两种制备大鼠胚胎成纤维细胞的方法比较

以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞_杨俊林

·基础研究· 以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞* 杨俊林 刘雄昊喻姣玲冯劢谭杨李卓吴 奔 高 庭 潘 盛 邬玲仟梁德生夏家辉 （中南大学医学遗传学国家重点实验室湖南长沙410078） 摘要目的：比较人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs ）与小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的增殖能力及研究人皮肤成纤维细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs ）未分化生长的能力。方法：利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs ，通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs 与MEFs 的体外增殖能力。将HDFs 作为饲养层细胞与hESCs 共培养，传代12代后，检测hESCs 碱性磷酸酶(AKP)、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。结果：HDFs 可连续传代培养15代以上，10代以下的HDFs 增殖迅速，而MEFs 自第4代起，增殖能力就明显下降；hESCs 在HDFs 饲养层上可传代培养12代以上，克隆边界清晰，细胞排列紧密，碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性，表达了hESCs 特异性转录因子。结论： HDFs 比MEFs 具有更强的增殖能力；HDFs 可作为培养hESCs 的饲养层细胞。关键词：人胚胎干细胞；人皮肤成纤维细胞；饲养层细胞中图分类号： R329.2文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009） 16-3001-05Culture of human embryonic cells by using human dermal fibroblasts as feeder cells* YANG Jun-lin,LIU Xiong-hao,YU Jiao-ling,FENG Mai,TAN Yang,LI Zhuo,WU Ben,GAO Ting, PAN Sheng,WU Ling-qian,LIANG De-sheng,XIA Jia-hui （State Key Laboratory of Medical Genetics,Central South University,Changsha,410078，China ） ABSTRACT Objective:To compare the proliferative potential of human dermal fibroblasts(HDFs)and mouse embryonic fibroblasts (MEFs),and to explore the feasibility for HDFs as feeder cells to support the growth of human embryonic cells (hESCs).Methods:HDFs were obtained from human skin by using the method of tissue-adherence.The proliferative capacities of HDFs and MEFs were compared by cell morphology and growth curve.HDFs were used as feeder cells to culture hESCs.After growing on HDFs for 12passages,the hESCs were tested for the expressions of alkaline phosphatase (AKP),the cell surface markers and cell-specific transcription factor of hESCs.Results:HDFs could be subcultured for more than 15passages,and retained strong proliferative potential before 10passages,while it decreased obviously in MEFs after subcultured for 4passages.The hESCs can passaged on HDFs feeder cells for 12passages with tightly packed cells and clear boundaries of clone,showing the positive results of alkaline phosphatase (AKP)and the cell surface markers and the expression of hESCs-specific transcription factor.Conclusion:HDFs showed a stronger proliferation ability than MEFs;HDFs can support the growth of hESCs. Key words:Human embryonic stem cells;Human dermal fibroblasts;Feeder cells Chinese Library Classification:R329.2Document code:A Article ID:1673-6273（2009） 16-3001-05*基金项目：国家重点基础研究发展计划（2004CB518800），国家高技术研究发展计划（2007AA021002和2007AA021206）和国家自然科学基金（30700458和30971298） 作者简介：杨俊林（1977-），男，博士研究生，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：yangjunlin@https://www.360docs.net/doc/df16115003.html, 刘雄昊（1975-），男，博士，助理研究员，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：liuxionghao@https://www.360docs.net/doc/df16115003.html, 杨俊林、刘雄昊为并列第一作者 △通讯作者：梁德生，E-mail ：liangdesheng@https://www.360docs.net/doc/df16115003.html, （收稿日期：2009-07-06接受日期：2009-07-30） 前言 自1998年Thomson [1]等人建立第一株人胚胎干细胞（hu-man embryonic stem cells,hESCs ）细胞系以来，hESCs 迅速成为人干细胞领域的研究热点。 hESCs 是具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，可以定向分化成不同的细胞、组织，这使得hESCs 在细胞治疗以及再生医学方面具有巨大的潜力。目前大 多数的人胚胎干细胞系是以小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse em-bryonic fibroblasts,MEFs)作为饲养层细胞维持其生长和未分化状态的， MEF 细胞通过与hESC 直接接触及分泌多种因子维持人胚胎干细胞未分化状态。而鼠源性的饲养层细胞很可能给hESCs 带来动物源性的病原体或生物活性分子的污染，严重阻碍hESCs 的临床应用。早期就在鼠的细胞发现Hantaan 病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）、呼肠病毒-3[2]，这些病

