药用植物内生真菌多样性及其活性成分的潜在应用价值
几种药用植物内生真菌抗真菌活性的初步研究
几种药用植物内生真菌抗真菌活性的初步研究 #64#微生物学通报 2001年28(6) 参考文献 [1]MasatoshiGOTO,EijiKUWANO,WerasitKANLAYAKRIT,ShinsakuHAYASHIDA,BiosiBiotechB iochem,1995,59: 16~20. [2]MASTOSHGOTO,TSUYOSHISEMIMARU,KENSUKEFURUKAWA,SHINSAKUHAYASHIDA,APPLENVIRONM I- CROBIOL,1994,60:3926~3930. [3]KeijiKAINUMA,HiroshiISHIGAMI,ShoichiKOBAYASHI,JJpnSoc.Starchsci,1985,31:136 ~141. [4]ShinsakuHAYASHIDA,andPerfectoQ.FLOR,AgricBiolChem,1981,45:2675~2681. [5]Cheor-lHoKim,Suk-TaeKwon,HajimeTaniguchi,Dae- SilLee,BiochimicaetBiophysicaActa,1992,1122:243~ 250. [6]HiroshiMorita,KouheiMizuno,MayumiMatsunage,YusakiFujio,JApplGlycoci,1999,46 :15~21. [7]Jun-ichiABE,SusumuHIZUKURI,JJpnSocStarchSci,1988,35:p.43~47. [8]TomokoTAKAHASHI,KeikoKATO,YoshioIKEGAMI,MasachikaIRIE,JBiochem,1985,98:663-671. [9]KohsaiFukuda,YujiTeramoto,M.Goto,J.Sakamoto,S.Mitsuiki,Hayashida,BiosciBiot echBiochem,1992, 56:556~559.
植物内生菌的分离
植物内生菌的分离 钱昆121140041 一、实验目的 1、掌握对植物内生菌的分离处理方法。 2、熟练掌握对细菌、真菌的染色观察技术。 3、了解微生物分子实验的基本操作流程。 二、实验原理 在植物的生态环境中，存在着各种各样的微生物,它们有的附着于植物的表面，有的则生活于植物体内。对于附着于植物表面和根际的微生物已有很多研究，而对于植物体内微生物的研究却刚刚起步。但有资料显示, 一些植物内生微生物与宿主发生关系时，可明显增强宿主的抗病性，提高植物的生产力。因此，合理利用植物的内生微生物具有重要的理论意义和实用价值。植物内生菌作为微生物研究领域之一，近年来一直备受关注。 内生菌概念在1866年首先由Bary提出的，指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部的微生物（主要为真菌和细菌）。其后的很长时间内，内生菌研究进展缓慢。直到1993 年，美国蒙大拿州立大学Strobel等从短叶红豆杉的韧皮部位分离到一株产新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌，从而启发人们可从植物内生菌寻找与植物产生的相同或相似的化合物，由此促进了植物内生菌的研究。植物内生菌为植物组织内的正常菌群，包括植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌，广泛分布于各种陆生及水生的低等植物和高等植物中。 内生真菌是在宿主植物的茎和叶内生存并完成生活周期的真菌。这类真菌中，有许多种类很少形成孢子，或者在宿生植物上形成孢子（或者孢子果），不容易识别。真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。与病原菌不同，这些真菌对宿主植物几乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共生关系，或者是不太密切的共生关系。 对于现已分离得到的植物内生细菌，一般可分为专性内生细菌与兼性内生细菌，前者指至今只能在植物体内分离得到的细菌；后者指能在植物根际与土壤中分离得到，也能在植物体内分离得到的细菌，而且种类居多。根据内生细菌对宿主植物生长发育的影响可以将其分成三类：第一类对植物的作用是中性的，即尚未发现它们的内生定殖对宿主植物生长与繁殖有影响；第二类对植物生长发育有促进作用，如能提高宿主植物抗病、抗逆能力，或能通过固氮与分泌激素促进植物生长发育等；第三类对植物生长具有负面影响，在特别条件下接种到原宿主植物或另外的宿主植物会诱发植物病害。但需要注意的是，同种细菌定殖于不同宿主植物可能对宿主植物产生不同的影响。 除根瘤菌外，还有放线菌侵入多种被子植物宿主，形成根瘤的共生固氮体系。早在十九世纪后期，人们就发现了这类非豆科的根瘤，并发现根瘤内有生微生物，1881年布隆科斯特将它称为Frankia，但当时并不知道它是什么微生物。确定内
真菌多样性研究现状综述
