细胞免疫荧光
细胞免疫荧光
简单实验步骤如下:
1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.
2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟
3.PBS洗净:3min＊3
4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS
5.PBS洗净:2＊5min
6.羊血清封闭：３７度，２０分钟
７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时
８.４度PBS洗净，３min＊５次
９.二抗３７度小于一小时
１０.３７度PBS洗净，３＊５min
凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）
活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备
（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、
胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
↓
用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为
5×10６～１×10７／ml
↓
取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)
的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS
稀释)灭活正常兔血清
↓4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右
1000rpm×5min
↓
弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠
(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇
↓4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右
1000rpm×5min
↓
加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入
1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，
视细胞浓度加入100～500μl固定液)
↓
FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
(标本在试管中可保存5～7天)
（二）试剂和器材
1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）注意事项
1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
附:
1. DPB S (×10, 贮存液)
NaCl 80g
KCl 2g 蒸馏水加至1000ml
Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
KH２PO４ 2g
2. 洗涤液
DPBS 900ml
FCS 50ml (终浓度5％)
4％NaN３???50ml (终浓度0.2％)
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖20g (终浓度2％)
甲醛10ml
NaN３0.2g (终浓度0.02％)
我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2％Triton X－100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
直接免疫荧光法测抗原
基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器
●磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
●荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释
●缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
●搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
●有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
●荧光显微镜
●玻片架
●滤纸
●37℃温箱等。
实验步骤
1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2.滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。
3.取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5.立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：
（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项
1.对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2.染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。
3.为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
（1）标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
（2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
（3）阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
4.一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
间接免疫荧光法测抗体
基本原理
染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。
试剂与仪器
●磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
●缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
●荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释。
●搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
●有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
●荧光显微镜
●玻片架
●滤纸
●37℃温箱等。
实验步骤
1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。
2.滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。
3.取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS 三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。
4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。
5.将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。
6.重复操作3。
7.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。
8.荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。
注意事项
1.荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。
2.每次试验时，需设置以下三种对照：
（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物
（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物
（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
3.已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
4.所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。
1、问：用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同？
参考见解：只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。
2、问：近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项？
参考见解：我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。我的经验是：
（1）选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
（2）我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