实验小鼠和大鼠各胚胎发育时期的变化

实验小鼠和大鼠各胚胎发育时期的变化 时期 胎龄（日） 胚胎发育小鼠大鼠 1 1 1 单核细胞（输卵管内） 2 2 2细胞期（输卵管内） 3 2 3.25 4细胞期（输卵管内） 4 2. 5 3.5 8-12细胞期（输卵管内） 5 3 3. 桑椹期（输卵管—子宫上部） 6 3.5 4 囊胚初期（子宫内） 7 4 5 囊胚期 8 4.5 6 植入开始 9 5 6.75 内外胚层分化 10 5.5 7.25 植入末期，卵黄腔形成，分化成内外胚层， 11 6.5 7.75 植入完毕，出现羊膜。 12 7 8.5 出现中胚层和原条。 13 7.5 9 出现神经板，头部突起，出现尿膜褶。 14 7.75 9.5 体节1-4（头部）完成外层胎盘。 15 8～8.5 10 腔，胚外体腔内和羊膜腔发育。体节5-12（颈椎部） 形成神经沟，胚回转开始。 16 8.5～9 10.5 体节13-20（胸椎前部）胚回转结束。 17 9.5 11 体节21-25（胸椎后部），神经沟闭锁。 18 10 11.5 体节26-28（腰椎前部），前肢出现。 19 10.25 11.75 体节29-31（腰椎后部），后肢出现。 20 体节32-33（荐椎后部）。 21 12 体节34、35（荐椎后部）。 22 10.5 体节36（第一层尾椎）鼻窝形成 23 体节37、38（尾椎）。 24 体节39、40（尾椎）。 25 11 12.5 体节41、42，前肢变大。

26 体节43-45（尾椎）手指分化。 27 12 13 体节46-48（尾椎）脐疝明显。 28 12.5 13.5 体节49-51（尾椎），鼻上颌闭锁。 29 14 体节52-55（尾椎）。 30 13 14.5 体节56-60（尾椎），耳孔开，耳壳形成 31 13.5～14 15 体节61-63（尾椎），口盖板闭锁 32 14.5 15.5 体节64（尾椎）、体表出现毛囊。 33 15 16 体节65（最终尾椎） 34 16-16.5 17-18 脐疝消失，眼脸、耳壳闭锁。 35 17-19 19-22 胎盘发育显著。临产。

小鼠皮下脂肪细胞使用说明

小鼠皮下脂肪细胞 小鼠皮下脂肪细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠皮下脂肪细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠皮下脂肪细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠皮下脂肪细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠皮下脂肪细胞产品简介： 1、产品名称：小鼠皮下脂肪细胞 2、组织来源：小鼠脂肪组织 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠皮下脂肪细胞简介： 小鼠皮下脂肪细胞来源于小鼠脂肪组织，皮下脂肪细胞主要功能： （1）脂肪细胞能储存能量并参与身体代谢。 （2）脂肪细胞分化是一个发展的过程，它对代谢稳态和营养信号很重要。（3）前脂肪细胞存在于小鼠脂肪组织中，能根据能量的平衡增殖和分化成熟的脂肪细胞。前体细胞的增殖和分化能够增加脂肪组织的体积。 （4）前脂肪细胞与脂肪分化以及许多生理病理过程密切相关，如脂肪代谢、能量平衡、肥胖、糖尿病、高血脂和乳癌，所以小鼠皮下脂肪细胞对这些疾病的研究提供素材。

猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用2002

一，酶消化法制备猪胎儿成纤维细胞 猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用2002 1. 3. 1剪切猪妊娠35 d，剖腹手术取出子宫，用75% 的酒精浸泡消毒，无菌取出胎儿，用含双抗的PBS ( 137mmol /L NaCl 2. 7 mmol /L KCl 10 mmol /L Na2HPO4 2 mmol /L KH2 PO4 1 mmol /L CaCl20. 5mmol /L MgCl2 ) 漂洗2 遍，放入含双抗的PBS 中，分离2 个胎儿,放于塑料平皿中, 用无Ca 2+、Mg2+，含有双抗的PBS 缓冲液洗涤3 次, 洗至无色, 备用。将洗涤好的胎儿转移到另一平皿中,用无菌剪子剪掉头,四肢, 尾,去掉内脏, 继续用无Ca2+、Mg2+- PBS 缓冲液洗涤数次, 洗至无色, 将剩余的部分放入到100mm 的平皿中，然后用剪子将胚胎剪切成2～3 mm 小块, 将碎块转移到50ml离心管中。 1. 3. 2消化向放有组织块的离心管中加入二分之一离心管体积的0.25% Trypsin-0.04%EDTA 消化液（胰蛋白酶常用浓度为0.25%，PH为8.0。也有用胶原酶的，因为此酶消化温和，但是价格高，如果用胶原酶则为胶原酶+DMEM+Antibiotic-antimycotic，小鼠多用10ml离心管，因此加入胰酶消化液5ml即可）然后在室温下轻轻吹打组织块(或者，在37℃水浴摇床内消化)。室温消化15～20 min 左右（如果在37摄氏度最好在5min 内消化完）。可以边消化边吹打组织块, 也可以每隔5 min 吹打一次。消化结束后, 加入等体积的终止液10% 胎牛血清的DMEM 培养液(即吸出来细胞上层液如果多则放于到5ml 离心管中，如果少则放于1.5ml离心管中）,并轻轻吹打。 1. 3. 3离心、接种和培养800 r·min 离心5 min, 弃上清液, 然后加入5ml（或1ml) 的含20%胎牛血清的低糖DMEM 培养液培养基, 轻轻吹打重新悬浮细胞, 按常规方法进行细胞计数（1ml离心沉淀的细胞数=5个中方格中细胞个数X 5 X10 X1000 X稀释倍数，此时的计算值为体细胞的密度即个/ml. 大约徘徊在1-3 x 106个/ml）。以2×105个细胞/ mL(此值因为离心后又加入5ml,即稀释倍数为5.）的浓度接种于25 mL 预先2小时涂有0.1%明胶（来源：猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研究）的培养瓶中(根据具体情况加入4-5ml培养基，但是加入的培养基要求细胞的最终浓度为2 ×105个/ml)(或者转入到10mm平皿中，在38.5℃，5%CO2和饱和湿度培养）于39℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养。12小时候观察细胞贴壁生长状况，（原代培养24 h 后，可见细胞贴壁生长，来源：借助慢病毒将EGFP 基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞）一般在第二天换液，随后隔天换液，逐天观察，待细胞将80%-90%培养瓶铺满后即形成细胞单层，开始进行传代。一般消化1 个猪胎儿获得的细胞可接种 2 个50 ml的培养瓶。 如下图为传代培养第一代的西藏小型猪胎儿成纤维细胞图：

小鼠胚胎干细胞培养

以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液

小鼠肾成纤维细胞使用说明

小鼠肾成纤维细胞 小鼠肾成纤维细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠肾成纤维细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠肾成纤维细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠肾成纤维细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠肾成纤维细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞

小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结

小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结 2009-08-19 18:39:07 来源:未知【大中小】评论: 条 摘要：小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛 小鼠胚胎成纤维细胞的富集 1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。 2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。 4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml 胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。 6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。 7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。 8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。 9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。 10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。 11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。 12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。

13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。 注释： 我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。 培养基成分： 88％DMEM 10％FBS 1％NEAA 1% 双抗 对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。 小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代 1、移去MEF培养基 2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。 3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。 4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。 5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。 6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。 7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。 8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。 注释： MEF培养基成分：

