Western blot发光检测中常见的问题及解决方法

免疫印迹试验（Western blot）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL，文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。

众所周知，Western blot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。

Western blot显色的方法主要有以下几种：一、放射自显影，二、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL。

ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。ECL法操作简便，应用现成的试剂盒，按照说明，将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影、定影（或用荧光检测仪检测）。ECL 法具有灵敏度高，线性范围广等特点。

图1 ECL检测原理图

Western blot发光检测受多种因素影响，主要包括：抗原含量，抗体敏感度，底物敏感度，显影和定影效率，等。现根据检测中几种常见的现象问题进行分析：

1.目的蛋白信号弱或无。在Western blot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。曝光时间短也会使蛋白信号降低，因此，要延长胶片的曝光时间。

2.背景较高。背景深是在Western blot发光检测中最常见的问题，造成背景深的原因很多。第一，封闭的问题，封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜；实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错，但二抗与牛奶可能有交叉反应，因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脱不彻底也会导致背景深，适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色。第三，条带背景深也与曝光时间有关，曝光时间超过半小时出现背景是很正常的，所以可以的话建议曝光1-10min。英格恩公司生产的Westernblot 发光试剂Enlight TM含独特的发光增强剂和精准的发光底物，比普通发光试剂灵敏度更高、更稳定，而且发光时间长，背景更低。第四，抗原-抗体浓度/HRP过高时，直接或间接结合在膜上，洗脱不掉等原因，考虑降低抗体浓度或蛋白上样量。

图2 Western blot发光检测中常见的问题及比较

3.非特异性条带。非特异性条带与抗体交叉反应有关。单抗比多抗特异性好，纯度高，另外适当稀释一抗/二抗浓度，也是有必要的。如果样本在处理过程中发生降解，则样本处理时加入蛋白抑制剂在冰上操作。

4.显影后膜上条带处变为黄色或为白色。可能是HRP过高导致的敏感性或背景太高，应降低抗体浓度。

5.条带内无显影的白点与转膜和显影的操作有关。转膜前尽量将膜平衡，并注意胶和膜之间避免气泡，显影时膜与X光片间也应避免气泡。

6.散在小圆斑是牛奶封闭液中的杂质颗粒导致的，解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存，使用时勿混匀，仅用上层。

Western blot发光检测中常见问题及解决办法

现象原因解决办法

信号弱或无HRP过高引起底物迅速

耗竭

稀释一抗/二抗

抗体-抗原系统敏感性

过低

提高抗体浓度/蛋白上样量

转膜不充分/过转优化转膜条件

HRP或底物活性降低测试活性或选用敏感底物高背景HRP过高(背景较高)稀释一抗/二抗

封闭时间不足延长封闭时间4度过夜最好

抗体与封闭液有交叉更换封闭液(如3%BSA的TBST)

TBST洗脱不足增加洗脱时间、次数、用量

曝光时间过长降低曝光时间

抗原-抗体浓度过高降低抗体浓度或蛋白上样量

条带内无显影的

白点转膜不良（如有气泡在

胶-膜之间)

精细操作

膜平衡不均/油脂污染按说明书平衡膜/戴手套用平头

镊子持膜

膜与X光片间有气泡显影前去除气泡

非特异性条带抗体交叉反应稀释一抗/二抗

散在小圆斑封闭液有杂质颗粒静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上

层

HRP过高(背景较高) 稀释一抗/二抗

反影(白色条带,黑

色背景)

显影后膜上条带

HRP过高(敏感性太高) 稀释一抗/二抗处变为黄色

底物化学发光ECL是Western blot最常用的显色方法之一，因此，熟悉并掌握其中最常出现的问题及解决办法是做好Western blot发光检测的基础。

(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）

1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）转膜杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被

