白质含量测定方法汇总

实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多,目前常用的有染料法,双缩脲(Biuret)法,酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1.掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2.了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合,此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色,吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势,因为它操作简单,反应时间短,染料-蛋白质颜色稳定,抗干扰性强。本法的缺点是:对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质,有一定误差,因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的,故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管;试管;721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液:配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液:称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml,再加入85%的浓磷酸100ml,用水稀释至1000ml,混匀备用。

[操作步骤] 1.标准曲线的绘制: 按上表分别向各支试管内加入各种试剂,充分混匀,5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值(A)。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2.样品测定: 取1ml样品溶液(约含25~250微克蛋白质),加入染料溶液5ml混匀,5min后测定其595nm吸光度值,对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中,双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2),或与此相似的基团[如—CH2-NH2,—CS-NH2,—C(NH)NH2]的任何化合物,无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连,均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—),可发生双缩脲反应,且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量

凯氏定氮法测定蛋白质的原理及其消化

凯氏定氮法测定蛋白质的原理及其消化、蒸馏 以凯氏定氮法测定氮含量换算蛋白质的方法,是国际上通用的标准方法,操作简单,测定结果重复性和重现性都很好,广泛用于各种食品、谷物、饲料等样品的蛋白质含量测定。此法又分为常量、半微量、微量法三种。国家标准规定为半微量凯氏定氮法。其测定原理相同,主要区别在于常量法的样品及试剂用量较微量法多。而微量法则具有实验规模小,实验费用低的优点。但微量法的准确度和精密度比常量法要差一些。凯氏定氮法整个测定过程分为消解、蒸馏、滴定三步。凯式定氮法包括消化炉和蒸馏装置,它们的结合能够让实验尽可能的简单。 要使测定结果有更好的正确度、准确度和精准度,认真细致掌握测定的每个步骤、各个细节及相应的注意事项,就显得尤为重要。 实验过程操作 1、主要试剂的配制 40%氢氧化钠:化学纯400g氢氧化钠溶于1000ml无氨蒸馏水中。 2%硼酸:分析纯20g硼酸溶于1000ml无氨蒸馏水中。

0.05mol/L盐酸:分析纯4.2ml盐酸定容至1000ml,通过无水碳酸钠标定。 混合指示剂:把溶解于95%乙醇的0.l%溴甲酚绿溶液5份和溶于95%乙醇的0.l% 甲基红溶液1份混合而成. 2、实验过程注意事项 (1)样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀,液体样品应振摇或搅拌均匀。 固体样品一般取样范围为0.20g~2.00g;半固体试样一般取样范围为 2.00g~5.00g;液体样品取样10.0mL~25.0mL(约相当氮30mg~40mg)。若检测液体样品,结果以g/100mL表示。 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀,液体样品应振摇或搅拌均匀。 (2)样品放入定氮瓶内时,不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下,以免被检样消化不完全,结果偏低,或者用滤纸包裹好一起投入消化,滤纸影响通过空白扣除。消化时应注意旋转凯氏烧瓶,将附在瓶壁上的碳粒冲下,对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明,可将凯氏烧瓶中溶液冷却,加入数滴过氧化氢后,再继续加热消化至完全。 (3)消化时,不要用强火。若样品含糖高或含脂及较多时,注意控制加热温度,以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶,造成样品

土壤中全氮的测定实验报告

土壤中全氮的测定 环境工程李婷婷2110921109 一、实验目的 1、学习掌握土壤中全氮的测定原理和方法; 2、了解凯氏定氮仪的使用方法。 二、实验原理 测定土壤全氮的方法主要有干烧法和湿浇法。 样品用浓硫酸高温消煮时,各种含氮有机化合物经过复杂的高温分解反应转化为铵态氮(硫酸铵),这个复杂的反应,总称为开氏反应。 开氏法分为样品的消煮和消煮液中铵态氮的定量两个步骤。 土样经浓硫酸消煮,各种含氮有机化合物转化为铵态氮,用氢氧化钠碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收,以甲基红-溴甲酚绿混合指示剂,用盐酸标准溶液滴定,求出土壤全氮含量 凯氏法测定全氮步骤: 有机N 加速剂+浓H2SO4 OH- H3BO3 H+ (+无机N)NH4+ NH3 NH4++H2BO3- H3BO3 消煮液中NH4+的定量(蒸馏) 开氏反应的速度不大,通常需要利用加速剂来加速消煮过程。加速剂的成分,按其效用的不同,可分为增温剂、催化剂和氧化剂三类。 增温剂是硫酸钾或无水硫酸钠;催化剂主要有Hg、HgO、CuSO4、Se 等;常用的氧化剂有K2Cr2O7、KMnO4、HclO4和H2O2 等。 凯氏定氮仪可完成对消解样品的全自动加碱、蒸馏和滴定过程。消解完的样品上机后和碱生成氨,氨气和水蒸气一起经冷凝管冷凝后,被收集在加入硼酸吸收液的接收瓶中,而后自动进行滴定、显示、记录盐酸消耗量,计算机根据公式计算含氮量,并打印出结果。 三、实验过程 1.称量样品。在电子天平上称量土样约0.5g。 2.消解。土样中先加入5mL浓硫酸,煮沸,然后冷却,再加入1mL高氯酸,继续煮 沸至土样呈灰白色。 3.过滤,定容。将土样冷却后,用定量滤纸过滤到100mL容量瓶中,定容。 4.调节仪器,测量。调整仪器,设置好参数。取样品20mL放到消煮管中,进行测量 (测一个空白值)。 四、实验结果与分析 结果计算:N%=1.401×M(V-V0)/W 其中:M:盐酸标准浓度,mol/L; V:滴定样品盐酸的消耗量,mL;