内生真菌多样性研究现状综述 魏洁 摘要：随着研究的发现，内生真菌的在自然界的作用被越来越重要。本文章主要分析了内生真菌生物多样性的现状、内生真菌多样性检测技术和方法及其影响因素分析。从植物内生真菌物种多样性与产生生物活性物质多样性等方面总结近年最新的研究进展, 提出了现阶段植物内生真菌及活性物质研究的存在的问题及其未来发展方向。 关键词：内生真菌；多样性；研究技术；影响因素；展望 Research of endophytic fungi diversity Abstract:With the findings of the study, endophytic fungi are an increasingly important role in nature. This article mainly analyzes the status quo of endophytic fungi biodiversity, the detection techniques and methods of endophytic fungi diversity and its influencing factors. From the latest Endophytic fungal species diversity and produce biologically active substances diversity summarizes research progress in recent years, we dish the stage of plant endophytic fungi and active substances research problems and their future development direction. Keywords：endophytic fungi; diversity; research techniques; influencing factors; prospect 1.引言 真菌是吸收异养型的真核生物，种类繁多的植物内生真菌是一大类尚未被充分认识的真菌。随着近二十年来的研究的发现内生真菌具有重要的生态学意义和经济意义，其物种多样性也是非常丰富的。内生真菌（内生菌）(Fungal endophyte)[1]是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部, 而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。在植物体特殊环境中，内生真菌与寄主之间协同进化，在生活演变过程中形成一种互利共生的关系。内生真菌可以促进植物的生长发育[2], 提高宿主植物的抗逆性[3]。近年来,由于内生真菌的次生代谢物在病虫害的生物防治、医药工业上的用途和范围逐渐增大,因此有关内生真菌的研究逐渐受到重视[4]。内生真菌由于其物种丰富,数量庞大,而且与其它生物之间具有紧密的生态关系,使其成为天然活性物质的丰富来源,因而引起人们的广泛关注,成为目前国内外研究的热点之一. 2研究现状 近年来对内生菌的研究逐渐进入了一个新的阶段，内生真菌的研究日益受到了全球性的广泛关注，在其侵入机制每年有数百篇论文报道新发现的内生菌。从内生真菌寻找活性成分日益成为研究的热点。 2.1 植物内生真菌的生物多样性
药用真菌金耳的rDNAITS序列分析与鉴别
天然产物研究与开发N at Prod R es D ev 2007,19:2162220 文章编号:100126880(2007)022******* 收稿日期:2006206219 接受日期:20062082283通讯作者Tel:86221262232019;E 2mail:wiqn@bi o .ecnu .edu .cn 药用真菌金耳的r DNA I TS 序列分析与鉴别 刘春卉,瞿伟菁3 ,张 雯,焦 磊 华东师范大学生命科学学院,上海200062 摘 要:研究了两个居群的金耳Tre m ella aurantialba 以及近似品的r DNA I TS 区碱基全序列的特征及其差异,首次报道了金耳的I TS 和5.8Sr DNA 完整序列,序列总长度为467～468,长度变异较少。聚类分析表明两个居群金耳亲缘关系非常密切,金耳药材和近似品金黄银耳形成一个稳定的独立分支,近似品黄金银耳形成另一个分支。I TS 序列的差异为金耳的鉴别提供了可靠的分子标记,为金耳菌类药材基原入药建立了遗传基础。关键词:金耳;核糖体DNA;I TS 序列;居群;近似品;DNA 分子鉴别中图分类号:R28415 文献标识码:A D NA M olecul ar I den ti f i ca ti on of M ed i c i n a l M ushroo m Trem ella au ran tia lba Ba sed on I TS Sequences L I U Chun 2hui,QU W ei 2jing 3 ,Z HANG W en,J I A O Lei School of L ife Science,East China N or m al U niversity,Shanghai 200062,China Abstract:The r DNA I TS sequences fr om t w o populati ons in China were studied and three anal og s pecies were discussed t ogether .The whole sequences of r DNA I TS regi ons (including I TS 21,5.8S and I TS 22)of T re m ella aurantialba were re 2ported first ti m e .The results showed that little difference in length bet w een the sequences was f ound and the length was 467bp and 468bp,res pectively .T re m ella aurantialba and T re m ella aurantia f or med a separate stable branch in the t opol 2ogy