组织冰冻切片步骤
组织冰冻切片步骤
冰冻切片是一种常见的实验技术，用于获取生物样品的细胞或组织的薄片，以便进行进一步的研究和分析。下面将介绍组织冰冻切片的步骤。
1. 材料准备
首先，准备好所需的材料，包括冷冻剂（如液氮或干冰）、组织样品、切片刀、切片刀床、切片刀片、切片缓冲液（如磷酸盐缓冲液）和载玻片。
2. 固定组织样品
将待切割的组织样品用适当的方法进行固定，比如使用福尔马林或其他适合的固定剂。固定的目的是保持组织的形态结构和细胞的染色质形态。
3. 冷冻组织样品
将固定后的组织样品置于冷冻剂中，使其迅速冷冻。常见的冷冻剂包括液氮和干冰，其温度低于零下80摄氏度。冷冻过程应尽量迅速，以避免组织样品的结构和细胞的形态发生变化。
4. 制备切片刀床和刀片
在切片刀床上放置适当大小的切片刀片，确保刀片干净锋利。切片刀片的角度和刀片的锋利度会影响切片的质量，因此需要定期检
查和更换刀片。
5. 切割组织样品
将冷冻的组织样品取出，迅速放置在切片刀床上，并用切片刀沿着组织的纵向或横向切割，制备薄片。切割时要保持手的稳定和力度的均匀，以获得均匀且薄的切片。
6. 收集切片
使用切片刀片或刷子将切割好的组织切片收集到切片缓冲液中。切片缓冲液可以保持组织切片的湿润和形态结构。
7. 制备载玻片
在载玻片上涂抹一层适当的胶水或明胶溶液，将收集好的组织切片均匀地放置在载玻片上。确保组织切片的平整和分布均匀。
8. 干燥和固定切片
将载玻片放置在室温下或烘箱中，使其干燥。干燥后，可以使用染色剂或其他化学试剂对切片进行染色或固定，以便后续的显微镜观察和分析。
9. 显微镜观察和分析
将制备好的组织切片放置在显微镜下，观察和分析组织的形态结构、细胞的类型和分布等信息。可以使用不同的显微镜技术，如光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜，以获得更详细和精确的数据。
10. 结果记录和分析
根据显微镜观察和分析的结果，记录和分析组织切片的特征和变化。可以使用统计学方法对数据进行处理和分析，以得出科学结论和研究结果。
以上就是组织冰冻切片的步骤。通过冰冻切片技术，我们可以获取到组织样品的薄片，进一步研究和了解生物组织的结构和功能，为科学研究和医学诊断提供重要的依据和数据。
冰冻切片步骤 很全面
1. 取材： 应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。 2. 速冻： 为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。 液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。 3．固定： 样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。 取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。 组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。 4.切片： 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄
片至5-10μm。切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5~10min，消除内源性过氧化物酶的活性。 5．免疫荧光染色： 冰冻切片室温晾干15min,可用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可不洗） 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸)，将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。 第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。 滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。 回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。 滴加DAPI工作液染核，室温10-20min(工作浓度%染色15min)。 回收DAPI,滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。做好的片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。
冰冻切片步骤 很全面
冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。 1. 取材： 应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。 2. 速冻： 为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。 液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。 3．固定： 样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。
取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。 组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。 4.切片： 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5~10min，消除内源性过氧化物酶的活性。 5．免疫荧光染色： 冰冻切片室温晾干15min,可用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可不洗） 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸)，将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。 第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。 滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1
组织冰冻切片步骤