胚胎翻译 DISCUSSION

Discussion 讨论 In the current study, we report the birth of live cloned piglets from cultures of fetal fibroblast cells. These cells were harvested from Day 25 fetuses before being frozen in liquid nitrogen for 2 yr. They were then passaged up to 12 times (approximately 40 population doublings) before nuclear transfer. Taken together, this result illustrates the utility of cloning for storing and multiplying genotypes and for transgenesis by enabling enough population doublings for selection of gene-targeted cells before nuclear transfer. We believe our success was due to the development of a porcine nuclear transfer system in which donor nuclei were exposed to unactivated cytoplasm for approximately 3 h before activation by chemical means. 在目前的研究中，我们报告了通过胚胎成纤维细胞培养出生的克隆活仔猪。这些收集的细胞来自在液氮中冷冻了两年的Day 25 胎儿。然后，在核移植前他们传代12次（约40倍群体倍增）。两者合计，为储存和繁殖基因型的克隆，并且在核移植前选择基因靶标细胞来确保足够的群体倍增和进行转基因组的克隆，结果表明这两者都是可利用的。我们相信，我们的成功是由于猪核移植系统的发展，它是用化学方法激活之前移植核供体暴露在未活化的细胞质中大约三个小时。 Exposure to unactivated oocyte cytoplasm is believed to facilitate remodeling and reprogramming of donor nuclei, [12, 22]. Unactivated cytoplasm contains high levels of active maturation promoting factor (MPF), which induces nuclear membrane breakdown (NEBD) and premature chromatin condensation (PCC) of transferred nuclei. Tani et al. [9] recently observed NEBD and PCC when bovine cumulus cells were fused with enucleated ova, regardless of the phase of the cell cycle in which donor cells existed. In the current study, we demonstrate the importance of fusing donor cells under calcium-free conditions to avoid concurrent activation in the majority of recipient cytoplasts. This was evident in the first experiment when 69% of cybrids that were fused in calcium-containing medium and not receiving chemical activation stimulus cleaved after 2 days of culture compared with only 10% of their counterparts fused under calcium-free conditions. Our finding contrasts with results in cattle in which reconstructed cybrids were found not to prematurely activate during fusion, despite the presence of calcium in the fusion medium [23, 24]. It is likely that there are differences between species with the ease at which recipient cytoplasts activate upon fusion. Other factors such as the age of recipient cytoplasts, source of oocytes (in vivo-matured or in vitro-matured), and fusion parameters utilized are also likely to influence the activation status of fused cybrids. 暴露在未激活的卵母细胞的细胞质中被认为是促进供体核的重塑和重新编程，[12，22]。未激活细胞质中含有活跃的成熟促进因子（MPF），它能诱导核膜破裂（NEBD）和移植核的染色体提早浓缩。当不考虑供体细胞中细胞周期的存在时，牛卵丘细胞与去核的卵子融合期间，，谷等人[9]，最近观察到核膜破裂和染色体提早浓缩。在目前的研究中，为避免在大多数受体细胞质中发生并发激活，我们证明了在缺钙条件下培养对于融合供体细胞的重要性。

小鼠胚胎干细胞mES小鼠iPS培养Protocol

小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养Protocol MEF细胞铺制： 1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至 少放置15 min以上。 2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一 个T25培养瓶中加入5 ml MEF完全培养液。 3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS 使用ICR-r P3 MEF，复苏MEF细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以 1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1?106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。 5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全 培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。 复苏： 1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使 之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。 3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液2 ml，吹打悬浮。 4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。 5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。 6. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。 传代： 1.一般在复苏后第2-3天传代，视克隆大小和密度而定。 2.吸除废液。 3.用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。

原代小鼠心肌成纤维细胞提取

原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法 1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用； 2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中； 3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）; 4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热 3min，适当振荡；[循环1] 5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2] 6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3] 7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5] 8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]； 9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。

小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养

小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养 一、实验材料 1．主要仪器设备 倒置显微镜、培养箱、离心机、25ml玻璃培养瓶、吸管；10ml尖底离心管、Ф80mm玻璃培养皿、青霉素小瓶、小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊） 2．试剂 RPMI 1640培养液、平衡缓冲生理盐水(PBS, pH7.2-7.4)、0.25%胰蛋白酶 3．实验动物 孕14～15天(E14～16)昆白母鼠，领自福建医科大学实验动物中心。 二、实验步骤 1. 获取小鼠胚胎 (1) 取孕14～15天的母鼠，断颈处死，置于蜡盘上 (2) 75％酒精消毒后，用剪刀和镊子剪开下腹皮肤，用两把弯头止血钳夹住切口处的 皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮，用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。 (3) 用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整 个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。将子宫置于无菌滤纸 上去除血迹。 (4) 在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的培养皿中，洗涤数次。 (5) 将子宫移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带 有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。 (6) 将胎鼠移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和 内脏，得鼠胚躯干。 (7) 将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的培养皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血 色。 2. 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块半消化法） (1) 将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪剪成 约1 mm3以下的碎块。 (2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底 离心管中。 (3) 室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。 (4) 向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻吹吸30秒（可 见组织块变得较为粘稠）。 (5) 加入1 ml 1640培养液终止消化，室温下静置5min，吸去上清液，留下鼠胚组织 碎块沉淀。 (6) 每个离心管内加入5ml 1640培养液悬浮鼠胚组织块，并接种到25ml的螺口的培 养瓶中（接种时应用滴管将组织块混匀）。 (7) 做好标记（如培养日期，细胞名称，编号），将装有鼠胚组织碎块的培养瓶放入37℃， 5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养。 (8) 培养的头两天不要晃动培养瓶，第三天可以观察，可见组织碎块附着于培养瓶底， 周围细胞呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有 的是呈圆形的上皮细胞。