trees,while T re m ella m esenterica clustered on another clade .The relati onshi p bet w een t w o populati ons of Tre m ella aurantialba in Yunnan and Shanxi p r ovinces and Tre m ella aurantia is cl osely related,and they can rep lace each other as the sa me medicine according t o the r DNA I TS .The character of I TS sequences can be used f or p r oviding the molecular markers f or identifying Tre m ella aurantialba and exp l oring its genetic basis of fungal s ources . Key words:Tre m ella aurantialba ;r DNA;I TS sequence;populati on;anal og s pecies;DNA molecular identificati on 金耳来源于担子菌纲银耳科银耳属植物金耳 (Tre m ella aurantia lba )的金黄色脑状子实体,为珍稀濒危真菌,民间对其药用历史悠久,《本草纲目》和陶弘景《名医别录》有记载,《中国药用真菌》述其主 治肺热、痰多、感冒咳嗽、气喘、高血压等症[124] 。同属还有近似种金黄银耳T re m ella aurantia Sch w:Fr 、脑状银耳Tre m ella encephala Pers .、黄金银耳(与橙黄银耳同物异名)Tre m ella m esenterica Retz .:Fr .。现代药理研究发现金耳富含水溶性多糖,连续服用金耳子实体能化痰止咳并对四氧嘧啶所致糖尿病大鼠高血糖模型具有显著的降糖作用[5] ,金黄银耳子实体多糖也能明显降低正常小鼠及链脲霉素致高血 糖小鼠血糖和血浆胆固醇水平[6,7] ,黄金银耳子实 体有较强的平喘作用[8] ,其多糖也有降低大鼠高血 糖作用的报道[9] 。 由于金耳颜色和外形与几个近似种极为相似且易混淆,金耳种名一直被误定为Tre m ella m esenterica [10,11] ,原产中国的金耳药材主流资源直至二十世纪九十年代才得以确认并正式定名T re m ella aurantial 2 ba Bandoni et Zang [12,13] 。鉴于同属的近似品种较多,依据单纯形态学方法和化学成分难以鉴别,同时近似种已有相似药理作用的报道,为防止品种源头混乱,保护种质资源,解析其它近似种的种质差异及可替代性,因此对金耳药材基源及其遗传基础进行准确界定,不仅有助于规范资源的生产和保存,也可丰富生药资源库和数据库的基础信息。通过检索Gen Bank 和E MBL 数据库,发现近似种金黄银耳Tre m ella aurantia 、脑状银耳Tre m ella encephala 、黄金银耳Tre m ella m esen terica 的r DNA I TS (核糖体内转录间隔区)序列均已注册,而金耳Tre m ella aurantial 2
药用植物内生真菌产次生代谢产物的研究进展
药用植物内生真菌产次生代谢产物的研究进展 徐范范 △ (综述),金 波,丁志山 ※ (审校) (浙江中医药大学,杭州310053) 中图分类号:R732354 文献标识码:A 文章编号:100622084(2010)1722667203 基金项目:浙江省自然科学基金(Y2080580) 摘要:植物内生真菌是一大类未被充分研究过的新的微生物资源,具有潜在的应用前景。随着对药用植物内生真菌研究的深入,从药用植物内生真菌中寻找新的生物活性成分已成为研究热点。总结近年药用植物内生真菌产生的抗肿瘤、抗菌等活性次生代谢产物最新的研究进展,内生真菌活性成分已成为发现新颖结构化合物及新药物的重要资源。 关键词:药用植物;内生真菌;次生代谢产物 Recen t Stud i es on the Secondary M et abolites Produced by M ed i c i n a l Pl an t Endophyti c Fung i XU Fan 2fan,J IN B o,D IN G Zhi 2shan .(Zhejiang Chinese M edical U niversity,Hangzhou 310053,China )Abstract:Plant endophytic fungi are a large class of ne w m icr obial res ources not fully studied,with po 2tential app licati ons .W ith the devel opment of researches in the field of endophytic fungi of medicinal p lants,the research on novel original bi oactive compounds fr om endophytic fungi has become a ne w hots pot .This ar 2ticle revie wed the recent p r ogress on studying anti 2tumor and anti 2bacterial activity of secondary metabolites p r oduced medicinal p lant endophyte .The active ingredient of endophytic fungi has become an i m portant s ource which found the ne w structure of compounds and new drugs .Key words:Medicinal p lants;Endophytic fungi;Secondary metabolites 近年来,从天然产物中筛选生物活性成分成为研究创制新药的有效途径之一。