组织冰冻切片步骤 冰冻切片是一种常见的实验技术，用于获取生物样品的细胞或组织的薄片，以便进行进一步的研究和分析。下面将介绍组织冰冻切片的步骤。 1. 材料准备 首先，准备好所需的材料，包括冷冻剂（如液氮或干冰）、组织样品、切片刀、切片刀床、切片刀片、切片缓冲液（如磷酸盐缓冲液）和载玻片。 2. 固定组织样品 将待切割的组织样品用适当的方法进行固定，比如使用福尔马林或其他适合的固定剂。固定的目的是保持组织的形态结构和细胞的染色质形态。 3. 冷冻组织样品 将固定后的组织样品置于冷冻剂中，使其迅速冷冻。常见的冷冻剂包括液氮和干冰，其温度低于零下80摄氏度。冷冻过程应尽量迅速，以避免组织样品的结构和细胞的形态发生变化。 4. 制备切片刀床和刀片 在切片刀床上放置适当大小的切片刀片，确保刀片干净锋利。切片刀片的角度和刀片的锋利度会影响切片的质量，因此需要定期检
查和更换刀片。 5. 切割组织样品 将冷冻的组织样品取出，迅速放置在切片刀床上，并用切片刀沿着组织的纵向或横向切割，制备薄片。切割时要保持手的稳定和力度的均匀，以获得均匀且薄的切片。 6. 收集切片 使用切片刀片或刷子将切割好的组织切片收集到切片缓冲液中。切片缓冲液可以保持组织切片的湿润和形态结构。 7. 制备载玻片 在载玻片上涂抹一层适当的胶水或明胶溶液，将收集好的组织切片均匀地放置在载玻片上。确保组织切片的平整和分布均匀。 8. 干燥和固定切片 将载玻片放置在室温下或烘箱中，使其干燥。干燥后，可以使用染色剂或其他化学试剂对切片进行染色或固定，以便后续的显微镜观察和分析。 9. 显微镜观察和分析 将制备好的组织切片放置在显微镜下，观察和分析组织的形态结构、细胞的类型和分布等信息。可以使用不同的显微镜技术，如光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜，以获得更详细和精确的数据。
冷冻切片方法及注意事项
一、试验前预备 清理试验台及仪器。 开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度〔- 15~-20 ℃*〕。 预备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。 二、取材 解剖之后快速取出所需的颖组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材〔24×24×2mm*〕,以防形成冰晶造成切片中形成外形不一的空泡,使细胞内构造移位。 〔注：取材中目的标本既要明确也要确保其构造的完整性，应避开不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。〕 三、冷冻切片 1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片〔1~3 分种〕。 2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 3、调好欲切的厚度，依据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm 间。 4、调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调整上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，以切出完整、平滑的切片为准。切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向略微用力轻轻一带,可避开组织摊片过程中皱折,保证组织构造的完整及切片的美观。 注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。常用的有三种包埋剂OCT 剂、B 超藕合剂以及一般胶水。B 超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,一般胶水或OCT 剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。〔OCT 包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。〕 ②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30 秒钟左右待胶凝固时将小组织放上, 组织四周再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。 ③冷冻箱及冷冻头的温度凹凸，要依据不同的组织而定。温度过低会导致组织块过硬,切片碎裂,消灭梯田状薄厚不均或空洞;反之,温度过高,组织块硬度不够,切片不易成形或成皱褶。数据图1 供参考。 ④当切片时，假设觉察冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。 ⑤用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。由于当附贴切片时，从室温中取出的
冰冻切片法详细步骤
冰冻切片法详细步骤 冰冻切片法是组织化学，特别是酶组织化学最常用的切片技术，固定或未固定的组织样品均可进行冰冻切片，新鲜组织冰冻切片对组织细胞内酶类保存最佳，尤其对热、酸、碱、有机溶剂等耐受能力弱的酶和化学物质更加适用。冰冻切片也是免疫细胞化学研究中常用的切片方法，能够较完好地保存多种抗原，尤其是表面抗原的抗原性。 在冰冻切片中，组织中水分易形成冰晶，往往影响酶和抗原的定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小；冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织脏器如脑、心肌、骨骼肌中上述现象更易发生。冰晶形成的主要原因是冷冻速度缓慢，温度偏高，细胞内冷冻不均匀所致，常采取以下措施以减少冰晶的形成。 1. 骤冷通常采用骤冷、速冻(1~10°C/s 的冷冻速度）的方法可减少冰晶形成。 (1) 干冰－丙酮（乙醇）法。将150~200 ml 丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70°C ，用一小烧杯(50~100 ml) 装上异戊烧约50 ml, 再将烧杯缓慢置入干冰－丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烧温度达-70°C 时即可使用。将组织块（大小为1 cmX0. 8 cmX0. 5 cm) 投入异戊烧内速冻30~60s 后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80°C低温冰箱内贮存。 (2) 液氮法。将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2 cm) ，如组织块小可适抵加 OCT 包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保待原位切勿浸入液氮中， 10~20 s 组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80°C 冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。 2. 冷冻保护加入冷冻保护物质以防止冻害，并在冷冻情况下保持细胞和组织的活性。防止冻害的物质有甘油、二甲亚砜(DMSO) 、蔗糖、甘露糖、聚乙烯吡咯烧酮(PVP) 等。现在，常将组织在冷福尔马