（3）我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
（4）封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
（5）其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
3、问：本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光，二抗为FITC标记，想请教各位大侠：
（1）抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行？
（2）封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片？
（3）免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用？
参考见解：
（1）你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光；
（2）封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明；
（3）关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶；2N盐酸需要使用，目的是使DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合。
4、问：做间接法免疫荧光染色，如何设置对照？
参考见解：最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。
（1）空白对照：如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。
（2）阴性对照：标本直接滴加二抗，呈阴性反应。
（3）抗原对照：标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。
5、问：我做乳腺组织的免疫荧光染色，结果用激光共聚焦显微镜看很好：有阳性信号，阴性对照组也没有荧光，但是拿到荧光显微镜下看，我的阴性对照组一片绿，像非特异性染色，到底哪个结果才是真实的呢？
参考见解：激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题，如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因，荧光显微镜没有问题，那就以共聚焦显微镜的结果为主。
免疫荧光技术基本原理（图）
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种免疫荧光技术（Immunofluorescence technique），又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。
用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。
由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。
1．原理
免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
直接法：将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
间接法：如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊断。
2．技术分类：
⑴荧光抗体技术（荧光显微镜技术）
抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。
⑵免疫荧光测定技术：
抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。
（1）荧光物质
1）荧光色素
许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：
(1)异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：
有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
(2)四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。结构式如下：
最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
(3)四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：
最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
（2）其他荧光物质
1）酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。
2）镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。
Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
（3）常见荧光素：
1）FITC
2）RB200
3）TRITC2
4）镧系：Eu3+、Tb3+
5）PE
6）其它
常见荧光素的特性：
1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490～495nm，发射光：520～530nm，明亮的黄绿色荧光。
2）RB200：橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光595～600nm，橘红色荧光。
3）TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光。
4）镧系：Eu3+、Tb3+
5）PE：吸收光490～560nm，发射光595nm，红色荧光。
6）其它：酶作用后产生荧光物质。
酶作用后产生荧光物质：
（4）合适荧光素的选择
1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。
2）荧光效率高，标记后下降不明显。
3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。
4）标记后能保持生物学活性和免疫活性
5）标记方法简单、快速。
6）安全无毒。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：
1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS （1：1）。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项
1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：
（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物；
（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物；
（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈
1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清。
5、其余事项同免疫荧光单标操作。
免疫组化中抗体选择要求
1、一抗选择要点
（1）选择单克隆还是多克隆抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等有所避免）。
（2）种属来源。一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。这条主要要与后面的二抗来源相匹配。
（3）实验目的是检测什么种属的抗原，即species reactivity。这一点很重要，一般说明书上都有注明，如小鼠Ms、大鼠Rat、人Hum等等。
（4）能否做免疫组化。一般一抗说明书都会注明做WB、IHC、ICC、IF等，建议最好选择注明的抗体，因为一般都是经过文章证明。
（5）检测标本类型。用于检测石蜡切片还是冰冻切片，一般能做石蜡切片的抗体，可能都可以用来检测冰冻切片，但能做冰冻切片的抗体，不一定能检测石蜡切片中的抗原。
（6）生产厂家。我的经验是国外著名抗体生产商原装抗体质量一般没问题，但有点贵；而国内分装厂家用的一抗工作液，价格便宜，但有时结果的稳定性和重复性稍差，尤其不同批次重复性较差。
（7）价格与质量的矛盾。我个人认为一抗原装质量可能会好点，因为许多一抗避免反复冻融，且在稀释液中稳定性较差（若时间长），但价格较贵。
2、二抗选择要点
（1）种属来源。主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。
（2）标记物的选择。有HRP、Biotin、荧光素等标记物。一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗，以与后面的SP结合反应；而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗，如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。这主要与后面有无三抗和三抗种类有关。
（3）选择IgM还是IgG。一般一抗是IgM，那么二抗就选择IgM；反之，一抗是IgG，则二抗选择IgG。
（4）生产厂家。一般SP三步法我们实验室选择中杉金桥的二抗染色试剂盒，内含有工作液的二抗，故试验中只需摸索一抗的浓度即可，效果还可以；而免疫荧光的二抗我一般选择Jackson ImmnoResearch公司，效果还不错。
免疫荧光与酶免疫组织化学方法的异同
1、概念和基本原理