植物历来是筛选天然药物最主要的原料,但药用植物的过度使用,致使许多药用植物濒临灭绝。为解决资源问题,近年来药用植物新资源研究的一个热点集中在药用植物内生菌上。植物内生真菌是指生活史中的某一段生活在健康植物组织内部,并不引起宿主植物出现明显病害症状的一类真菌,它是生活在植物组织内的一类微生物,是植物微生态系统中的天然组成成分。内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中,并与寄主协同进化,根据内共生理论,内生真菌可能产生与宿主相同或相似的具有生物活性的次生代谢产物。研究发现,内生真菌能产生许多活性次级代谢产物,从而能够增强植物的抗逆性,表现在非生物胁迫(如抗高温、抗干旱等)和生物胁迫(如阻抑昆虫和食草动物的采食、抵抗病虫害等)方面,这些活性次级代谢产物具有抗菌、抗肿瘤等生物活性。1993年,美国蒙大拿州立大学的Str obel 小组在短叶红豆杉内生真菌Taxomyces andreanae 中发现紫杉醇[1] ,国内外掀起对药用植物和濒危植物内生真菌的研究热潮。研究热点主要集中在新的抗肿瘤、抗菌等活性化合物的发现,植物内生真菌已成为发现新天然活性物质的重要资源。现对近年来药用植物内生真菌产次生代谢产物的研究进展予以综述。1 具抗肿瘤活性的化合物1.1 产紫杉醇及其衍生物 的化合物 紫杉醇是存在于 各种紫杉属植物树皮和树叶 中的萜类化合物,被当今世界上认为是广谱、活性最强的抗癌药物。1971年美国学者W ani 从短叶红豆杉的树皮中提取出了具有独特的抑制微管解聚和稳定微管作用的紫杉醇,开辟了一个抗 肿瘤药物研制的新时代。2006年,田仁鹏等[2] 从生长在湖北的南方红豆杉树皮中韧皮部分离出一株能产紫杉醇的菌株TPF6,其发酵液中紫杉醇含量为 84.5μg/L 。2008年,孙端方等[3] 从罗汉松中分离到了1株产紫杉醇内生真菌EPTP 21,对Ver o 细胞表现 出明显的致细胞凋亡作用。赵凯等[4] 从东北红豆杉中分离筛选到1株能够产生紫杉醇菌株HD181223,发现其紫杉醇产量为206.34μg/L,而且该菌株的发酵提取纯化产物对He La 细胞具有较强的抑制作用。产生紫杉醇的内生菌具有丰富的物种多样性。这些内生真菌既有新种,如安德紫杉菌;也有新记录种,如树状多节孢菌;更多的则是常见的真菌,如链格孢菌、头孢菌等。当前,对产紫杉醇内生菌的开发 利用研究正在进行之中,已在菌株生产、发酵条件、分子生物学等基础研究方面取得了较大的进步。1.2 产喜树碱及其衍生物的化合物 喜树碱(ca mp t othecine )是拓朴异构酶Ⅰ的专属性抑制剂,在临床上广泛应用于肝癌、胃癌、膀胱癌及白血病等的 治疗。闵长莉等[5]采用组织块法从喜树果实中分离 筛选得到13株纯化的内生菌株,经过摇瓶发酵培养后,采用薄层色谱法与高效液相色谱法对其菌丝体提取物进行分析,发现有1株菌株能够产生102羟基喜树碱,其102羟基喜树碱产量为677μg/L,并将该菌株命名为XK001。随后用同样的方法从树皮中分离纯化得到另一菌株XK002,其102羟基喜树碱产量 为410μg/L [6] 。 1.3 产鬼臼毒素及其衍生物的化合物 鬼臼毒素
分离植物内生真菌操作流程
分离植物内生真菌操作流程 1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4%84）、 酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌30min。 （1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植物采取三株标本，要带有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写在 小纸条上放在装标本的袋子里，采下来的标本与写有名字的纸条一同拍照，样本上有脏东西时，请用纸轻轻擦掉，若不清楚植物名字，请将整棵植物 拍照留用于鉴定，并做好相关记录。 （2）制作PDA固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大概倒15个板，待其凝固后用于接种。 2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。 3.取样： （1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位进行取样，剪取5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较 粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取 样本，样本不要剪的太大或太小。 （2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位接种两块板，大板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个 接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数， 尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。 （3）若植物标本有剩余，且是没有洗过的，重新装好，放到冰箱里，备用，洗过的扔掉。 （4）每种植物标本所剪的样本放在一个50ml的离心管中，放在试管架上，并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。 4.表面灭菌：在无菌操作台中进行 （1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器开始计时1min,每10秒钟晃动离心管几次，使其充分灭菌。 （2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管