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之阿布丰王创作 冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步调，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。 1. 取材： 应尽可能快地采纳新鲜的资料，防止组织发生死后变更。 2. 速冻： 为了较好地保管细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。 液氮速冻切片法是实验室最经常使用的速冻切片方法。具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒坚持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保管，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。3．固定： 样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱
预冷5-10min让OCT胶浸透组织。 取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。 组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。 4.切片： 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5~10min，消除内源性过氧化物酶的活性。 5．免疫荧光染色： 冰冻切片室温晾干15min,可用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可不洗） 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且包管整个过程中不会使组织干涸)，将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。 第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片拔出到小染缸PBS冲洗。
【技语】术中冰冻制片技术经验分享（一）：操作流程
【技语】术中冰冻制片技术经验分享（一）：操作流程 一、制片前物品与耗材准备 冷冻锤放置在速冻台上预冷。 组织托（清洁干燥后）放入冰冻机箱体中预冷。 其它制片耗材的准备，如载玻片、编号标签、吸水纸、毛刷等。 二、恒温冰冻切片机的工作温度设置 速冻台温度：尽可能低（至少-30℃以下），不同品牌的冰冻切片机速冻台开启方式会有差异，制片前开启速冻台为冷冻锤降温。 箱体的温度： -16℃~-20℃。 样本头的温度：切一般软组织-16℃~-20℃，切含多量脂肪的组织可设为-30℃~-45℃ 。 三、冰冻切片固定液的选择 推荐使用复合型冰冻固定液，如AF、AFA、改良的Bouin's固定液等。 不建议使用如95%乙醇、丙酮、甲醇等单纯型冰冻固定液。 四、术中冰冻制片操作流程 1、组织取材大小：1.5×1.5cm×0.5cm，尽量剔除脂肪组织、钙化、骨质等成分。 2、用吸水纸吸干组织表面的组织液或血液。 3、组织托放上速冻台，加入少量冰冻包埋剂，待底部变白但表面未凝固时放上组织，适当加盖少量包埋剂，加冷冻锤速冻组织（注意保持组织冷冻切面的水平）。 4、冷冻组织块编号（各实验室按照自己的SOP进行编号）。 5、粗修组织，粗修修片厚度30μm以内，粗修修片次数深度尽量控制在20次以内。 6、粗修后细修，细修数次保证组织切面的结构完整性。 7、切片，普通软组织切片厚度6μm，淋巴结或小细胞肿瘤切片厚度4~5μm。 8、冰冻切片贴片后立即固定。
9、流水清洗切片10~60秒。 10、苏木精染液染30秒~1分钟（室温25℃），室温过低需适当延长染色时间。 11、水洗5~10秒。 12、返兰液返兰3~5秒或温水充分返兰。 13、流水充分洗净返兰液（20秒以上）。 14、伊红染色液2~5秒，抖动切片促进染色均匀； 15、75%乙醇1缸5~10秒，分化伊红（可根据伊红染色情况省略该步骤）； 16、95%乙醇1缸5~10秒； 17、无水酒精2缸各5~10秒，抖动玻片促进脱水效果； 18、500毫升透明剂3缸，每缸各10~30秒，抖动玻片促进透明效果。 19、封片剂封片。 20、切片贴标签，核对无误后交接给诊断医生。 五、一些注意事项 1、组织取材的厚度影响冷冻的速度，厚度不超过0.5cm。 2、使用优质的吸水纸。 3、组织使用液氮冷冻速度明显快于冷冻锤，可有效减少组织冰晶形成, 制片效果优于冷冻锤。 4、多块组织同时制片，每块需按照正确冷冻锤冷冻方式完成组织冷冻后，再逐块切片。 5、冷冻过组织的冷冻锤，须将冷冻锤放在速冻台上充分降温后再冷冻下一块组织。 6、组织温度过低影响切片质量，严禁用手捂组织进行升温，将组织块拿到箱体外室短时放置升高温度再进行切片操作。 7、苏木素伊红染液保持新鲜，并根据各实验室染色效果适当调整染色时间。 8、用返兰液兰化，须充分洗净切片中的兰化液。 9、切片透明后封片。
肿瘤组织冷冻切片步骤
肿瘤组织冷冻切片步骤 一、前言 肿瘤组织冷冻切片是一种常用的组织学技术，它通常用于研究肿瘤形态学和生化学特征。相比于常规石蜡包埋和切片技术，冷冻切片具有操作简便、节省时间、样本保存完好等优点。本文将详细介绍肿瘤组织冷冻切片的步骤。 二、材料准备 1. 组织样本：新鲜取材或已保存在液氮中的肿瘤组织。 2. 冰冻剂：如液氮或干冰。 3. 制片纸：通常使用的是聚乙烯制片纸，尺寸为2 x 3英寸（5 x 7.5厘米）。 4. 制片夹：用于固定制片纸和组织样本。 三、步骤 1. 取出组织样本并进行处理： a) 如果是新鲜取材，应在取材后立即放入液氮中，并尽快送到实验室进行处理。 b) 如果已保存在液氮中，应从液氮中取出并迅速解冻。 c) 如果需要进行染色或其他后续实验，可以在取出组织样本后进行固定和包埋等处理。