几种蛋白质含量测定方法的比较

几种蛋白质含量测定方法的比较 【摘要】:蛋白质含量测定方法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常 用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford),Folin —酚试剂法(Lowry)杜马斯燃烧法。其中Bradford 法灵敏度颇高,比紫外吸收法灵敏10~20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。过去Folin—酚试剂法法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以在本公司订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。测定农产品中全氮的凯氏定氮法在许多国家已被杜马斯然烧定氮法所代替,杜马斯燃烧法是基于在高温下(大约 900 ℃),通过控制进氧量、氧化消解样品的原理而进行氮测定的。这6种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,每种方法都有其优缺点,在选择方法时应考虑:⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度;⑵蛋白质的性质;⑶溶液中存在的干扰物质;⑷测定所要花费的时间 【关键词】:凯氏定氮法双缩脲法紫外吸收法考马斯亮蓝法 Folin—酚试剂法杜马斯燃烧法 一、凯氏定氮法 1.1原理 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 1.2特点 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一,被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL;硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素;用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min;与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。 凯氏定氮法适用范围广泛,测定结果准确,重现性好,但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品,节省时间,提高了工作效率,适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。 二、双缩脲法(Biuret ) 2.1原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1 个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。

凯氏定氮法测定蛋白质含量

凯氏定氮法测定粗纤维素中蛋白质含量 1、原理 蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,蛋白质含量。 2、试剂 所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。 2.1 硫酸铜。 2.2 硫酸钾。 2.3 硫酸。 2.4 2%硼酸溶液。 2.5 混合指示液:1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 2.6 30%氢氧化钠溶液。 2.7 0.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。 3、仪器 安全管导管汽水分离管样品入口塞子冷凝管吸收瓶隔热液套反应管蒸汽发生瓶 如图1所示:

图1 3、操作步骤 3.1样品处理:精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品(约相当氮30-40mg),移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中,加入0.2g硫酸铜,6g硫酸钾及20毫升硫酸,稍摇匀后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上,小火加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,再继续加热0.5小时。取下放冷,小心加20ml水,放冷后,移入100ml 容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。但是此法比较危险,不易在实验室演示,现在大多数实验室有消煮仪一次可以进行多个(一次可以消煮16个样品)样品处理,并有通风橱进行通风,温度可以自己设定,更加安全和可操作性,因此逐步成为主要的凯氏定氮法的首选处理方法。 一般消解温度都设在240度及240度以上,如果想快速消解可以适当提高温度甚至可以用最大温度进行消解。 3.2、按图装好定氮装置,于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入数粒玻璃珠以防暴沸,用调压器控制,加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 3.3、向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴,并使冷凝管的下端插入液面下,吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室,并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内,塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯,提起玻璃塞使其缓慢流入反应室,不能立即将玻璃盖塞紧,这样易使玻璃塞粘在进样口,应先用蒸馏水冲洗然后再盖,并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹,开始蒸馏,蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内,蒸馏5min。移动接收瓶,使冷凝管下端离开液皿,再蒸馏1min,然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶,以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。 同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。 4、计算 X =((V1-V2)*N*0.014)/( m*(10/100)) *F*100%

土壤全氮的测定凯氏定氮法

土壤学实验讲义 (修订版) 吴彩霞王静李旭东 2012年10月

目录 实验一、土壤分析样品采集与制备 实验二、土壤全氮的测定—凯氏定氮法实验三、土壤速效钾的测定 实验四、土壤有效磷的测定 实验五、土壤有机质的测定 实验六、土壤酸度的测定