影响土壤真菌多样性的土壤因素及土壤真菌研究进展
土壤真菌多样性研究及真菌分类方法研究进展 陈秋君 201231142005 经济管理学院12级20班 摘要：简述了土壤真菌的多样性以及影响土壤真菌多样性的因子，介绍了土壤真菌分类方法近年来的研究进展。 关键词：土壤真菌多样性影响因子研究方法 0 引言 真菌是一类种类繁多、分布广泛的真核微生物. 真菌多样性在维持生物圈生态平衡和为人类提供大量未开发的生物资源方面起到了重要作用. 真菌构成了土壤的大部分微生物生物量, 具有分解有机质, 为植物提供养分的功能, 是生态系统健康的指示物. 在农业中, 真菌既降低粮食产量, 又为控制植物病虫害和其他真菌生物防治提供一条有效途径. 对根际真菌结构和多样性的了解将有助于更好的了解真菌对病原菌的抑制功能 . 在林业中, 丛枝真菌与植物相互共生作用, 为植物提供养份, 使植物能耐受干旱或贫养的条件, 同时也提高了植物的多样性 . 在草地生态系统中, 分解者生物量总体中78% ~ 90%是真菌 . 20 世纪60 年代以来, 微生物生态学研究发展较快, 推动了土壤真菌学研究的发展, 人们对探究土壤中真菌存在的形式、数量、活性以及它们在物质转化中的重要作用等方面充满兴趣。70 年代以后人们更进一步认识到土壤真菌是微生物区系的主要成分, 并具有较高的生物活性。80 年代至今, 由于逐渐采用新的研究技术和手段, 土壤真菌研究的发展进入了一个新时期。 虽然真菌在陆地生态系统中有很重要的作用, 但是人们对自然界的真菌多样性了解还很少. 受到全球气候变化、环境污染和人类活动等诸多因素的影响, 自然环境中真菌的种类和数量、分布都发生了显著的变化. 土壤真菌研究越来越受到人们的重视。 1 土壤真菌多样性 1.1 物种多样性 通常真菌被描述为具有真核, 能产生孢子、无叶绿素的有机体, 以吸收方式获得营养, 普遍以有性和无性两种方式进行繁殖, 菌丝通常是由丝状、分枝的枝细胞构成, 并典型地被细胞壁所包裹. 真正意义的真菌包括四大类群, 壶菌门、接合菌门、子囊菌门、担子菌门. 已知的壶菌约100 属, 1 000种. 最新研究估计全世界的真菌种类约有150 万, 但至今已被正式描述的只有5%~ 10%[ 18~ 20] , 绝大多数是未知的. 其原因一方面在于对真菌分离培养技术的依赖, 不能从少量材料中分离出目标生物, 缺少对所有真菌群落生物都适应的培养基和培养条件; 另一方面在于对真菌生活环境缺乏全面了解, 不能准确地评价不同地域( 特别是热带雨林地区) 真菌群落的结构组成. 1.2 生境多样性 真菌广泛分布在各种各样的土壤环境中, 包括农田、林地、草地、沼泽湿地、温泉热土、冻土层等. 由于不同环境因子的影响, 使土壤真菌在其生活环境中形成独特的群落种类、组成和分布规律. 例如在林地中外生菌根真菌的种类、数量较多, 而在草地生态系统中丛枝菌根真菌的分布比较广泛. 在一些极端环境, 如南北极的冻土层中则分布着丰富的子囊菌门生物, 而在温泉热土中则与其他土壤例如林地的优势种类几乎完全不同. 一些真菌的生活环境仍然没被完全的报道,真菌能否像细菌一样生活在一些极端环境中? 这有待我们进一步去发现新环境中新的种类, 并探索其生理机制. 1.3 功能多样性 真菌在土壤生态系统中发挥着多种多样的功能, 包括降解纤维素、半纤维素、木质素、胶质、还原氮、溶解磷、螯合金属离子、产生青霉素等一些抗生素等.功能基因多样性又使我们对真菌功能多样性有了更进
药用真菌金耳的rDNAITS序列分析与鉴别_刘春卉
天然产物研究与开发Na t Prod R es Dev 2007,19:216-220 文章编号:1001-6880(2007)02-0216-05 收稿日期:2006-06-19 接受日期:2006-08-28 *通讯作者Te:l 86-21-62232019;E-m ai:l w i qn@b i o https://www.360docs.net/doc/c37265128.html, .cn 药用真菌金耳的r DNA I TS 序列分析与鉴别 刘春卉,瞿伟菁* ,张 雯,焦 磊 华东师范大学生命科学学院,上海200062 摘 要:研究了两个居群的金耳T re mell a aurantialba 以及近似品的rDNA I T S 区碱基全序列的特征及其差异,首次报道了金耳的ITS 和5.8Sr DNA 完整序列,序列总长度为467~468,长度变异较少。聚类分析表明两个居群金耳亲缘关系非常密切,金耳药材和近似品金黄银耳形成一个稳定的独立分支,近似品黄金银耳形成另一个分支。I T S 序列的差异为金耳的鉴别提供了可靠的分子标记,为金耳菌类药材基原入药建立了遗传基础。