基因变异的研究方法与进展

基因变异广义上说就是指基因结构变化从而产生了可遗传的变异。也就是说DNA水平上的突变造成的基因改变。而这一突变过程可能有很多原因，有自发性的，比如DNA配对过程中的装配错误，也有外源性的诱导因素，如物理，化学，生物因素等造成染色体结构改变或者基因结构的直接变化。

突变的形式多种多样，常见的有：点突变，即一个或多个核苷酸发生了改变；框内突变指的是3个或是的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加1个或几个氨基酸；除此之外，还存在着DNA大片段的缺失，通常是指几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。

这其中，最常见的莫过于点突变，他是指一个或者几个核苷酸的缺失或改变，通常会形成三种类型，第一种是同义突变，即碱基替换后，虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码的兼并性），亦称静止突变，第二种是错义突变，指的是碱基替换，密码子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基酸，第三种是无义突变，即碱基替换后，使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。

基于上述的变化，常见的基因变异研究方法有如下几种

一、筛选性方法

有人将这类方法分为2类，根据电泳性质不同及其他包括化学修饰法等

1 RNase 法

该法是一种最早提出的检测DNA突变的方法口。其原理是RNase可以识别RNA：DNA或RNA：RNA杂交链中错误配对的碱基并将其切断。经聚丙烯酰胺凝胶电泳将正常链及被切断的含有突变点的链区分开来。杂交方法是将同位素或其它方法标记的正常野生型RNA 片段与相对应的待测DNA 片段混合，90"C

左右变性并在室温下复性形成杂交分子。当待测DNA 片段中存在碱基突变时，在该位点上二条链不能正常配对，便成为RNase的识别和切割位点

2 DGGE、CDGE、TGGE、TSGE法

梯度变性凝胶电泳（DGGE）原理是当双链DNA在梯度变性的聚丙烯酰胺凝胶中行进到与DNA变性温度(熔点温度)一致的凝胶变性浓度位臵时，DNA 发生解旋变性此时电泳速度迅速降低。而当解旋的DNA链中有一个碱基突变时，将会影响其电泳速度变化的程度，从而将正常与突变的DNA区别开。

CDGE(constant denatural gel electrophoresis)法通过预实验或理论计算预先精确确定待测DNA片段的熔点温度后采用单一变性浓度凝胶电泳，简化了DGGE 法的操作

类似于CDGE法，TSGE (temperature sweep gel electropnoresis)法则取消了温度梯度而代之以单一温度

这类方法的优点是：(1)检出率高，～100 (2)可用于分析突变——正常DNA 混合样品；(3)可以回收分离出的DNA 片段；(4)可以直接测定未经扩增的DNA 。这类方法的缺点也很多，如(1)分析片段较小，<500 bp；(2)需要制备昂贵的GC clamp(3)需要事先经过复杂的计算机处理计算熔点温度或预试验确定变性条件；

(4)位于高度富含GC的片段中的突变可能漏检。鉴于以上不利因素，DGGE等一类方法有逐渐被SSCP(单链构象多态性)法取代的倾向。尽管如此，这类方法一经建立，应用十分方便，适于大规模样品分析

3 SSCP法

单链构象多态性(single strand conlotraation polymorphism，)是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA或RNA分子依其碱基序列不同而形成不同构象，

一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变SSCP的最大优点是筒单易行。SSCP与PCR(聚合酶链反应)相结合使其成为目前基因突变研究中最为推崇的工具之一。。PCR扩增产物变性形成单链后，其构象及电泳迁移速度可因单个碱基突变而出现差异并形成多态性。在低温条件下，单链DNA呈现一种由内部分子相互作用形成的三维构象，它影响了DNA在非变性凝胶中的迁移率。相同长度但不同核苷酸序列的DNA由于在凝胶中的不同迁移率而被分离。迁移率不同的条带可被银染或者荧光标记引物检测，然后用DNA 自动测序进行分析。用PCR-SSCP 技术可以进行序列差异的测定，而敏感度会随着片段长度的增加而降低

4 HET法(heteroduplex analysis)

HET法直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型——野生型DNA双链。其原理是杂交的双链中由于存在配对错误使双链片段的构象形态发生改变而影响其在凝胶上的泳动速度

5 化学裂解法

将待测含突变DNA 片段与相应野生型DNA 片段混合变性杂交，杂交双链中突变点处不能配对结合而游离出结合基因，因而可用某些化学物质加以修饰然后从该处将其裂解。羟胺可修饰胞嘧啶，四氧化锇修饰胸腺嘧啶，

然后用哌啶从修饰处将被修饰的单链裂解，经聚丙烯酰胺电泳分离出长短不等的片段

6 碳二亚胺法

类似化学裂解法法，该法也是利用化学物质的修饰原理。CDI能同时修

饰鸟嘌呤和胸腺嘧啶。突变——野生型DNA杂交双链中突变点上不能配对的碱基G或T被CDI修饰，在此后的扩增复制中，DNA链的复制被阻断在该

修饰点，从而产生出短链产物，经电泳分离鉴定

7 直接序列分析

直接级的序列分析经常被用作参比方法以及最终确定一个新发现的突变的确切位点和突变性质。

二、诊断性方法

1 杂交法

1.1 Southern blot是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

1.2 等位基因特异性寡核苷酸杂交（ ASO）要求设计两段寡核苷酸探针，其中包含发生突变的位点，一段与野生型链互补，一段与突变型链互补。从而杂交分析是否突变。

1.3 基因芯片：SNP位点的检测：测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位臵的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位臵，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。基因

芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（Southern Blotting 和Northern Blotting 等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。

1.4 荧光原位杂交该项技术的基本原理是应用Digoxyginin或Biotin标记探针DNA（Nick translation 标记法），变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交。在荧光显微镜下观察并记录结果。可以用于基因定位，检测染色体的结构和数码异常，也可用于遗传病的诊断和产前诊断，是基因变异研究的比较有效地研究方法。

1.5 比较基因组杂交其基本原理是用不同荧光物质分别标记待测DNA和正常对照DNA，然后与正常人中期细胞染色体杂交；通过检测染色体上两种荧光信号的相对比值，了解待测DNA拷贝数的变化，并可在染色体上定位，目前已广泛应用于基因组不平衡的检测

2 扩增法

2.1 ARMS法（amplification—refractory mutation system）。

该法要求制各3个PCR引物，其中2个引物3 。末端分别为待测DNA中突变位点的突变碱基及正常碱基。另一个为正常对侧引物。当分别经过PCR扩增后，正常引物对仅将正常DNA扩增，而含突变碱基的引物对则将突变DNA 链扩增，然后用电泳分离鉴定是否存在扩增产物

2.2 RFLP-PCR法

从ARMS法衍生而来。引物对中一个引物的3 ′末端区同时含有突变点及一个限铷性内切酶识别点。被扩增的待测DNA 中是否存在突变，将影响内切酶的识别。含酶识别点的片段被酶切割并通过电泳将其与未经切割的产物分离开来2.3 QM-PCR

定量多重PCR技术，这项技术是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。所以他涉及至少2个基因的多个DNA片段在一个反应管内同时进行PCR扩增，其中DNA片段作为参照序列，其余作为检测序列；其次要控制PCR循环数，使PCR产物增加处于对数增长曲线内，然后PCR产物于DNA测序仪电泳，其结果经GeneScan处理。最后检测序列PCR产物与参照序列PCR产物的比值计算模版DNA相对拷贝数，确定是否存在检测外显子的杂合性缺失。

2.4 LCR法

是设计制备2个紧密相邻的核苷酸链(20~25个碱基)探针，臵待测突变点位于该2个探针的相邻点处某个核苷酸链的3′或5′端。当这时探针与模板杂交复性后，用耐热Taq连接酶将其连接并复制。当摸拟中存在突变时，探针末端便不能与模板完全杂交而影响连接酶的连接和复制，从而不能扩增出PCR产物。通过电泳法最后鉴定产物的存在与否

2.5 多重探针连接依赖性扩增技术（MLPA）

MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片

段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备；每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。

3 MREC法

根据已知突变位点和类型设计不同杂交探针。当检测点为G：C配对则探针相应点设计为A；检测点T：A配对时则探针为G。将待测DNA链与探针杂交后用Mut Y酶切割并用聚丙烯酰胺凝胶分离。由于Mut Y酶只切割碱基“A 所在链，因此必须标记“A”所在链

总结

近几年来，由于PCR技术的发明，大大促进了基因突变检测研究的发展和应用。分析自动化、非同位素标记及检出率和灵敏度的进一步提高，将是基因突变检测方法发展的未来方向，从而使基因突变的研究进入临床应用实验室

我觉得未来发展中以下几项技术会取得比较大的突破，首先就是DHPLC。DHPLC是近年来建立并迅速发展一种新型基因突变筛查技术，既能够自动化、高通量进行，且除PCR之外，勿需进行PCR引物修饰、购买特殊试剂、检测标记信号或作其它的样品处理。而目前已有的许多DNA突变分析技术诸如SSCP 、DGGE等均不能满足此要求。DHPLC具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优点。与传统的SSCP 、DGGE等方法相比，DHPLC有较多的优点。SSCP的结果受血样质量、提取方法等因素的影响，并且需要跑胶、电泳；DGGE则需要标记引物，存在放射性污染，这两种方法都比较费时费力。而DHPLC则高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只需要8分钟左右。DHPLC与其他检测DNA突变方法的最大不同在于，它能够纯化DNA片断。当然，只能检测杂合突变是DHPLC的不足之处，但是这可以利用混合的方法（即将纯合突变样品和野生型样品混合）来解决。

其次就是MLPA，该技术结合了DNA探针杂交和PCR技术，具有以下优点1、高效：一次反应可以检测45个靶序列拷贝数的改变。2、特异：可以检测点突变。3、快速：一次实验可以在24小时内完成。4、简便：不同的试剂盒操作基本相同，容易掌握。不过即使如此MLPA也有其局限性：1、需要精确测量DNA的浓度，样本容易被污染。2、不能用于单个细胞的检测。3、MLPA用于检测基因的缺失或重复，不适合检测未知的点突变类型。4、不能检测染色体的平衡易位。所以这些问题需要很好的解决才能得到更好的发展。

而发展最迅速的莫过于CGH，目前已经发展出了高分辨CGH (HR-CGH)，阵列- CGH，寡核苷酸阵列CGH (oaCGH) 等。