2. 制备组织样本： a) 将组织样本切成适当大小的块，通常为1 x 1 x 0.5厘米。 b) 将组织块放入冰冻剂中，以便使其迅速冷冻。通常使用的是液氮或 干冰。 c) 在组织块完全凝固后，将其取出并用刀片或其他工具将其切成薄片。通常切片厚度为5-10微米。 3. 制备制片纸： a) 取出制片纸，并在上面标记样本编号和切片日期等信息。 b) 在制片纸上滴一滴无菌生理盐水或PBS等缓冲液。 4. 制作冷冻切片： a) 将制片夹中的制片纸夹紧，并将其置于刀床上。 b) 将已经切好的薄片放在制片纸上，并用显微镜检查其质量。 c) 在显微镜下，使用专业的手持式刀具（如Microm HM 525 Cryostat）沿着薄片边缘轻轻地将其从组织块中剥离下来，并贴附到 制片纸上。 d) 将制片纸和切片夹在一起，放回冷冻剂中保存。 5. 制作多个切片： a) 对于大块的组织样本，可以制作多个切片，并在不同的制片纸上标 记编号以便后续处理。
冰冻切片实验步骤
全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 3 -250C包埋（冰冻切片机内） 4冰冻切片 冰冻切片步骤 1.冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min， 2.PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约 1min后更换） 3.用30%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。 4.PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短 些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。 5.5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内 玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。 6.甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓 度不均。 7.配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100），悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头不 要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。 8.放入湿盒内，置于4°C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观察玻片是 否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。 9.第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min， 10.滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹 匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。 11.滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h， 后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。 12.DAB显色，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止DAB反应，最好把玻片置于显 微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB，观察到阳性区和阴性区差异后终止，此时最好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间（一般显色时间2s-10min，显色时间过长背景高，且可靠性低） 13.终止DAB显色可将玻片置于染色缸内，用自来水流水稀释终止5min，后在显微镜下观察 是否有DAB颗粒附着。 14.甩干水分，苏木素复染（如为加汞的苏木素，显色时间为6-10s，可不用酒精分化， 直接用PBS返蓝，如为非加汞苏木素，需在盐酸酒精分化），苏木素终止亦可用自来水冲洗终止反应。 15.水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明（75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯1-二甲苯2）个3min， 滴加中性树胶封片，中性树胶浓度以不拉丝为宜 16.封片后干燥1h(或者在通风橱吹风的情况下15min)，用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶。 观察照相。
冰冻切片步骤很全面
冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片.它实际上 是以水为包埋剂,将组织进行冰冻至坚硬后切片的. 在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程,大大缩短了制片时间.同时, 由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤,因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片,并作为快速切片的方法应用在临床诊断. 1.取材： 应尽可能快地采取新鲜的材料,预防组织发生死后变化. 2.速冻： 为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需 要,一般在取材后就要马上对组织块进行速冻,使组织温度骤降,缩短降温的时间,减少冰晶的形成. 液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法.具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内〔直径约2cm〕,如组织块小可 适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约10-20S组织即迅速冰结成块.在制成冻块后, 即可置入恒冷箱切片机冰冻切片. 假设需要保存,应快速以铝箔或塑料薄膜封包,立即置入-80 C冰箱贮存备用. 3.固定： 样品托上涂一层OC饱埋胶,将速冻组织置于其上,4 c冰箱预冷5-10min让OCT交浸透组织. 取下组织置于锡箔或者玻片上,样品托速冻.