实验一土壤分析样品采集与制备 一、实验目的和说明 为开展土壤科学实验,合理用土和改土,除了野外调查和鉴定土壤基础性状外,还须进行必要的室内常规分析测定。而要获得可靠的科学分析数据,必须从正确地进行土壤样品(简称土样)的采集和制备做起。一般土样分析误差来自采样、分样和分析三个方面,而采样误差往往大于分析误差,如果采样缺乏代表性即使室内分析人员的测定技术如何熟练和任何高度精密的分析仪器,测定数据相当准确,也难于如实反映客观实际情况。故土样采集和制备是一项十分细致而重要的工作。 二、实验方法步骤 (一)土样采集 分析某一土壤或土层,只能抽取其中有代表性的少部份土壤,这就是土样。采样的基本要求是使土样具有代表性,即能代表所研究的土壤总体。根据不同的研究目的,可有不同的采样方法。 1.土壤剖面样品 土壤剖面样品是为研究土壤的基本理化性质和发生分类。应按土壤类型,选择有代表性的地点挖掘剖面,根据土壤发生层次由下而上的采集土样,一般在各层的典型部位采集厚约l0厘米的土壤,但耕作层必须要全层柱状连续采样,每层采一公斤;放入干净的布袋或塑料袋内,袋内外均应附有标签,标签上注明采样地点、剖面号码、土层和深度。 图1 土壤剖面坑示意图

2. 土壤混合样品 混合土样多用于耕层土壤的化学分析,一般根据不同的土壤类型和土壤肥力状况,按地块分别采集混合土样。一般要求是: (1)采样点应避免田边、路旁、沟侧、粪底盘以及一些特殊的地形部位。 (2)采样面积一般在20—50亩的地块采集一个混合样可根据实际情况酌情增加样品数。 (3)采样深度依不同分析要求而定,一般土壤表层取0-10cm,取样点不少于5点。可用土钻或铁铲取样,特殊的微量元素分析,如铁元素需改用竹片或塑料工具取样,以防污染。 (4)每点取样深度和数量应相当,集中放入一土袋中,最后充分混匀碾碎,用四分法取对角二组,其余淘汰掉。取样数量约1公斤左右为宜。 (5)采样线路通常采用对角线、棋盘式和蛇形取样法。 (6)装好袋后,栓好内外标签。标签上注明采样地点、深度、采集人和日期,带回室内风干处理 (二)土壤样品制备 样品制备过程中的要求: (1)样品处理过程中不能发生任何物理和化学变化,以免造成分析误差。 (2)样品要均一化,使测定结果能代表整个样品和田间状态。 (3)样品制备过程包括:风干一分选一去杂一磨碎一过筛—混匀一装瓶一保存一登记。 风干一将取回的土样放在通风、干燥和无阳光直射的地方,或摊放在油布、牛皮纸、塑料布上,尽可能铺平并把大土块捏碎,以便风干快些。 分选一若取的土样太多,可在土样均匀摊开后,用“四分法”去掉一部分,留下1000克左右供分析用。 去杂、磨细和过筛一将风干后土样先用台称称出总重量,然后将土样倒在橡皮垫上,碾碎土块,并尽可能挑出样品中的石砾、新生体、侵入体、植物根等杂质,分别放入表面皿或其它容器中;将土样铺平,用木棒轻轻辗压,将辗碎的土壤用带有筛底和筛盖的0.25mm 筛孔的土筛过筛,并盖好盖、防止细土飞扬。不能筛过的部分,再行去杂,余下的土壤铺开再次碾压过筛,直至所有的土壤全部过筛,只剩下石砾为止。(样品通过多大筛孔、应依不同分析要求而定)。 混匀装瓶一将筛过的土壤全部倒在干净的纸上,充分混匀后装入500~1000ml磨口瓶中保存。每个样品瓶上应贴两个标签,大标签贴在瓶盖上。书写标签用HB铅笔或圆珠笔填

凯氏定氮法

凯氏定氮法 中文名称:凯氏定氮法 英文名称:Kjeldahl determination 定义:测定化合物或混合物中总氮量的一 种方法。即在有催化剂的条件下,用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成 无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收,再以标准碱滴定,就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定,可由其氮量计算蛋白质含量,故此法是经典的蛋白质定量方法。

凯氏定氮法 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下,用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收,再以标准碱滴定,就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定,可由其氮量计算蛋白质含量,故此法是经典的蛋白质定量方法。 原理

蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,蛋白质含量。含氮量*6.25=蛋白含量 .有机物中的胺根在强热和CuSO4,浓H2SO4作用下,硝化生成(NH4)2SO4 凯氏定氮法 反应式为: 2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4(其中CuSO4做催化剂)