westernblot详细图解

检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项

蛋白印迹——Western blot 实验流程及注意事项各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。实验步骤 1.配制分离胶5ml（配方见图1）； 2.将液体用1ml移液器加入玻璃板（从玻璃板的边缘加入，速度适中，尽量不要产生气泡）； 3.用去离子水压胶（利用重力作用把胶压平，否则如果有气泡，胶就不平了，影响电泳效果。注意上面盖一保鲜膜，防止液体挥发）； 4.大约1第二天一早配制堆积胶）， 5.倒掉玻璃板上面的水并用滤纸吸干，加入堆积胶，并插入梳子； 6.约1小时后堆积胶凝固，把玻璃板转移到电泳装置并加紧（防止漏液）； 7.将电泳装置内加入电泳缓冲液并观察是否漏液； 8.拔掉梳子，用微量注射器冲洗上样孔，加入和上样缓冲buffer混合变性的蛋白；①蛋白上样量：20-50μg；②上样缓冲液：加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×；③上样最大体积：根据梳子孔径和玻璃板的距离而定，一般我们用的上样最大体积在30ul左右；④蛋白变性：上样前要将样品于沸水中煮5-10min 使蛋白变性。可以使用PCR仪进行变性，99℃5分钟，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：a. EP 管容易炸开，样品丢失；b. 容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量； 9.在电泳槽中加入电泳缓冲液； 10.恒压80V 30分钟，100V 2小时左右，溴酚蓝跑到底即可（电泳时间可以根据自己目的蛋白的具体条件设置，一般4～5 h，电压为40V 较好，也可用60V。）；

Western Blot常见问题及处理总结

免疫细胞研究western blot Western Blot常见问题及处理总结阿木 1、western blot 的优点答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便，特异性高。 2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。 3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？

答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。 4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。 5、我的目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。 6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改

变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。 7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。 8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二抗失活。

蛋白Western blot电泳——试验中常见问题及解答

蛋白质电泳与western blot1 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。（1）原理（2）分类 ①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色（3）主要试剂（4）主要程序（5）实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题 3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题 9. 条件的摸索10. 方法的介绍 11. 结果分析（1）原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。（2）分类 ①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。（3）主要试剂 1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和 1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、，1mlH2O去离子水配制，室温保存。 3、分离胶缓冲液:1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C 保存。 4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05g Tris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。 5，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制. 6.1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。 7缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

Western Blot 实验详解

Western Blot实验详解一、实验材料 Western Blot相关试剂： 2×Sample Buffer：1ml Glycerol（甘油）;0。5ml Beta mercaptoethanol（β-巯基乙醇）; 3ml 10%SDS; 1。25ml 4×Upper buffer; 4。25ml dH2O; Add bromophenol blue （溴酚蓝）to color。4×Upper buffer：60。6g Trizma Base(氨基丁三醇); 20ml 20%SDS; Add dH2O to 1000ml; 用盐酸调pH 至6。8。 10×电泳缓冲液（pH 8。3）：在1L大烧杯中加入800ml去离子水，称取Tris 30。2g、甘氨酸188g，混匀，加入100ml 10%SDS(10g)，定容至1L。（注：SDS在68℃水浴中溶解）。工作液：1×电泳缓冲液去离子水稀释室温保存。 1。5M Tris-HCl(pH8。8)：Tris 181。7g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH8。8，定容至1L 室温保存。 1M Tris-HCl(pH6。8)：Tris 121。1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7。5，定容至1L 室温保存。 10×TS(洗膜液)：在800ml去离子水，加入Nacl 90g，1M Tris-HCl(pH7。5) 100ml，去离子水定容至1L。工作液：1×TS 室温保存。 1M Tris-HCl(pH7。5)：Tris 121。1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7。5，定容至1L 室温保存。 10%SDS：称取十二烷基磺酸钠（SDS）10g，加入约80ml去离子水，68℃加热溶解。用10%HCl 调pH至7。2，定容至100ml。 1×Transfer Buffer：在1L大烧杯中加入800ml去离子水，加入3。03g Trisgrams，14。43g 甘氨酸，最后加入200ml甲醇。4℃保存。 30%储备胶：丙烯酰胺Acr 29。0g、亚甲双丙烯酰胺（Bis）1。0g，混匀后加入去离子水37℃溶解，定容至100ml。4℃避光保存。 10%AP（过硫酸铵）：称取1gAP，加入10ml去离子水搅拌。分装，-20℃保存。Western Blot相关仪器：电泳仪；转移仪；摇转仪。二、实验原理经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。三、操作程序与结果判定

western blot实验经验总结

western blot实验经验总结 1.抗体的选择对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。在这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot 实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。效价非常不错，夸张的时候1：10000都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。如果读书非常悠闲，老板又特别想拥有手工作坊的情况下，可以自己伺候折腾兔子来玩玩，刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和制备多抗，是不是可以写成论文毕业，估计因校而异了。 2.Western Blot设备目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad（伯乐），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶，但通常用不上，由此造成垂直缓冲液的浪费，而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽，容易漏液，塑料夹应该是有疲劳寿命的，估计日子一长，弹性就会改变，所以如果你们实验室刚买了MINI4，赶紧用，遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。 Biorad的一套系统得两万多，西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明，上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样，而且可以通用，不带电泳仪是5千多一套，挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐，胶架容易断裂。不过仔细算算，三套天能也就是一套伯乐的价格，值了。北京六一的垂直槽