关键词:金耳;核糖体DNA;ITS 序列;居群;近似品;DNA 分子鉴别中图分类号:R 28415 文献标识码:A DNA M olecular Identification ofM edici nalM ushroo m Tre m ell a auranti alba Based on I TS Sequences LI U Chun-hu,i QU W e-i ji n g * ,Z HANG W en ,JI A O Lei School of L i fe Science ,East Ch i na N ormal University,Shanghai 200062,China Abstract :The r DNA I T S sequences from t w o popu l a ti ons in Ch i na w ere stud ied and t hree analog species were discussed togethe r .The w ho le sequences o f r DNA I T S reg i ons (i nc l ud i ng I T S -1,5.8S and I T S -2)of T re m ella aurantialba w ere re -ported first ti m e .The resu lts showed that little difference i n length be t w een t he sequences w as f ound and the length w as 467bp and 468bp ,respec ti ve l y .T re m ella aurantialba and T re m ella auranti a for m ed a sepa ra te stable branch i n the t opo-l ogy trees ,wh ile T re m ella m esenterica c l ustered on another c l ade .The relati onsh i p bet ween t w o populations o f T re m ella aurantialba i n Y unnan and Shanx i prov i nces and T re m ella auranti a is c l osely related ,and they can rep l ace each othe r as the sa m e medic i ne acco rding to the rDNA I T S .T he character of I T S sequences can be used for prov idi ng t he mo lecu lar m arkers for i dentify i ng T re m ella aurantialba and explor i ng its gene ti c bas i s of f unga l sources . K ey word s :T re m ella aurantialba ;r DNA;I T S sequence ;population ;ana l og spec i es ;DNA m o l ecular i dentificati on 金耳来源于担子菌纲银耳科银耳属植物金耳(Tre m ella auran tialba )的金黄色脑状子实体,为珍稀 濒危真菌,民间对其药用历史悠久,5本草纲目6和陶弘景5名医别录6有记载,5中国药用真菌6述其主治肺热、痰多、感冒咳嗽、气喘、高血压等症[1-4] 。同属还有近似种金黄银耳Tre m ella aurantia Schw :Fr 、脑状银耳T re m ell a ence phal a Pers .、黄金银耳(与橙黄银耳同物异名)Tre m ella m esenterica Retz .:Fr .。现代药理研究发现金耳富含水溶性多糖,连续服用金耳子实体能化痰止咳并对四氧嘧啶所致糖尿病大鼠高血糖模型具有显著的降糖作用[5] ,金黄银耳子 实体多糖也能明显降低正常小鼠及链脲霉素致高血 糖小鼠血糖和血浆胆固醇水平 [6,7] ,黄金银耳子实 体有较强的平喘作用 [8] ,其多糖也有降低大鼠高血 糖作用的报道[9] 。 由于金耳颜色和外形与几个近似种极为相似且易混淆,金耳种名一直被误定为Tre m ella m esen terica [10,11] ,原产中国的金耳药材主流资源直至二十世纪九十年代才得以确认并正式定名Tre m ella aurantial -ba B andoni et Zang [12,13] 。鉴于同属的近似品种较多,依据单纯形态学方法和化学成分难以鉴别,同时近似种已有相似药理作用的报道,为防止品种源头混乱,保护种质资源,解析其它近似种的种质差异及可替代性,因此对金耳药材基源及其遗传基础进行准确界定,不仅有助于规范资源的生产和保存,也可丰富生药资源库和数据库的基础信息。通过检索GenBank 和E MBL 数据库,发现近似种金黄银耳Tre m ella aurantia 、脑状银耳Tre m ella encephala 、黄金银耳Tre m ella m esenterica 的r DNA I TS (核糖体内转录间隔区)序列均已注册,而金耳T re m ella aurantial -
黄连内生真菌分离培养条件筛选