2.在凯氏定氮器中与碱作用,通过蒸馏释放出NH3,收集于H3BO3溶液中反应式为: (NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O 3. 用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定,根据HCI消耗的量计算出氮的含量,然后乘以相应的换算因子,既得蛋白质的含量 反应式为: (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3 试剂 所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。 2.1 硫酸铜。 2.2 硫酸钾。 2.3 硫酸。 2.4 2%硼酸溶液。

蛋白质测定实验报告

蛋白质测定方法——化学报告

蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合,形成 蛋白质一铜复合 物,此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原,产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法,下面以实验的形式进行详细阐述:

1 材料与方法 1.1 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 1.2 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如, 生化制备中常用的(NH4)2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。 此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。取待测样品制成蛋白浓度大约在0. 1~1. 0mgPmL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定,取平均值。 (3)双缩脲法测定蛋白质含量

凯氏氮的测定方法

凯氏氮的测定方法 (1)、原理 当样品与浓硫酸和硫酸钾的混合物(沸点315~370℃)在催化剂硫酸铜或硫酸汞存在时,一起加热,其中的有机氮和氨态氮转化为硫酸铵。然后加入NaOH溶液使之成碱性,蒸镏使氨释放出来并以硼酸吸收,然后用硫酸滴定硼酸铵。 此法测得的总氮包括了有机氮和原来即以氨态存在的氮,但不包括硝酸盐或亚硝酸盐形式存在的氮,有机氮中的某些化合物如含氮的杂环化合物、吡啶、叠氮化合物、偶氮化合物、硝基和亚硝基化合物等也未包括在内。以此法测定的总氮称之为凯氏(Kjeldagl)氮,即TKN。测定同一水样中氨态氮含量后,总凯氏氮和氨态氮的差值即为有机氮。 (2)、药品与仪器 ①、浓硫酸,密度1.84g/cm3;②、50% NaOH溶液;③、10% CuSO4溶液;④、4%硼酸溶液; ⑤、无水硫酸钾或无水硫酸钠; ⑥、0.020mol/L(1/2H2SO4标准溶液:吸取分析纯浓硫酸2.80ml,溶于1000ml蒸镏水中,得到约0.10mol/L(1/2H2SO4)溶液,用碳酸钠标定。然后从中吸取200ml,用蒸镏水稀释至1000ml 备用。⑦、混合指示剂:取0.05g甲基红和0.10g溴甲酚绿溶于100ml乙醇中; ⑧、1%酚酞的乙醇溶液;⑨、4%Na2S。9H2O溶液; ⑩、蒸镏水:将普通蒸镏水酸化后加入KMnO4进行蒸镏,并重复蒸镏一次,以使其中不含有任何铵盐或氨。本试验所用蒸镏水均应经过这样的处理; ⑩、浮石:在蒸镏水中煮沸后干燥备用;⑩、600瓦可调温电炉两台;⑩、凯氏烧瓶及凯氏蒸镏装置 (3)、操作步骤 ①消化: 准确量取一定体积(以含氮0.5~10mg为宜)的废水水样置于凯氏烧瓶,加入10ml浓硫酸、5克硫酸钾或硫酸钠、1ml硫酸铜溶液,并放入几块沸石,将凯氏烧瓶以45度的角度固定于通风橱内加热煮沸,烧瓶内将产生白烟。继续煮沸,烧瓶中颜色逐渐变黑,直至溶液完全透明无色或浅绿色。再继续煮沸20分钟。 ②蒸镏: 将凯氏烧瓶冷却,以约150ml蒸镏水冲洗烧瓶壁,加入2.5ml硫化钠溶液和3~5滴酚酞,然后缓慢沿壁加入50mlNaOH溶液尽量使其不与烧瓶内液体混合。立刻将烧瓶按图所示安装到蒸镏装置上去(事先安装好含50ml硼酸的吸收瓶),小心转动烧瓶使烧瓶内的两层液体混合并开始加热。煮沸20~30分钟或在不使用蒸气发生器时蒸发至烧瓶内液体体积减少至原体积约约1/3时,停止蒸镏。 ③滴定: 卸下吸收瓶,加入几滴混合指示剂,以0.02mol/L(1/2H2SO4)滴定至溶液变为紫色。 ④空白试验: 用同样体积蒸镏水代替废水水样,按上述步骤作空白试验。 (4)、计算 总氮=(V1-V0)* C *14000 / V (mmol/L) V1  ̄ ̄滴定样品消耗的标准硫酸溶液的体积,ml; V0  ̄ ̄滴定空白试验消耗的标准硫酸溶液的体积,ml; C  ̄ ̄硫酸标准溶液的准确浓度,mol/L; 14000 ̄ ̄每摩尔氮的质量(毫克)数; V  ̄ ̄样品水样的取样体积,ml。

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