蛋白质印迹法westernblot

蛋白质印迹法蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法类似方法2 Northern Blot 杂交方法使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴

原理与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色

WB免疫印迹实验常见问题全汇总

【干货收藏贴】WB常见问题精品全集锦做了很久的WB（western blot），走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。以下，我们先解决很多技术菌的疑惑，然后再着手汇总实验中常见问题和可能原因分析以及给出建议解决方案。 WB常见问题分析 1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？原因有很多： a) 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞； b) 细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性； c) 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题； d) 酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。 2.我做的蛋白质分子量很小（10KDa），请问怎么做WB？ a)可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可； b)也可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用 Tricine-SDS-PAGE体系。 3.我的目的带很弱，如何加强？ a)可以加大抗原上样量，这是最主要的； b)也可以将一抗稀释比例降低； c)还可以延长曝光时间。 4.DAB好还是ECL好？ DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物； ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。 5.胶片是一片空白，是怎么回事？如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光； b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活； c) ECL底物没覆盖到相应位置； d) 一抗选择不当二抗失活； e) 二抗失活。

western-blot实验方法

western-blot实验方法 1、试剂耗材的准备：（1）转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl，39 mM 甘氨酸，0.037% SDS，20%甲醇）：（2）10 ×丽春红染液：（3）TBS 缓冲液：（4）TBST 缓冲液（含20%Tween20 的TBS 缓冲液）：（5）封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液）：（6）一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或TBST 进行稀释。（7）底物显色液 ECL，4℃避光保存，现用现配。（8）显影液和定影液用水稀释10 - 20 倍于铝盒中，可多次使用。室温避光存放。 2、实验步骤：（1）蛋白样品制备：用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度。

（2）取1 mg 蛋白进行SDS-PAGE。（3）转膜：（转膜缓冲液4 ℃预冷备用，冷却装置于- 80 ℃冰箱冷冻备用）。（4）将2 张海绵垫、2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。（5）戴上手套，剪一张与凝胶尺寸相近的PVDF 膜（83 mm × 75 mm），左上角剪一缺口作为标记，浸泡在盛有20 mL 甲醇的平皿中约15 sec，直到膜变半透明。用纯水冲洗膜2 次。浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。（6）SDS-PAGE 结束后，小心地剥下两块凝胶，一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。海绵垫、滤纸、PVDF 膜及凝胶的预平衡时间在15 min - 1 hr 之间。（7）将转膜夹子打开，使黑的一面保持水平。按照海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸和海绵垫的先后顺序铺垫，制备凝胶转移夹层。将膜与凝胶对齐。用玻璃棒赶走气泡。（8）将夹子夹起来，扣紧，小心不要移动内层。放入电转槽中。使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。（9）将电转槽放在冰水盒中。将预冻的冷却装置放入槽内。缓慢倒入约650 mL转膜缓冲液。（10）盖好盖子，接上电源。根据蛋白分子量来调节工作电流，一般使用100 V（350mA），转移60 - 90 min。（11）转膜结束后，断开电源，拆卸转膜夹子，逐一掀去各层。将膜用1 ×丽春红染色5 min，用水冲洗3 次，观察蛋白转印是否完全。同时也可将凝胶用考马斯亮蓝染色，胶上无蓝色条带则说明蛋白转印完全。（12）免疫反应： I 封闭：用镊子将膜移至含有25 mL 封闭液的平皿中，用脱色摇床室温缓慢摇匀2 hrs，或 4 ℃过夜。封闭完用TBST 冲洗 5 sec。用吸水纸吸去残余液。 II 一抗孵育：按照一抗说明书的推荐比例稀释一抗，使用TBST 或封闭液稀释。在一容器中，将PVDF 膜浸没在抗体溶液里，室温下2 hrs 或4 ℃过夜，摇床缓慢摇匀。 III 一抗孵育完后，用TBST 室温下在摇床上洗3 次，每次10 min。 IV 二抗孵育：同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下摇床缓慢摇匀1 -2 hrs。 V 二抗孵育完后，用TBST 室温下在摇床上洗3 次，每次10 min。（13）显影和定影： I 将ECL Plus 显色液的A 液和B 液在容器里体积混合，根据膜的大小来确定显色液的量， 1 min 后，将膜与显色液充分接触。 II 反应1 - 5 min 后，吸去膜上残余液，将膜转移至一干净保鲜膜上，包好，放入压片夹中。III 剪一张比膜尺寸稍大的X 光片，打开压片夹，将X 光片放在膜上，一旦放上，便不能移动。关上压片夹，开始计时。 IV 根据信号强弱调整曝光时间，一般1 - 5 min，也可选择不同时间多次压片以达最佳效果。V 曝光结束后，打开压片夹，将X 光片迅速浸入备好的显影液中显影，待出现明显条带后，终止显影。一般1 - 2 min（20 - 25 ℃）。 VI 显影结束后，用水冲洗X 光片，放到定影液中，定影时间一般为5 - 10 min，以胶片透明为止。 VII 用水冲洗去底片上残留的定影液，室温下晾干。