黄连内生真菌分离培养条件筛选 摘要：本试验采用压贴法通过对黄连根、茎、叶在不同次氯酸钠浓度及不同表面消毒时间的PDA培养基上的培养，选出黄连内生真菌的适宜培养条件；在获得适宜培养条件后重新培养所有部位，待其长菌后挑选菌落边缘菌丝再培养，如此反复，直到获得纯培养物为止。通过培养筛选在主根、须根、叶柄、叶片四个部位共获得了60多种菌株，并对分离出的菌株进行保种，为后续的菌株鉴定、菌株抗菌活性的测定做准备。 关键词：黄连，内生真菌，分离条件，培养条件 Endophyticfungi of Coptis separation and culture conditions screening Abstract: The test select the suitable cultivation condition of endophytic fungi ,using pressure stick method cultivate roots, stems and leaves on PDA medium at different concentrations of sodium hypochlorite and different surface sterilization time.Recultivate all parts after acquising suitable cultivation,then select ege colonies and recultivate when they grow fungi,then circulate the procedure,until get pure culture.By cultivating and selecting the roots,fibrous roots,petiole and leaves, more than 60 kinds of fungi are found ,and isolated strains are breed,which is preparation for subsequent strains of identification, the determination of strains antimicrobial activity. Keywords:Coptis, Endophytic fungi, Separation conditions, Culture conditions 黄连（Coptis chinensis Franch）是我国名贵中药材之一，含有大量的异喹啉类生物碱[1]（小蘖碱、黄连碱、甲基黄连碱、小蘖红碱、药根碱、阿魏酸等）。尤其是小蘖碱对人体病原细菌和皮肤真菌[2]具有广谱的抗菌活性，在医药中被广泛应用；同样，小蘖碱对许多植物病原真菌和细菌也有显著的抑制作用。Hirano, H.等用硫酸小蘖碱处理大麦种子减轻了大麦条纹花叶病毒病（BBMV）的发生[3]。 黄连的药理研究主要以小蘖碱和黄连解毒汤为重点，主要包括抗微生物作用（抗菌、抗病毒）[4]、镇静作用、止泻作用、健胃作用[5]、对心脏心率[6]和心律作用等[7]。黄连及复方
药用真菌应用
药用真菌的应用 唐为芷 摘要：药用真菌是指能治疗疾病，具有药用价值的一类真菌，即对人体有保健作用，对疾病有预防，抑制或治疗价值的真菌。其中有一些种类不仅具有医疗保健作用，还可以食用，被称为药食兼用真菌，广义都称为药用真菌。 关键词：治疗疾病，医疗保健，真菌 它们在生长、发育的代谢活动中，能于菌丝体、菌核或子实体内产生酶、蛋白质、脂肪酸、氨基酸、肽类、多糖(见碳水化合物)、生物碱、甾醇、萜类、苷类以及维生素等具有药理活性或对人体疾病有抑制或治疗作用的物质，临床上或是直接利用菌丝体、菌核或子实体，或是利用从菌体中分离出来的有效物质。 1 药用真菌的分类 药用真菌按其功效可分成滋补强壮类：如冬虫夏草、银耳、灵芝等；利尿渗湿类：如猪苓、粟白发等；止血活血消炎祛痛类：如麦角、肉球菌、木耳、安络小皮伞、马勃、朱红栓菌；止咳化痰类：如金耳、竹黄；安神类：如茯苓；驱虫类：如雷丸；祛风湿类：如空柄假牛肝菌、大红菇；平肝息风类:如蝉花、变绿红菇；降血压类:如草菇；调节机体代谢类：如蜜环菌、香菇、鸡油菌等。 2.药用真菌在我国传统医药中的应用 早在2500年前，我们的祖先岁还未能解释一些真菌治病的机理，但已知道用神曲治疗消化不良，饮食停滞等疾病，用霉菌治疗疮等疾病。随着抗生素的发现，才弄清某些霉菌对疮作用的机制，使过去一些实践医疗经验升华到现代医学的理论水平。在传统的中医中药中，应用最多的还是一些大型真菌，如灵芝，茯苓，猪苓等。 东汉末年编制的《神农本草经》共记载中药365种，其中就有茯苓，猪苓，雷丸等10余种真菌药物。南北朝时期陶弘景编辑的《本草经集注》与《名医别录》，以及唐宋年间编著的本草中，除记载有茯苓，雷丸，木耳等外，还增添了马勃，蝉花，银耳等，对真菌药物的记载也更加明确。明代著名的医药学家李时珍编著的《本草纲目》，载药1892种，据不完全统计，其中有药用真菌40余种，如香菇，马勃，茯苓，猪苓，雷丸，木耳等，并将历代本草中记载的真菌药物归类，大部分收载于菜部卷中，说明李时珍已注意到有些药用真菌同时具有食用的价值，并根据其功效作用进行了较详细的描述。在清初汪昂的《本草备要》中，最早论述了冬虫夏草的药用价值。这些被历代要药物学家推崇的大型真菌，并不断发展，成为我国医药宝库中不可分割的重要组成部分。 3.药用真菌在医疗保健中的应用价值。 3.1 药用真菌药理作用 药用真菌及其代谢产物具有多种生理活性，国内外学者进行过很多研究，其主要药理作用有：
植物内生真菌