组织置于样品托上,具上再添一层OCT交,以完全覆盖为宜,速冻 架〔P6 上30min. 4.切片： 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机,其根本结构是将切片机置于低温密闭室内,故切片时不受外界温度和环境影响, 可连续切薄片至 5-10 wm.切片时,低温室内温度以-15 C〜-20C为宜,温度过低组织易破 碎,抗卷板的位置及角度要适当,载玻片附贴组织切片,切勿上下移动.切好室温放置30min后,入4c丙酮固定5~10min,烘箱枯燥20min.PBSa 5minX3.进行抗原热修复,微波热修复也可, 室温自然冷却.可用3%H2O2?育5~10min,消除内源性过氧化物酶的活性. 5.免疫荧光染色： 冰冻切片室温晾干15min,可用含10%正常山羊血清的PBS室温封 闭切片1小时〔此步可不洗〕 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液〔抗体的量视组织大小而定,原那么是可以均匀覆盖组织面,且保证整个过程中不会使组织干涸〕,将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒,室温孵育2小时或4c 过夜. 第二天先将湿盒放到37c回温1h,然后吸取片上的一抗进行回收,将 切片插入到小染缸PBS中洗. 滴加用PBS#释好的二抗〔避光〕置于分子杂交箱中37 c孵育1 小时. 回收二抗,切片置于染缸内,PBSa 5minX3次. 滴加DAPI工作液染核,室温10-20min〔工作浓度0.1%染色
冰冻切片实验步骤
冰冻切片实验步骤 全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 3 -250C包埋（冰冻切片机内） 4冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗 冰冻切片不能用热修复啊 以下是我的步骤： 1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS 洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。 2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 3 PBS冲洗，5分钟×3次。 4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗，5分钟×3次。 7 显色剂显色（DAB）。 8 自来水充分冲洗，复染，封片。
冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。 免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例) 1 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 3 PBS冲洗，5分钟×3次。 4 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 5 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗，5分钟×3次。 7 显色剂显色（DAB或AEC）。 8 自来水充分冲洗，复染，封片。 1.冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min， 2.PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min
冰冻切片实验步骤
全部试验步骤 1取颖组织于4%多聚甲醛固定24 小时 230%蔗糖脱水48 小时以上 3-250C 包埋〔冰冻切片机内〕 4冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8μm，室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3 次。用3%过氧化氢孵育5~10 分钟，以消退内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗，5 分钟×2 次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗 ！ 冰冻切片不能用热修复啊！！ 以下是我的步骤： 1冰冻切片室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10 分钟，PBS 洗，5 分钟×2。 25~10％正常山羊血清〔PBS 稀释〕封闭，室温孵育10 分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2 小时或4℃过夜。 3PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 4滴加滴加其次代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30 分钟。 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 5滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30 分钟。 6PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 7显色剂显色〔DAB〕。 8自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇 溶液，室温20 分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在9ml 甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次颖配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10 分钟，消退内源性过氧化物酶的活性。PBS 洗，5 分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。