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定位、定性、半定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性和组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免
疫组织化学方法种类现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。
免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，以达到对抗原物质定位、定性、半定量测定的目的。
2、标本制作
免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。
3、实验步骤
免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程、脱水等步骤。
4、染色后的标本保存
免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退，建议不要长期保存；而酶免疫组化染色切片经过脱水、透明和封片等可以长期保存。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光步骤集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻 璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室 温下作用1－2分钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如 大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗 （稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把 玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗 体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看 看那种方法合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat 的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti- rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵 育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的 IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三：
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
免疫组化和免疫荧光的区别[参照材料]
请问你曾经被IHC、ICC和IF所困扰过吗？ 作者：北京义翘神州 在实验中，有没有一种感觉，就是对免疫组化(IHC)，免疫细胞(ICC)，以及免疫荧光(IF)傻傻分不清，那么今天我们就来讨论一下这三者的区别，先贴图上来以便有个大致的区分。 从图中我们可以看出，免疫检测技术可以根据报告标签的不同，分为免疫化学和免疫荧光两类，而根据样品类型不同，可以分为组织和细胞检测技术。因此，才会延伸出三个相近的概念。 为了更好的区分这三个概念，我们还可以根据他们的英文词根来分析一下，他们的英文名分别是免疫组织化学Immunohistochemistry (IHC)，免疫细胞化学Immunocytochemistry (ICC)，免疫荧光Immunofluorescence (IF)。 词根分析： Immuno-指的是免疫技术（例如，抗体和抗原的结合） Histo-指的是组织（细胞以及它周围的细胞外基质） Cyto-指的是细胞（不包含细胞外的基质） Chemistry-在这里指的是化学检测方法（例如，颜色的变化）
Fluorescence-对被激发的荧光团的检测 通过对词根的解释，相信你在心中不再迷茫了吧。 这三个应用技术都属于免疫技术，都是将抗原与抗体的结合可视化，即通过一定的方法可以直接看到实验结果。而常用的方法就是化学显色和荧光显色。如果报告标签是酶促的，就是免疫化学，如果是荧光的，就是免疫荧光。 其实我们纠结免疫荧光的一个原因还在于免疫荧光的英文名字Immunofluorescence (IF)，但若是写成免疫组织荧光(IHF)或是免疫细胞荧光(ICF)，那我们是不是就豁然开朗了。虽然这两个词汇在英文文献中应用的还不是很广泛，但绝对不是我自己杜撰的哦，已经有些学者在使用了，规范化应该也只是时间的问题。 可能文字描述还是有些晦涩难懂，那我们就直接上图吧。先不看下面答案，仅从几张图片，你能明白哪张图代表哪种应用吗？ A免疫组织化学：兔EGFR单克隆抗体（10001-R043-50）—人胎盘
细胞免疫荧光步骤
方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分钟 使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面， 放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体 抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细 胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。 如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不 同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索， 我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对 照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三： 1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色 2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌 的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片
细胞免疫荧光步骤
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1 －2分钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿） 里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数 依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上 去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没 有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法 合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则 是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔 细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
免疫组化与免疫荧光的区别
免疫组化与免疫荧光 一、两者都是蛋白定位的检测（也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜）。 二、区别是： 1、概念和基本原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞，亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组织化学技术现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。 免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量。以达到对抗原物质定位、定性、定量测定的目的。 2、标本制作： 免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。 3、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。 4、染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。 5、免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量分析。 6、免疫荧光得到的图片是彩色的，漂亮些，可以发高档次文章。 免疫学三大工具：免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。
细胞免疫荧光步骤