植物内生真菌 一、内生真菌的概念 内生真菌是在宿主植物的茎和叶内生存并完成生活周期的真菌。这类真菌中，有许多种类很少形成孢子，或者在宿生植物上形成的孢子（或者孢子果）不容易识别。真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。与病原菌不同，这些真菌对宿主植物几乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共生关系，或者是不太密切的共生关系。 草本植物内生真菌侵染种子内部，播种后，真菌随着幼苗的生长和植株的发育成熟而生长，这些真菌没有吸器，出现在茎、叶、花序组织，而不出现在根内，这一点与菌根真菌不同。受侵染的植株在营养生长阶段不表现出被内生真菌侵染的特点，但是，当植物开花的时候，就可以观察到浸染的真菌。 与内生真菌容易混淆的一个概念是内生菌根，菌根是高等植物的根与真菌形成的共生联合体，内生苗根是菌根当中的一种类型，内生菌根的共同特征是根的表面不产生菌套，仅有稀疏的外生菌丝，菌丝在根部皮层组织的细胞间延伸，但不产生哈蒂氏网，菌丝体可侵入细胞内部，并形成不同形状的吸器，而宿主植物的根一般无形态及颜色的变化。故内生菌根用肉眼很难识别。 二、内生真菌的一般特征 内生真菌存在于根以外的植物组织细胞，可以用显微镜观察，也可以通过纯培养把它们分离出来进行研究。分离内生真菌时要对植物组织进行表面消毒，然后切成小片放在培养基上培养3～5天，内生真菌就生长在培养基上，可根据孢子和菌丝的特征，对它们进行分类鉴定。 可以按常规方法把内生真菌从多种植物上分离出来，已经发现的内生真菌包括许多子囊菌和半知菌、一些担子菌及少量的卵菌。主要的内生真菌包括药用Chloroscypha和Lophodermium（散斑壳属）中的一些种类以及Cryptoxline、Cryptosporriopsis（拟隐孢菌属）、Phomopsis（拟茎点霉属）和 Phyllosticta（叶点霉属）中的一些种类。其中许多可以从植物组织中偶然分离到。这类真菌的共生生活方式与其占主导地位的腐生生活方式来讲，似乎是次要的。比如说，担子菌中有许多种类生长在木头上或粪堆上，但有时也可在植物细胞内发现。 苔鲜植物、蕨类植物、裸子植物和被子植物中都发现有内生真菌。Petrini（1986）在对热带、温带和阿尔卑斯山地区的200多种植物调查之后发现，几乎所有生活的植物体内均有内生真菌的存在。在内生真菌中，宿主的专一性变化很大，一些真菌能够从生长在不同的生态和地理条件下的属于不同科属的多种宿主植物内分离出来，但是其它一些内生真菌仅限于某一特殊种属的几种宿主植物，仅有少数几种内生真菌专一地出现在某一种特定的植物中。 内生真菌在一些植物及农作物中广泛传播具有重要意义，农业科学家对牧草的内生真菌有特别的兴趣，因为这些真菌会产生真菌毒素，从而对动物产生毒性。此外这些真菌也有潜在的应用价值，例如利用抗、感品种的植株或器官对病原真菌毒素的敏感性反应上的差异，人们可以应用毒素进行快速、准确地鉴定大批的品种资源，一则可以直接发现抗病材料，在生产上推广应用；二则可以选出一些农艺性状虽然不太理想，但具有抗病性的材料，作为今后常规育种的亲本材料。 三、草本植物的内生真菌 l．草本植物内生真菌的形成许多草本植物的内生真菌都是属于麦角菌科（Clavicipitaceae）的真菌，其中传播最广的可能是香柱菌（Epichloe typhina），它寄生在禾本科牧草上，在70多种草坪植物中均存在，它的无性世代是半知菌类的顶孢霉属（Acremonium）。香柱菌属真菌子座淡色，平铺状，包围在禾本科植物茎和叶上，像一个套子；子囊壳理生在子座内，子囊细长，单膜；顶端加厚，具有折光性的顶帽；子囊孢子丝状，无色，有隔膜。 麦角菌属（ Claviceps）内生真菌，寄生在禾本科植物的子房内，后期在子房内形成圆形到香蕉形的黑色或白色的菌核，菌核越冬后，产生子座；子座直立，有柄，可孕头部近球形，子囊壳埋在整个可孕头部的表层内；子囊孢子无色，丝状，无隔膜。麦角菌（C．purpurea）寄生的患病植物在种子上形成紫色、弯曲的菌核，即表角；麦角内含有生
植物内生真菌的分离
植物内生真菌的分离 一、实验目的 1．理解内生真菌存在的普遍性和多样性 2.掌握常规的微生物分离纯化方法 3.掌握分菌过程中的一些基本操作技能 二、实验原理 植物内生真菌( Ｅnｄophｙte) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿主植物一般不表现出外在的症状。所有植物中几乎都存在内生菌. 由于植物内生真菌与宿主在长期的进化过程中形成了特殊的生态关系,因而内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物越来越成为微生物次生代谢产物的研究热点之一。 采用微生物学常规的组织分离法从植物中分离内生真菌 三、实验材料 板蓝根新鲜健康的叶片 试剂:次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素 培养基：PDA培养基、分离培养基 四、实验步骤 （一)、配制PDA培养基 10月27号晚上：
(1）配置ＰDA培养基,用电子称称取去皮的土豆10０g，煮沸30min，4层纱布过滤，滤液加热,加入琼脂７.5克，琼脂完全融化后加入葡萄糖10g，待稍冷却后加水至5０0毫升。 (2)准备1０瓶无菌水，每瓶150ml左右。 (3)包好烧杯,培养皿，涂布棒等实验仪器，等待消毒。 (二)、配制分离培养基 28号中午： （1）配置分离培养基，将PDA培养液均分成两份，一份备用,另一份待高温灭菌后,加入青霉素１0０mg／L、链霉素200mg/L的混合液20mｌ，即得到分离培养基。 （2）用消毒后的培养皿在通风橱中倒平板,注意在整个过程中保证无菌操作。 (三)、采集新鲜板蓝根叶片 ２8号晚上到实验室外采集新鲜健康叶片完整的板蓝根叶片。(四)、植物组织表面消毒 2８号晚上将新鲜、健康的板蓝根叶片于自来水下冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分后剪成小段(片）做如下表面消毒处理:75%酒精漂洗3ｍin，无菌水冲洗4~5次,5％次氯酸钠溶液漂洗叶3ｍin,无菌水冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。 （五）、接种并培养 28号晚上: (1）将上述表面消毒后的材料剪切成0.５ｃm 2 小块,放入含