水稻原生质体分离与转化方法2014-01-20

水稻原生质体分离与转化方法

（储成才 课题组 2014-01-20）

【概述】原生质体是一种非常好的瞬时表达系统，现在已被广泛应用于植物生理生化和分子机制的研究，包括细胞信号转导过程，离子转运，细胞壁合成，蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程。现在已有的基于原生质体的实验技术包括亚细胞定位，基因瞬时表达分析，启动子活性分析，离子吸收实验以及蛋白质相互作用验证（如BiFC和蛋白质免疫共沉淀）等。本文主要阐述如何利用原生质体进行亚细胞定位，包括原生质体的制备与转化，定位载体的选择，共定位蛋白参照的介绍，荧光蛋白的性质和波长选择等问题。

一、实验的前期准备：

1. 水稻材料：将露白的水稻种子(中花11或者日本晴均可)整齐的播种在营养土（最好混有蛭石，营养土与蛭石的比例为1:1）中，放在温室生长14-21天。或者放在96孔PCR板上，萌发两天后，换成1×木村营养液培养7-10天。注意如果采用水培苗必须每天更换营养液，否则水培苗纤维化程度较高，叶鞘部分不够肥厚，且不容易被酶液消化。制备一次原生质体需要50-60棵水稻幼苗，可供转化质粒5-8个。

2. 质粒制备：转化原生质体对质粒的质量要求比较高，需要使用试剂盒大量提取。通常大量提取一次需要100 mL菌液，使用Qiagen中量提取试剂盒可获得100-150 μg的高纯度无内毒素的质粒。质粒提取完毕后需要定量，通常将质粒稀释到 2 μg/μL，一次原生质体转化需要5-10μg质粒。

二、试剂和耗材：

1. 耗材：耗材准备如下表所示。

耗材 数量 是否灭菌 用途

50 mL 蓝口瓶 1 否 用于配制酶液

250 mL 三角瓶 2 是 用于盛放酶液和过滤原生质体

A4打印纸 4-10 否 暂时盛放刀片切下的叶鞘薄片

玻璃板 1 否 避免刀片划伤实验台

50 mL Nalgen圆底有机玻璃管 2 是 用于离心收集原生质体

2 mL离心管 6-10 是 用于原生质体转化

双面刀片 8 否 用于切水稻茎和叶鞘

0.22 μm滤膜 2-3 否 用于过滤酶液

细胞培养板 1 否 用于培养转化的原生质体

2. 试剂准备：

(1) Enzyme solution

Enzyme solution 25 mL 50 mL 100 mL

0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 2.74 g 5.47 g 10.93 g

10 mM MES (M=195.24, pH=5.7) 0.0487 g 0.0975 g 0.195 g

1.5% Cellulase R-10（w/v, Yakult）0.375 g 0.75 g 1.5 g

0.75% Macerozyme（w/v, Yakult）0.1875 g 0.375 g 0.75 g

D-Mannitol 和MES 在常温储存，Cellulase R-10和Macerozyme R-10在4度冰箱储存。用1M KOH 调pH 至5.7，然后65℃水浴10min ，过0.22μM 滤膜除菌至无菌三角瓶中（注意pH 值一定要准确，否则将极大的影响原生质体的制备效率。Cellulase R-10可以用Cellulase RS 代替，但是Cellulase RS 的最适pH 大约为6.0左右）。待酶液冷却至室温后，加入如下试剂： Enzyme solution 25 mL 50 mL 100 mL 0.1% BSA

0.025 g 0.05 g 0.1 g 3.4 mM CaCl 2 (M=110.99) 0.0095 g 0.019 g 0.038 g 50 mM β-ME (14.3 M) 8.75 μL 17.5 μL 35 μL

50 μg/ml Carbenicillin

1.25 mg

2.5 mg

5 mg

(CaCl 2可配制1M CaCl 2，然后加入85 μL/ 25 mL ，Carbenicillin 配制50 mg/ mL 的母液)。 (2) W5 Solution W5 Solution

100 mL 200 mL 400mL 154 mM NaCl (M=58.44) 0.9 g 1.8 g 3.6 g 125 mM CaCl 2 (M=110.99) 1.39 g 2.78 5.56g 5 mM KCl (M=74.55)

0.037 g 0.074 g 0.148 g 2 mM MES (M=195.24, pH=5.7)

0.039 g

0.078 g

0.156 g

用1M KOH 调pH 至5.7 , 121℃灭菌20 min 。 (3) MMg Solution MMg Solution

100 mL 0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 10.93 g 15 mM MgCl 2 (M=95.22) 0.143 g 4 mM MES (M=195.24, pH=5.7)