方法一： 1. 首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2. 然后在 4％PFA 里面室温下固定 30 分钟， PBS 洗两次， 0.1% TX-100 室温下作用 1－2 分钟使细 胞膜通透。 3. 接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一 张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4. 剪一片合适大小的parafilm ，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS 中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定）， 每个玻璃片 30ul 足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育 30 分钟，然后在 PBS 里洗三次。 5. 接下来二抗孵育步骤同上。 6. 最后，在载玻片加上mounting medium （大约每个玻璃片加10ul）,把玻璃片放上去（细 胞面朝下）， 37 度 30 分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7. 抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做 WB 检测一下你的抗体，看看有没有杂带。 8. 双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。如果一 个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit 和 rat 的抗体，二抗则是不 同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC （绿）和donkey anti-rat-Tex-Red （红）。 2. 我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉 一抗 4 度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对 照是PBS+荧光标记物。 4. 封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常 donkey 血清。 5. 其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三： 1. 片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well 中直接染色 2. 细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌 的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片 3. 细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。 4. 其实小的 well 的话，可以直接拿来染色，没问题的。 5?固定：用PBS洗去培养液，用固定液(如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。。。)固定细胞。
免疫荧光通用操作规程
免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存 3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5） 6，室温封闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白
7，一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核5min， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块 2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min- xylene 2x10min- 100%EtoH2x10min 95%EtoH2x10min- 70%EtoH10min-，DDW5min
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤
细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤 1.爬片的准备 1)爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；用盖玻片时，可根据自己的需要 用小砂轮或玻璃刀剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；2)将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡过夜，第二天先用自来水冲洗20遍， 然后置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后高压消毒。高压消毒后取出放入烘箱中烘干，烘干后可放入超净台中备用。 3)可将爬片用多聚赖氨酸处理，以使细胞与爬片结合更牢固。1mg/ml的多聚赖 氨酸用的滤器过滤除菌后分装于经过无菌处理的1ml细胞冻存管内保存在4℃里，三个月内仍然可以使用。用时将高压灭菌过的爬片放到ml的多聚赖氨酸溶液内浸泡5min，无菌晾干即可（放入培养板孔内注意爬片的正反面）。 或将爬片铺于培养皿中，将多聚赖氨酸溶液滴于爬片上，室温10分钟后，吸除玻片上的溶液，在超静台内晾干后使用。储存、稀释和吸取多聚赖氨酸要使用塑料制品。 2.细胞爬片 1)胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中，充分吹打，使之成单细胞悬液， 计数。 2)根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内。滴加细胞悬液时，根据 爬片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，然后将爬片置于液滴上，压紧，使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，防止加细胞悬液时爬片漂起，造成双层细胞贴片。若细胞贴壁能力不强，爬片可经多聚赖氨酸浸片后放入。 3.细胞的固定及免疫荧光 1)在培养板中培养好细胞后，吸除培养基，一般先使用PBS轻洗细胞2×3 min， 然后再做固定（凋亡的TUNEL染色等可以不清洗）。 2)固定：加入4%多聚甲醛(PBS配制)固定20分钟。如果暂时不能立即做组化 检测，使用含%多聚甲醛的PBS 浸泡细胞（注意在免疫组化检测完成前不要让细胞变干，否则细胞收缩形态不好）。 3)除去多聚甲醛，使用PBS轻洗细胞3×3 min。 4)通透：%Triton X-100(PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略 此步骤）。 5)除去Triton X-100，使用PBS轻洗细胞3×3 min。 6)内源性过氧化物酶处理：3% H2O2孵育15 min（选作，二抗连HRP必需做， 其他的如做免疫荧光染色不用做）。
贴壁细胞的免疫荧光染色方法(ProtocolofImmunofluorescence(IF)onattachedcells)
贴壁细胞的免疫荧光染色方法 （Protocol of Immunofluorescence (IF) on attached cells）Materials: 1. PBS solution 2. 4% Paraformaldehyde (PFA fixative): Dissolve 4g paraformaldehyde in 100ml PBS solution, stir at 70℃ to dissolve; 3. PBS-T solution: (0.1% Triton X-100 in PBS solution) 4. PBS-B blocking solution: (4% BSA in PBS solution) 5. Primary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual, or, test from 1:50~200, should be more concentrate than application in Western blot; 6. Secondary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual Procedure: 1. Cultured cells, let it attach to the coverslips in 6-well plate; 2. Remove medium, rinse with PBS twice; 3. Add 2ml 4% paraformaldehyde, incubate at room temperature for 20 minutes; 4. Rinse with 2ml PBS three times, rinse for 5 minutes every time; 5. Permeabilize cells with 2ml PBS-T solution at 4℃for 10 minutes; 6. Remove PBS-T solution, rinse cells with PBS for 5 minutes at room temperature; 7. Block non-specific interaction with PBS-B solution at 37℃for 30 minutes; 8. Add primary antibody solution, incubate at 4℃overnight; 9. Remove primary antibody solution, wash with PBS for 5 minutes; 10. Add secondary antibody solution, incubate at room temperature for 1 hour; 11. Wash with PBS three times, 5 minutes each; 12. Add anti-fade DAPI solution if needed; 13. Observation.