westernblot详细图解详细版.docx

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；

SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）（6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提

蛋白质印迹(Western blot)实验方案

蛋白质印迹（Western blot）实验方案溶液和试剂裂解缓冲液这些缓冲液可在 4 ℃下保存数周，或者以分装形式在 -20 ℃下保存长达 1 年。Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液 150 mM NaCl 1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代） 50 mM Tris-HCl pH 8.0 蛋白酶抑制剂 RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液） 150 mM NaCl 1.0% NP-40 或0.1% Triton X-100 0.5% 脱氧胆酸钠 0.1% SDS（十二烷基硫酸钠） 50 mM Tris-HCl pH 8.0 蛋白酶抑制剂 Tris-HCl 缓冲液 20 mM Tris-HCl pH 7.5 蛋白酶抑制剂电泳、转膜、封闭缓冲液 Laemmli 2×缓冲液/上样缓冲液 4% SDS 10% 2-巯基乙醇 20% 甘油 0.004% 溴酚蓝 0.125 M Tris-HCl 测定 pH 并调节至 pH 6.8。电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS） 25 mM Tris 碱 190 mM 甘氨酸 0.1% SDS 测定 pH，pH 应为约8.3。必要时进行调节。转膜缓冲液（湿转） 25 mM Tris 碱 190 mM 甘氨酸 20% 甲醇测定 pH，pH 应为约8.3。必要时进行调节。对于大于 80 kDa 的蛋白质，我们推荐加入最终浓度为 0.1% 的 SDS。转膜缓冲液（半干转）

48 mM Tris 39 mM 甘氨酸 20% 甲醇 0.04% SDS 封闭缓冲液 5% 奶粉或 BSA（牛血清白蛋白）加入 TBST 缓冲液中。混匀并过滤。过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。实验步骤样品裂解 1. 制备细胞培养物裂解物 .将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。 .吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm2培养瓶加入 1 ml；每 5×106细胞/60 mm 培养皿/75 cm2培养瓶加入 0.5 ml）。 .用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。 .在4 ℃下持续搅拌 30 分钟。 .在4 ℃预冷的离心机中以16,000 × g 的转速离心20 分钟。 .轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。 2. 制备组织裂解物 .用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。 .将组织置于圆底微量离心管或Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在-80 ℃下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。对于约5 mg 的组织，向离心管中快速加入约300 μL 裂解缓冲液，然后用电动匀浆器进行匀浆，用另外300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在4 ℃下持续搅拌（例如，在回旋振荡器上）2 小时。 . 4 ℃下在微型离心机中以16,000 × g 离心20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。弃去沉淀。样品制备 .取出小部分(50 μL) 裂解物，用于蛋白分析。确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。.向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的2× Laemmli 样品缓冲液。我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。

Westernblot实验步骤及注意事项

Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。/凝胶/）将此滤纸3．

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生

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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

WB实验问题

Western Blot问题指南时间：2011-05-13 08:55 来源：网络作者：admin点击：3679次根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）； 1.参考书推荐A.对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies （a laboratory manual ，根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）； 1. 参考书推荐 A. 对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies （a laboratory manual，wrote by Ed Harlow ，david lane ）两本书不错。 2. 针对样品的常见问题 B. 做线粒体膜UCP蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120 口g,换了个santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单力口PMSF亍吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1,样品不能反复冻融；2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。 C. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。 D. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。 E我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5—10%甲醇。 F. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Wester n Blot吗？解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6%, Stacking Gel 3.5 %。 G. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5m m的comb。