0.078 g

用1M KOH 调pH 至5.7 , 121℃灭菌20 min 。 (4) 40% PEG Solution PEG Solution 5 mL 100 mL 0.6 M D-Mannitol 0.546 g

10.93 g 100 mM CaCl 2

0.5 mL (1M CaCl 2) 1.11

g 40% (v/v) PEG 4000 (Fluka, Sigma-Aldrich )

2 g (体积约等于1.75 mL)

40 g

Tips ：由于PEG 吸水后体积会膨胀，所以必须在定容前给PEG 留出一部分体积。配制该

溶液时先溶解D-Mannitol 和CaCl 2后，再加入PEG ，65℃水浴加热10min 至完全溶解后，再定容到最终体积。

三、实验步骤

1. 原生质体制备：

(1) 预先配制0.6 M D-Mannitol 溶液100 mL 。

(2) 将培养的水稻苗从茎基部截断后，用刀片切成0.5 mm 薄片，每次4-5颗苗/1个刀片(茎部比较好，叶片的细胞比较小，去除衰老的叶鞘)。将切好的水稻细条迅速转移入0.6 M D-Mannitol 溶液中，在常温下60-80 rpm 培养30 min 。

(3) 用神奇滤布（Miracloth）过滤后，再药匙将滤布上的水稻薄片转移入含有酶液的250 mL 三角瓶中（三角瓶需用锡箔纸包住，避免见光）。放入28℃摇床，在黑暗条件下60-80 rpm酶解4-5 h。

Tips：以上步骤为节省时间，也可以直接将切好的水稻薄片转移入酶液中进行酶解。如果不经过0.6 M Mannitol质壁分离预处理的，则需抽真空半小时（15 mmHg）。

(4) 取10 μL在光学显微镜下观察原生体的完整性，健康的原生质体为边缘清晰的圆形游离态。

(5) 加入与酶液等体积的W5 Solution，用力摇晃15 s，充分释放原生质体。

(6) 用W5 Solution润洗灭菌过的网筛(35 μm, 100目), 将酶解的原生质体通过网筛，过滤到新的250 mL三角瓶中。再用少量W5 Solution冲洗网筛，充分洗脱网筛上的原生质体，并将其全部转入250 mL三角瓶中。

(7) 将三角瓶中的原生质体分装到两个50 mL透明离心管中，水平转子450 g（大约1500 rpm）离心3 min（注意调整升降速为3），小心去除上清。

(8) 加入15 mL W5 Solution重悬原生质体，并于450 g 离心3 min。小心去除上清后，重悬原生质体于1 mL MMg Solution中，使细胞的终浓度为1-5×106 cell/mL。

2. 原生质体转化：

(1) 在2 mL离心管中加入5-10 μg 质粒，再加入100 μL制备好的原生质体，并轻柔地吸打混匀。

(2) 加入110 μL 40% PEG，并迅速轻柔混匀，勿使原生质体成团。

(3) 置于28 ℃水浴15 min，加入1.8 mL W5 Solution重悬，并终止反应。

(4) 将2 mL离心管套在10 mL离心管中，水平转子450 g离心3 min。

(5) 用移液器小心吸除上清后，重悬原生质体于750 μL W5 Solution中。

(6) 转移原生质体到12孔细胞培养板里，用封口膜包好后，于28℃避光培养12-16h。Tips：原生质体的转化体系一定要按比例放大，否则PEG浓度的改变会导致转化效率的降低。用于Co-localization和BiFC等共转化实验需要的质粒要更多更纯。

四、亚细胞定位以及BiFC的载体信息

1. 用于亚细胞定位的载体有：

pCAMBIA2300-35S-EGFP(N)：EGFP融合于目的蛋白N端。可用来做瞬时表达和稳定表达。pCAMBIA2300-35S-EGFP(C)：EGFP 融合于目的蛋白C端。可用来做瞬时表达和稳定表达。(这两个载体可用于稳定转化水稻、拟南芥和烟草，注意农杆菌分别对应AGL1和GV3101。) pUC-35S-EGFP(Modified): eGFP融合于目的蛋白N端。仅可用来瞬时表达。

pSAT6-EYFP-C1(35S,CD3-1103)：eGYP融合于目的蛋白N端。仅可用来瞬时表达。

pSAT6-EYFP-N1(35S,CD3-1104)：eGYP融合于目的蛋白C端。仅可用来瞬时表达。

2. 用于BiFC的载体有（双分子荧光互补的载体是成对的）：

pSPYNE173和pSPYCE（M）：分离的EYFP融合于目的蛋白的C端，用于瞬时表达。pSCYNE和pSCYCE：分离的CFP融合于目的蛋白的C端，用于瞬时表达。

pVYNE和pVYCE：分离的Venus融合于目的蛋白的C端，用于瞬时表达和稳定表达。pVYNE(R)和pVYCE(R)：分离的Venus融合于目的蛋白的N端，用于瞬时表达和稳定表达。Tips：在转化原生质体时，应当尽量采用 ~4.5 kb的质粒。越小的质粒转化效率越高，蛋白荧光越强。

