碱性磷酸酶测定方法(磷酸苯二钠比色法)

磷酸酶

磷酸酶能酶促有机磷化合物的水解。试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况）。

基本原理：

土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、ɑ-或?-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。当它们被酶促水解时，能析出无机磷和基质的有机基团。因此磷酸酶活性的测定时测定基质水解后的无机磷或酚的部分。这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。该法可用于测定各种磷酸酶的活性：碱性磷酸酶（用PH10的硼酸盐缓冲液），中性磷酸酶（用PH7.0的柠檬酸盐缓冲液），酸性磷酸酶（用PH5.0的乙酸盐缓冲液）

试剂配制：

1）甲苯

2）0.5% 磷酸苯二钠

3）硼酸盐缓冲液（PH9.6与PH10.0）：称取12.404g硼酸（H3BO3）溶于700ml 去离子水，用稀NaOH溶液调节至PH10.0，用去离子水稀释至1000ml

4) 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%的乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。

5）标准溶液：（a）母液：1g酚溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml，溶液保存在暗色瓶中；（b）工作液：10ml溶液（a）稀释至1000ml（1ml含10ug酚）6）0.3%硫酸铝溶液

标准曲线绘制：

取0，1，3，5，7，9，11和13ml酚工作液（b），置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以光密度为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。

操作步骤：

1）取5g风干土置于200ml三角瓶中，用2.5ml甲苯处理

2）处理15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠

3）将反应混合物置于37℃恒温箱中，培养24h后，在培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液用致密滤纸过滤。

4) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照

5)无基质对照：对每个土样，设置以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。

6）比色程序：

取滤液3ml置于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓

冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm处比色。

结果计算:

磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示：

酚（mg）=a×8

式中，a——从标准曲线上查得的酚毫克数

8——换算成1g土的系数

以24h后1g土壤中释放出的酚的质量（mg）表示磷酸酶活性。

磷酸酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m

式中：a样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；

a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；

a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；

V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；m表示烘干土重