小鼠胚胎干细胞的培养

小鼠胚胎干细胞分化为精子细胞的研究进展 郑晨光生科091 学号090304109 (河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018) 摘要:胚胎干细胞(ESCs) 是一种具有分化发育为三个胚层组织细胞潜能的全能性细胞, 哺乳动物的精子起源于原始生殖细胞(PGCs), ESCs 可分化为PGCs, 并进一步分化为精子细胞。通过在培养基中添加诱导分化因子(如维甲酸等) 或与希望诱导分化的目的细胞(如Sertoli细胞等) 共培养, 并通过鉴别ESCs分化为生殖细胞的各阶段特异性基因标志物 c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 获取不同阶段的生殖细胞。鼠的ESCs 已诱导出了不成熟的精子细胞, 但到目前为止尚无成熟精子培养成功, 且诱导分化的效率很低。 关键字：小鼠；胚胎干细胞；精子 胚胎干细胞是由哺乳动物早期胚胎分离克隆的一类未分化二倍体细胞, 能在体外增殖, 并能保持未分化状态。在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。目前, 已从ESCs 诱导出神经细胞、心肌细胞、肝细胞、骨细胞、胰岛素分泌细胞等。小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为精子细胞和卵母细胞, 人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。2003 年5 月Hubner 等成功将鼠胚胎干细胞体外分化为生殖系统的卵母细胞,并在Science 上报道了该成果。近来有实验室从小鼠ESCs体外分化产生雄性原始生殖细胞, 孵育分化后注入到卵母细胞可发育成囊胚, 且检验为正常的二倍体核型。本文从小鼠胚胎干细胞定向分化为精子细胞的基因标记和方法学2 个方面, 对ESCs 向精子细胞分化的最新研究进展作一综述。 1 原始生殖细胞的发育 雌、雄鼠合笼至母鼠见阴栓后(days post-coitum,dpc) 7 d ,鼠胚胎中出现原始生殖细胞(primordiralgerm cells, PGCs), 经过增殖, 移行到生殖嵴, 并继续分化为生殖干细胞(germ stem cells, GSCs), 这些细胞是精子和卵子发生的基础。大部分研究者都认为, PGCs 是生殖细胞最初的形式,小鼠胚胎在三个胚层形成时, PGCs同时出现。PGCs 从性腺原条移行到尿囊再移行到近端内胚层中, dpc 7 d 后在中胚层远端可观察到PGCs, dpc 8 d移行到尿囊再到原肠, 这被称为移行期PGCs, 在dpc 9.5-11.0 d , 移行至生殖嵴, 这一阶段被称为移行后期PGCs, 当PGCs 分化为生殖母细胞时, 睾丸或卵巢的结构就已经确立。对于雄性小鼠, 生殖母细胞一直停留在有丝分裂期直到出生后2 d , 然后到达输精管基底膜或者停留在管腔中退化, 那些存活下来的细胞则继续分化为GSCs, 经过多细胞分化阶段, 分化为精母细胞, 精母细胞减数分裂为精子细胞, 后者最终分化为精子。也就是说, 在雄性胚胎中生殖细胞要经历移行前期P G C s 、移行期PGCs、移行后PGCs 、生殖母细胞、A 型精原细胞、GSCs 和减数分裂前生殖细胞, 才形成成熟的精子。在这段复杂漫长的变化中, 有多种不同的特异基因的表达。 2 生殖细胞分化的基因标记 PGCs的很多标志物在未分化的ESCs 上也有表达, 摆在研究者面前的挑战就是如何区分这2种细胞。且ESCs 在分化为PGCs 的过程中, 各个阶段 的基因标记也不同。ESCs的分化依赖于特异基因表达, 在生殖细胞分化中起关键作用的基因有c - k i t 、V A S A 、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 这些基因的表达有阶段特异性, 即在生殖细胞的不同发育阶段, 它们分别稳定地表达, 从而成为原始生殖细

小鼠成纤维细胞原代培养.docx

实验-小鼠成纤维细胞的原代培养 一.实验目的 1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。 2 ?熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。 3?了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。 二.实验原理 自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物 理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。 如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传 代培养。 1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化 培养法。 组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶 中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。组织块培养法操作过程简 便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。 消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。该方法主要使用生物化学手段将 较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接 松散、相互分离，细胞失去与间质的连接，活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液，分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。胰蛋白酶

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养