植物生物技术

绪论

1.植物生物技术的概述：指生物技术在植物上的应用，包括植物组织培养技术、人工种子、细胞工

程、基因工程等多个生物技术，主要是指植物基因工程和与之相关的植物组织细胞培养技术、分子标记育种技术等。

2.生物技术的产生和发展：现代生物技术是以20世纪70年代DNA重组技术的建立为标志的。发

展迅速

3.植物生物技术的展望：植物生物技术被普遍认为是未来人类解决资源短缺不可或缺的技术，也是

争取农产品高附加值的重要技术手段。

4.What is Biotechnology什么是生物技术：应用该技术通过添加来自另一生物的基因来修饰生物

的生物功能

第一章组织培养实验室建设与操作技术

1.标准的组织培养实验室包括：洗涤室（准备室）、配置室、灭菌室、接种室、培养室、观察室等。

2.组织培养所用到的器具：镊子类、剪刀类、组培瓶、各类器皿、量筒、移液管、试剂瓶、容量瓶、

试管以及移液管架、酒精、玻璃棒、

3.培养基的配制：无机营养成分、有机营养成分、碳源、激素、琼脂、水。其中无机营养包括大

量元素、微量元素。有机营养包括氨基酸和维生素。碳源有蔗糖、葡萄糖、果糖，以蔗糖为主。

激素包括生长素和细胞激动素

4.植物生长调节物质：生长素：吲哚乙酸、NAA、2,4-D；细胞分裂素：控制植物细胞分化（比例

高时——产生芽,比例低时——产生根）、赤霉素、脱落酸

作用：促进细胞生长和细胞分裂；

?诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力；

?形成愈伤组织，促进生根；

?与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。

5.根据培养物的培养过程，培养基分为：初代培养基：用来第一次接种外植体的培养基；继代培养

基：用来接种继初代培养物的培养基。根据其作用不同，培养基分为：诱导培养基；增殖培养基；生根培养基。

6.基本培养基：主要有MS、White、N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。

7.完全培养基：基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其

他复杂有机物质等。

8.培养基的配制：计量、移液、取琼脂蔗糖备用、融化、混合、调pH、分装、包扎、培养基的灭

菌

9.灭菌工作的重要性：预防感染杂菌的需要；消除生物污染的需要；防腐与保存的需要

10.灭菌的方法：a、物理方法：干热、湿热、过滤（0.25微米）紫外灯、超声波等。

b、化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、

福尔马林等。

11.干热灭菌：适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：150℃、40min或120℃、120min，

如果发现芽孢杆菌，160℃、90～120min。

12.湿热灭菌：适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。121℃维持20～30min。

注意点：加足水、排尽气、气压降到0时，才能开盖

13.过滤灭菌：培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些

生长调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌。灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径0.22～0.45微米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50℃左右时，加入适量的激素，然后分装。

14.射线灭菌：主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间20～30min。

15.火焰灼烧灭菌：用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。

16.消毒剂

(min.)

乙醇70-750.1-3好易

氯化汞0.1～12～15最好最难

过氧化氢10～125～15较好最易

抗菌素4～50mgl-130～60较好较难

次氯酸钙/纳9 ～105～30好易

1.无菌操作技术

17.实验器具和材料的准备

用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。

关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）

18.外植体和外质体的灭菌：

取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。

打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。

用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。

19.无菌操作的注意事项

（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。

（2）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。

（3）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。

（4）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。（5）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。

第二章胚胎培养

1.植物胚培养：是指在无菌条件下，对植物的胚及胚器官如子房、胚珠和胚乳进行离体培养的技术。

2.植物胚培养的类型：成熟胚培养：成熟胚为子叶期以后的胚，其在简单的培养基上即可萌发生长

3.成熟胚培养过程：

种子——95%酒精消毒——选取完好种子——70%酒精浸数S——0.1%升汞或10%次氯酸钠浸泡——无菌水冲洗——种子培养几天——剥离种胚——接种在培养基上（MS、White培养基）

4.成熟胚培养条件下：

（1）因成熟胚本身含有较多的营养条件，对培养基要求不高

（2）只含有大量元素和糖的培养基上，便可萌发成苗

（3）多数植物成熟胚的生长以12h/天光照为宜。

5.幼胚培养：（子叶形成之前）对发育早期的胚进行培养。培养技术和条件要求较高。需要通过培

养基向其提供足够的营养物质。

6.看护培养（nurse culture）：将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养，以促

进低密度细胞生长、分裂的培养方法。

7.影响胚培养的因素

培养基：无机盐、碳水化合物、植物激素的作用、天然提取物及某些蛋白制品、氨基酸和维生素、活性炭和PH

环境条件：温度、光照、pH、培养基形态

胚龄：胚的发育程度与萌发成活率呈正相关，胚的剥离以受精35天左右为宜；心形胚和鱼雷胚较好8.胚珠培养：是指将胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼

苗的过程。

9.胚珠培养类型:未受精胚珠的培养和受精胚珠的培养

10.胚珠培养的基本过程：胚珠的获取；培养条件；受精胚珠的发育

11.子房培养：将子房从母株上摘下，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成

幼苗的过程。根据培养的子房是否授粉分为：授粉子房培养；未授粉子房培养

12.子房培养的过程：子房的获取；子房的培养

子房性细胞——愈伤组织或胚状体——单倍体植株

子房体细胞——愈伤组织或胚状体——二倍体植株

13.胚珠和子房培养的应用

（1）受精胚珠培养目的：一是打破种子的休眠；二是挽救胚的发育，以获得杂交种。

（2）未受精胚珠培养目的：获得单倍体植株。

（1）授粉子房培养目的：挽救子房内杂种胚的发育

（2）未授粉子房培养目的：获得单倍体植株；试管受精解决杂交育种中不亲和问题。

14.影响胚珠和子房培养的因素

a)基因型

b)发育时期：越早培养基越复杂

c)附带组织：花的其它器官。

d)附加成分：外源激素等

15.胚乳培养：是指将从母体上分离出来，在无菌的环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。

16.胚乳培养过程

胚乳外植体制备:种子消毒---取出胚乳

培养:White或MS诱导培养基---25-27℃--暗或弱光

发育:诱导形成愈伤组织----再分化形成胚状体或不定芽---生根培养----植株。

17.胚乳培养的应用

获得三倍体植株，用于育种利用。三倍体植株具有营养体大，无籽等特点。如无籽西瓜。

胚乳培养也会产生较多的混倍体，影响育种利用。但可用于染色体工程研究。

?稳定型：三倍体

?畸变型：除少数是三倍体，多数是由多种倍性细胞组成的嵌合体

18.植物离体授粉：将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以

无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术。

19.离体授粉的类型

（1）.离体柱头授粉（授于离体雌蕊的位置）

（2）.离体子房授粉

（3）.离体胚珠授粉

第三章植物愈伤组织的诱导与分化培养

1.植物的全能性：植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力

2.植物组织培养：就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术。

3.愈伤组织：植物外植体脱分化、经过细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。

4.愈伤组织培养：是指将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和

分化的培养过程。

5.愈伤组织培养的调控因素：外植体、培养基和培养环境。

6.从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：诱导期、分裂期和分化期。

7.形态建成：外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，

发育成苗或完整植株。

8.愈伤组织的形态发生方式:不定芽方式和胚状体方式。

9.愈伤组织的形态发生：外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者

形成胚状体，发育成苗或完整植株。

10.胚状体（embryoid）：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经胚胎发生和胚胎发育过

程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。

11.愈伤组织的培养条件：温度、光照、湿度、培养基组成、PH值、渗透压。

12.试管苗移栽时注意事项

（1）.试管苗驯化和炼苗：瓶内驯化；瓶外驯化—定值到育苗容器和苗床，经过一段时间的保湿和遮光处理。

（2）.根处理：蘸生长素（50mg /L NAA）和生根粉处理。

（3）.选无风阴湿天气移苗。

（4）.基质湿度不宜太高，基质水分过多，通气不良影响生根。

13.植物器官的培养的分类

14.植物组织培养的应用

1)如利用茎、叶和花器培养建立的试管苗，可在短期内提高繁殖速率，进行名贵品种的快速繁殖；

2)利用茎尖培养可得到脱毒试管苗，解决品种的退化问题，提高产量和质量；

3)将植物器官作诱变处理，用器官培养可得到突变株，进行细胞突变育种

第四章茎尖培养和离体快繁

1.类型及意义：类型：

1)微茎尖(茎尖分生组织)培养：指带有1～2个叶原基的生长锥，其长度不超过0.5mm。目的

是获得无病毒植株

2)普通茎尖培养：指对几毫米至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养。目的是快速繁殖。技

术简单,操作方便,易成活和分化,成苗时间短。

意义：无性系快速繁殖；培养无病毒苗，品种改良；理论基础研究。

2.茎尖培养方法

1)制备外植体：取1-2cm的枝条顶梢，去小叶---消毒---解剖镜下用解剖刀除去幼叶和叶原基，露

出生长点，切下0.1-0.2mm长的茎尖(含1-2个叶原基)