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光步骤 【原理】用特异性抗体（第一抗体）与细胞中的相应抗原反应，洗去未与抗原结合的抗体再用荧光标记的第二抗体与结合在抗原上第一抗体结合，形成抗原-抗体- 荧光抗体复合物山于荧光素在荧光显微镜下经过特定波长的光照摄激发后能发射出荧光, 借此可对抗原定位和定量。【材料】培养细胞 【试剂】①4%的多聚甲醛。 ②PBSPH丝：XaC118 克，Na2HP04. 12H2012 克，XaH2PO4, 2H20 克洛于2000in 蒸懈水。 ③封闭血清：与二抗同种来源属性的非免疫血清。④第一抗体：XXXo ⑤第二抗体S与一抗种属性匹配TRITC标记的，（中杉金桥公司，ZF-0313GoatAnti- MouseIgG(H+L),)。 ?DAPI:（碧云天公司，Cat. C1006）染核。⑦抗荧光淬灭封片剂:碧云天公司Cat. P0126 【器材】冰箱，载玻片，盖玻片（做正面标记），微量移液枪，移液枪枪头，吸管，湿盒，指甲油，DOCK笔，EP管，吸水纸，六孔板，摇床，振荡器。 【配制液体等】（D%-Triton：（PBS+lIj于Triton 比较粘，配前先在室温放会儿，磁力搅拌器搅匀可分装储存）②10%正常封闭血清：（用 PBS-Triton稀释，振荡器 上振荡充分混匀，临用前配制）。 ③%-Tween；用PBS 稀释Tweeno 【步骤】 1取出生长48小时的细胞爬片，移入一个干净的六孔板冷PBS浸泡不超
过3分钟（事先在六孔板的第一排三个孔分别标记）。2每个玻片滴加4%的多聚甲醛冰上固定14分钟。注怠，要水平，覆盖均匀。（准备封闭血清用PBS-Triton稀释1:10振荡器上摭荡混匀）。3冷PBS, 5分钟X2次摇床ISOrpm缓慢洗净，PBS-Triton透膜5inin。 （如果是胞浆，核或膜内表面表达需要这一步，如果是膜外表面表达的则不需要透膜） 4擦干爬片边缘，用DOCK笔在爬片四周边沿画圈（以防止爬片上所加试剂因失去张力流 失，导致干片）。将爬片分别放入六孔板下排与上排标记相对应的孔内（该加封闭血清了，此时要求板是干燥的，下一排板没用过是干燥的）。 5用微量移液枪，在每张爬片上加10%正常封闭血清，室温湿盒中阻断SOmino （准备一抗，用PBS-Triton稀释抗体1:100振荡器上振荡混匀）。 6—抗孵育：加已经稀释好的一抗，用微量移液枪小心加一抗，（逐个片去封闭液，擦干 圈外水，加一抗注意：不要碰细胞）置湿盒中，40冰箱过夜，剩余的一抗保留。7?次日，轻轻去盖，査看张力还在。轻轻移至室温，湿盒内再孵育1小时。注意不干片。 8PBS-Tween洗，3次xSmin （据情况适当变化），o 9将爬片四周擦干，再将其分别放回六孔板上一排原先的孔内。（加二 抗，上一排板已干，所以再移回上一排板中）。10.避光处，加二抗覆盖均匀平放室温孵育一小时（山于试剂会挥发,
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。 zo-1的免疫荧光，步骤如下： 1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。 2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟 3、4%的甲醛室温固定20-30分钟 4、1×PBS洗3次，每次10分钟 5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟 6、1×PBS洗3次，每次10分钟 7、5%BSA室温封闭30分钟 8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜 9、1×PBS洗3次，每次10分钟 10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!! 11、1×PBS洗3次，每次10分钟 12、95%甘油封片 注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释 从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光 细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致： 1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。 注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。 2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。 3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。 5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。 6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。 7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。 8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。 建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。 细胞免疫荧光简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min*3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2*5min 6.羊血清封闭：37度，20分钟 7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度1-2小时 8.4度PBS洗净，3min*5次 9.二抗37度小于一小时 10.37度PBS洗净，3*5min 凉干封片(封闭液PH8.5) 不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
免疫荧光原理
