食品生物化学实验思考题

《蔗糖酶的提取及分级沉淀提取综合实验》部分思考计算

先预习综合性实验的P25~30以及P49~57；

一、熟练酶液蔗糖酶活力测定方法及计算

还原糖是分子中含有游离醛基或酮基的单糖或双糖，蔗糖经蔗糖酶酶解作用后，酶

解产物的还原糖含量可用3,5二硝基水杨酸比色法测定，与葡萄糖标准工作曲线比较定量计算。经公式换算可求出酶液中蔗糖酶活力。糖液中还原糖含量越高，说明蔗糖酶活力越大，可通过蔗糖酶活力的大小，评价酶的提取方法、酶纯化的结果等指标。 蔗糖蔗糖酶

葡萄糖果糖

酶液中蔗糖酶活力单位计算：

利用葡萄糖标准曲线，根据蔗糖被蔗糖酶酶解3分钟后反应液中还原糖的生成量来

计算。

设：已知葡萄糖标准工作曲线回归方程为：

y =1.56A+0.0051 (y ：单位为mg ；A ：520nm 吸光值)

已知：吸取酶解反应液0.2mL ，比色法测得520nm 波长吸光值A=0.670。

求 ：（1）酶液蔗糖酶活力（U/mL ）；(按51页计算公式计算) 答案：13.13（U/mL ）

若酶解反应液酶活力高，需稀释后才能检测，换算时注意稀释倍数的换算。

（2）若所提取酶液总体积为20mL ，酶液总酶活力等于多少？

答案：262.57(单位)

二、酶的分级沉淀提取

经酵母破壁提取的酶液除含有蔗糖酶外，还含有其他的杂蛋白，实验中蔗糖酶的分级沉淀提取是一除杂纯化过程。分级沉淀试剂可用乙醇或硫酸铵，加入酶液的沉淀剂浓度不同，不同种类的蛋白质在不同浓度的脱水剂体系中稳定性的不同，可达到除杂的目的。

加入适量的沉淀剂后，酶液经离心后均有沉淀物产生，沉淀物用缓冲液溶解后，测定溶解液的酶活力大小以及蛋白质含量，可评价沉淀物是以为主还是杂蛋白。若测定结果蛋白质含量高，但酶活力相对较小，说明此试剂浓度可除去部分杂蛋白未能有效提取蔗糖酶；继续提高试剂浓度，则可能达到有效提取蔗糖酶的目的。

学术部整理

分级沉淀实验计算考题：

1、室温下取20mL 酶液进行酶的分级沉淀提取实验，沉淀剂选用硫酸铵。若一次沉淀硫酸铵的饱和度浓度达40%，需向酶液添加固体硫酸铵多少克？离心分离后，上清酶夜的体积为23mL ，若要使上清液硫酸铵的饱和度提高至70%进行二次沉淀提取，需补加固体硫酸铵多少克？（计算过程需利用57页附表2硫酸铵饱和度的常用表）

答案：4.84g ； 4.71g 。

2、用20mL 酶液进行酶的分级沉淀提取实验，已知原酶液蔗糖酶总活力为200U 。酶液经一次盐析沉淀离心分离后，沉淀物溶解液为7mL ，测得酶活力5 U/mL ，求：

（1）7mL 酶液蔗糖酶总活力。

答案：35U(酶活单位)；

（2）一次沉淀酶的提取率？

答案：35/200=17%

（3）经二次盐析沉淀后，离心分离沉淀物溶解液为8.5mL ，酶活力10 U/mL 。求：

酶液蔗糖酶总活力；及二次沉淀后酶的提取率？

答案：85U ； 酶提取率：85/200*100=42.5%

思考：哪次沉淀条件有利于蔗糖酶的提取。

三、酶液比活力计算

已知：(1) 50mL 酶液，其蔗糖酶活力为10U/mL ，蛋白质含量20mg/mL 。计算酶液的总活

力及比活力。

答案：总活力=500U ；比活力=0.5

(2) 50mL 酶液，其蔗糖酶活力为8U/mL ，蛋白质含量5mg/mL 。计算酶液的总活力

及比活力。

答案：总活力=400U ；比活力=1.6

根据计算结果评价两酶液的纯度。

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四、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量计算注意问题：

测定时，若吸取样液是20微升，则V=0.02(mL)代人计算；若酶液中蛋白质含量高，需

稀释后再取样检测，则注意稀释倍数的换算。

注意：

一、实验检测方法：

1、酶活力的测定方法：预习辅助性实验一 蔗糖酶活力测定（49-51页）

2、蛋白质测定方法用：预习辅助性实验三 考马斯亮蓝染料比色法（54页） 正确熟练掌握两测定方法，是完成实验的基础。

二、实验分组：

因实验内容较多，以试验台为单位组成实验小组，选出组长，做好实验分工，如:葡萄糖标准曲线制备；酶液蔗糖酶活力测定；蛋白质含量测定；酶的分级沉淀（分级沉淀只选其中一种方法即可）等工作的完成均需统筹安排，每个同学积极参与，相互协作，共同完成。

三、预习：

每个同学需全面进行预习，熟悉实验内容，明确实验最终的目的，需记录哪些数据，填写哪些表格，熟悉实验检测方法，某一环节的错误有可能导致实验得不到数据。

细读预习p25~30页的实验内容，以及辅助性实验内容。然后计算以上思考题， 教科书蛋白质、酶的章节内容也可进行预习。

有问题下周实验可以讨论解答。也可发邮件商榷。

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