五、共定位蛋白参照

我们实验室现有的共定位蛋白参照如下：

Localization Marker Accession Number Endoplasmic reticulum ER-RFP（RFP-HDEL） Unknown Golgi Golgi-RFP（SialT-RFP） Unknown

Tonoplast Alpha-TIP-RFP

Gamma-TIP-RFP

Delta-TIP-RFP At1g73190 At2g36830 At3g16240

Chloroplast RbcS-EGFP Os12g0291100 Nuclear OsbZIP52-mRFP Os06g0662200

此外，还有一些共定位蛋白参照可以参考：

Localization Marker Accession Number

Chloroplast OsRbcS Os12g0292400 Chloroplast OsRbcA Os11g0707000 Mitochondrion OsRpl6-2 Os08g0484301 Mitochondrion OsAtpC Os07g0513000 Nuclear OsSRT1 Os04g0271000 Golgi Golgi-mCherry（Man49-mCherry）Unknown

Golgi OsNST1 Os02g0614100 Endoplasmic reticulum DEP2 Os07g0616000

六、荧光蛋白的基本特性

目前，常用的一些荧光蛋白的基本性质总结如下：

Type Excitation(nm) Emission(nm) Structure

Aequorea FP derivatives (水

母来源的荧光蛋白)

Cyan (CFP) 433/452 475/505 Monomer/weak

dimer

Cerulean 433 475 Monomer/weak

dimer Enhanced green (eGFP) 488 506 Monomer/weak

dimer Enhanced yellow (eYFP) 514 527 Monomer/weak dimer

Venus 515 528 Monomer/weak

dimer Citrine 516 529 Monomer/weak

dimer Anthozoa FP derivatives (珊

瑚来源的荧光蛋白)

mOrange 548 562 Monomer

Red (RFP) 555 584 Monomer

mRed (mRFP)584607Monomer

mCherry 587 610 Monomer

参考文献

Bart R, Chern M, Park CJ, Bartley L, Ronald PC (2006) A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods 2:13–21

Zhang Y, Su J, Duan S, Ao Y, Dai J, Liu J, Wang P, Li Y, Liu B, Feng D, Wang J,Wang H (2011) A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying

light/chloroplastrelated processes. Plant Methods 7:30–43

附件

1. Total protein extraction and Western blot from rice protoplast

Protoplasts were harvested by centrifugation at 1,500 rpm for 3 min. Total protein was extracted with protein extraction buffer (50 mM Tris-HCl at pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.2% NP-40, 0.1% Triton X-100 and Complete protease inhibitor cocktail, Roche), usually 200-300 μL for 1 mL protoplasts (approximately 2 × 106 cells). The extracts were then centrifuged at 16,000 rpm for 15 min at 4°C, and the supernatants were collected for Western blot analysis. About 20 μg of total protein per sample, determined by the Bradford Assay (BioRad), were analyzed by SDS-PAGE. Western analysis was performed with a monoclonal mouse anti-c-myc (Roche) or monoclonal rabbit anti-GFP (Abmart) primary antibody.

2. Co-immunoprecipitation in rice protoplast

The transformed protoplasts were harvested by centrifugation at 300 g for 5 min. Approximately, 2×106 protoplasts were homogenized in IP buffer containing 25 mM Tris-HCl, pH 7.5,150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1 mM EDTA, and 1 % protease inhibitor (Sigma) and incubated for 30 min on ice and then centrifuged at 15,000g for 10min at 4 °C to remove aggregates. The protein extract was then diluted to a concentration of 1–2 μg μl?1 in IP buffer. Forty microliters of Protein A/G Agarose Beads (Abmart) were added, and the mixture was incubated for 3 h at 4 °C with gentle shaking (40–50 rpm). The beads were removed by centrifugation at 14,000g for 5 min at 4 °C and antibodies were added to the supernatant. After overnight incubation at 4 °C, 40 μl of protein A-Sepharose was added and incubated for further 2–3 h at 4 °C. The beads were collected by centrifugation at 100g for 3 min at 4 °C, and then washed five times with ice-cold IP buffer. The proteins were eluted from the beads by boiling in SDS-PAGE sample buffer for 5 min and analyzed by western blotting. The monoclonal mouse anti-GFP and monoclonal mouse anti-FLAG antibodies were obtained from Abmart.

（Revised by Wang Wei，2014-01）