2)组织分离：用消毒的镊子将材料转到解剖镜下，一手用镊子将其按住，一手用灭菌后的解剖针将

叶片叶原基去掉，露出生长点，切下顶端0.1-0.2mm长的茎尖来培养；若为快速繁殖，也可取

0.5-1cm长的茎尖．

3)培养基：一般为MS培养方法：

固体培养法：试管培养

纸桥培养法：含义：用酒杯状的滤纸代替琼脂，使杯底朝上塞入试管中，与液体培养基接触，将离体茎尖置于滤纸上方进行培养。

优点：培养基是液体培养基，营养物质能通过滤纸均衡而持久地供给外植体，有利于外植体的健康成长；缺点：操作工艺复杂。

3.组织分离：用消毒的镊子将材料转到解剖镜下，一手用镊子将其按住，一手用灭菌后的解剖针将

叶片叶原基去掉，露出生长点，切下顶端0.1-0.2mm长的茎尖来培养；若为快速繁殖，也可取

0.5-1cm长的茎尖．

4.快速繁殖(微繁殖):用组织培养的方法，使植物的部分器官、组织迅速扩大培养，并移植到温室或

农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。

5.快速繁殖特点：

（1）.繁殖速度快；

（2）.使用材料少，生产效率高，省时省工；（3）.节约空间有利于植物的工厂化生产；（4）.在无菌条件下进行，不受病虫害侵害。

5.茎尖微繁技术的过程

1)无菌培养体系的建立、

2)芽的增殖

3)中间繁殖体的增殖

4)诱导生根

5)试管苗的移植第五章单倍体细胞培养

1.单倍体植物(haplobiont)：用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。

2.花粉和花药的培养(pollen and anther culture)：是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，

不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。

3.花药培养：其外植体为植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范

畴。将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。

4.花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小

孢子培养(microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程

5.离体培养小孢子发育的影响因素：

a)植株基因型：裸子植物难，被子植物简单

b)大白菜：早熟简单，晚熟难；

c)培养基成分：MS.其次B5.N6培养基。

d)植物生长条件和生理状态：幼年、开花初期。e)小孢子发育状态：单核期（多）。

f)预处理：低温处理。

g)培养条件：一般温度25℃，光照无或正常光

照等。对不同物种，没有固定的模式。

6.获得花粉的方法

A、机械挤压梯度离心法

花药消毒

用镊子或小玻璃杵子将花粉从花药中挤压出用30%蔗糖离心收集悬浮上层的完整花粉粒用培养基洗涤几次B、自然散粉法

消毒后的花药接种在液体培养基中一定温度下振荡培养

花粉自行散落到培养基中

除去花药壁

花粉重新培养在新鲜培养液中

7.花粉植株形态发生方式

胚胎发生途径：小孢子发育与合子发育相似，经历球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶胚等阶段，但没有胚柄。

愈伤组织发生途径：产生愈伤组织，分化出胚状体或不定芽。

7.单倍体植株的鉴定

1、染色体直接计数法：细胞学鉴定，通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数

目。

2、间接鉴定

植株形态学鉴定法：单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。

细胞形态学鉴定：叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。

扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）：主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1 cm2。

8.水稻花药培养过程

旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍——剥去旗叶鞘，取出稻穗——10％漂白粉10 min——无菌水洗3次——左手持穗，右手用镊子取花药，放无菌培养皿中——用接种环接种到培养基上——培养5天，花药变褐，20天后花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先长芽，后长根，形成幼苗。

9.花药和花粉培养的应用

1)诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期；

2)有利于筛选隐性突变体，提高选择效率;

3)有利于隐性基因控制性状的选择

4)遗传转化的受体材料

5)克服远缘杂交后代不育。

第六章原生质体培养和融合

1.原生质体：原生质体去掉细胞壁的由质膜包裹着的裸细胞。

2.原生质体的酶分离法：收率高、活力强、完整性好。分离原生质体最有效。

（1）酶的种类及特点：分离原生质体的酶多是一些复合酶制剂，以其所含的主要酶的作用分为：a、纤维素酶类；b、半纤维素酶类；c、果胶酶类；d、崩溃酶；e、蜗牛酶

（2）酶液的配制：酶的配比和浓度（见课本）、渗透压和稳定剂及PH。

2.原生质体的纯化

1)沉降法（过滤离心法）：低速离心使原生质体沉于底部。

2)漂浮法：根据原生质体和细胞或细胞碎片的比重不同，分离出原生质体。

3)不连续梯度离心法：在离心管中首先放入不同浓度的Ficoll溶液，构成不同梯度，在上部滴入

1-2ml酶—原生质体混合液，在150g离心5min，不同比重的原生质体漂浮在不同的浓度梯度的界面上，用吸管吸出原生质体，悬浮洗涤备用。

3.影响原生质体数量和活力的因素

1)供试材料

2)酶的种类，组合和酶解时间

3)渗透压稳定剂：糖醇或可溶性糖、无机盐类组成的有机溶液

4)质膜稳定剂

4.影响原生质体培养的因素

原生质体活力

原生质体起始密度渗透压稳定剂培养基成分

培养条件

植物材料和基因型

5.原生质体融合：也称体细胞杂交，就是分离下来的不同亲本杂交的原生质体，在人工控制下，像

性细胞受精作用那样互相融合成一体。

第七章体细胞无性系变异

1.体细胞无性系变异：外植体—脱分化–再分化过程—产生的再生植株中表现出的变异。

2.体细胞无性系变异的筛选与检测

筛选原理建立在有区别地杀死正常型细胞的基础上：

1)正筛选：杀死正常细胞

2)负筛选：先使正常细胞生长，抑制突变细胞。而后用药物杀死分裂细胞。（亚硝酸盐和核苷酸类