免疫荧光（Immunofluorescence, IF）原理 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤： （1）细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次； 对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 （2）固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。 （3）通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3×5 min。
细胞免疫荧光详细步骤
细胞免疫荧光步骤 【原理】用特异性抗体（第一抗体）与细胞中的相应抗原反应，洗去未与抗原结合的抗体再用荧光标记的第二抗体与结合在抗原上第一 抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体复合物由于荧光素在荧光显 微镜下经过特定波长的光照摄激发后能发射出荧光，借此可对抗 原定位和定量。 【材料】培养细胞 【试剂】①4%的多聚甲醛。 ②PBS (0.18M PH≌7.2) ：NaCl 18克，Na2HPO 4. 12H2O 12克， NaH2PO4,2H20 0.8克溶于2000m蒸馏水。 ③封闭血清：与二抗同种来源属性的非免疫血清。 ④第一抗体：xxx。 ⑤第二抗体：与一抗种属性匹配TRITC标记的，（中杉金桥公司，ZF-0313 Goat Anti-Mouse IgG (H+L),）。 ⑥ DAPI ：（碧云天公司，Cat. C1006）染核。 ⑦抗荧光淬灭封片剂 : 碧云天公司 Cat .PO126 【器材】冰箱，载玻片，盖玻片（做正面标记），微量移液枪，移液枪枪头，吸管，湿盒，指甲油，DOCK 笔，EP管， 吸水纸，六孔板，摇床，振荡器。
【配制液体等】①0.5%-Triton ： ( PBS 99.5ml +0.5mlTriton 由于Triton 比较粘，配前先在室温放会儿 ,磁力搅拌器搅匀可分装储存) ②10% 正常封闭血清：( 用PBS-Triton 稀释，振荡器上振荡充分混匀，临用前配制)。 ③0.3%-Tween ；用PBS稀释Tween。 【步骤】 1 取出生长48小时的细胞爬片，移入一个干净的六孔板冷PBS浸泡不超 过3分钟（事先在六孔板的第一排三个孔分别标记)。 2 每个玻片滴加4%的多聚甲醛冰上固定14分钟。注意，要水平，覆盖均匀。（准备封闭血清用PBS-Triton稀释1:10 振荡器上振荡混匀）。 3 冷PBS,5分钟X2次摇床150rpm缓慢洗净，PBS-Triton透膜5min。（如果是胞浆，核或膜内表面表达需要这一步，如果是膜外表面表达的则不需要透膜） 4擦干爬片边缘，用DOCK 笔在爬片四周边沿画圈（以防止爬片上所加试剂因失去张力流失，导致干片）。将爬片分别放入六孔板下排与上排标记相对应的孔内（该加封闭血清了，此时要求板是干燥的，下一排板没用过是干燥的）。 5用微量移液枪，在每张爬片上加10% 正常封闭血清，室温湿盒中阻断30 min。（准备一抗，用PBS-Triton稀释抗体1:100 振荡器上振荡混匀）。 6一抗孵育：加已经稀释好的一抗，用微量移液枪小心加一抗，（逐个片去封闭液，擦干圈外水，加一抗注意：不要碰细胞）置湿盒中，4o冰箱过夜，剩余的一抗保留。
免疫荧光方法[1]
免疫荧光方法 免疫荧光(Iｍｍｕnofｌｕorｅscｅｎce, IF）实验 方法 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质和定位,以及利用定量技术（比如流式细胞仪)测定含量。 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等.细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步,细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单,如果发生细胞掉片,一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Ｓｌides or Cｏverｓｌips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门,非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法,合适的固定剂和固定 程序对于获得好的实验结果是非常重要的.免疫荧光中 的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Wｅstern Bloｔ）中的相同步骤是类似的,最重要的区别在于免疫
荧光实验中要用到荧光抗体,因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是,标记好荧光的细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在4℃或—20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果....感谢聆听... 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像ＷB 那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外,还必须设立严谨的实验对照。总之,免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照,每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。...感谢聆听... 基本实验步骤： （1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中, 待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤 （1000rpm,5min）２次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。...感谢聆听...