细胞和动物组织核蛋白的提取方法
细胞和动物组织核蛋白的提取方法
产品组成 310001 310002
规格 50 assays 100 assays
Buffer A (Cytoplasmic Extraction Reagent) 10ml 20ml
Buffer B (Nuclear Extraction Reagent) 10ml 20ml
蛋白酶抑制剂混合物 250ul 500ul
使用方法：
A．细胞蛋白提取
1. 取5-10×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 每20ul细胞压积中加入200μl冷的Buffer A，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒，置冰上10分钟。
4. 再次高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，16000×g条件下离心5分钟。
5. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
6. 在沉淀中加入200μl冷的Buffer B，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒。
7. 置冰上40分钟，每隔10分钟高速涡旋振荡15秒。
8. 在4℃，16000×g条件下离心10分钟。
9. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。B．组织蛋白提取
1. 取适量组织样本剪碎，加冷PBS，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置5分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
2. 在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，弃上清。
3. 按照细胞蛋白的提取方法的第3步骤往下操作即可。
上述蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用。
注意事项：
1. 实验过程中的所有BestBio-贝博生物试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。
2. 整个过程须保持样品处于低温状态。
储存条件：
-20℃保存。
有效期：
一年。
DXY网友qingraner问：本人核浆分离做了最少两个月了吧，似乎没有什么进展，我想请问高人指点一下。我很想知道我的配方有什么问题，或者是我的操作有什么需要注意的地方。十分感谢！还有，我检测的方法是用Ikb-α（标细
胞质）和Oct-1（标细胞核），似乎抗体也不是很好用。我做的是BT474细胞，breast cancer cell。
我的方法如下：
1、用Buffer A 洗涤
2、500G离心5分钟
3、用BufferA+B（2：1）裂解细胞，轻轻混匀，孵育5-10分钟
4、12000G离心10分钟（上清：细胞质。沉淀：细胞核和细胞膜）
5、PBD洗涤细胞两次，12000 G离心10分钟
6、Buffer C裂解细胞膜（放入液氮中快速冷冻，在冰上融化10分钟）
7、12000G离心10分钟（上清：细胞核。沉淀：细胞膜）
8、用PBS洗涤
9、用PRPA Buffer在冰上放置30分钟
10、12000 G离心10分钟（上清：细胞膜）
BufferA：10 mmol/L Hepes 7.5；10 mmol/L kcl；1.5 mmol/L Mgcl2；0.
5 mmol/LDTT；1 mmol/LNaF；1 mmol/L glycerol phosphate；1 prptease i nhibitor cocktail tablet/50ml
BufferB：BufferA+0.15% of Nonidet P-40；
BufferC：20 mmol/L Hepes 7.5；420 mmol/L Nacl；1.5 mmol/L Mgcl 2；0.5 mmol/LDTT；1 mmol/LNaF；1 mmol/L glycerol phosphate；1 prpte ase inhibitor cocktail tablet/50ml
DXY网友kevinfong回复：你是不是分离细胞浆蛋白和细胞核蛋白，然后做Western发现细胞核中也有Ikb-α，或者细胞浆中也能检测到Oct-1啊？如果是或者，我觉得挺正常的，因为转录因子部分也存在于细胞浆，至于Ikb-α是不是细胞质特异性的我就不清楚了。但是，我觉得你用的是试剂盒应该没有问题的，然而也很难彻底分开，在步骤4吸取上清时小心点，不要触及沉淀，可以剩少许上清（这部分上清不收集），然后用白尖再把这些上清吸干净扔掉，这样可以尽量减少各个组分的污染。我用过试剂盒分过细胞浆和细胞核蛋白，感觉还行，至少不影响实验结果。如果，你想精确的彻底的分离，或者想得到Oct-1的话，建议你采用蔗糖梯度离心方法再次富集你收集的各个组分上清，这可以分离得到比较纯的你想要检测的那些蛋白组分。
楼主问：感谢指点，我有如下几个问题，多谢回答
1、在实验过程中，我收集上清的时候的确是收集一部分，但是剩下的没有弃下，下次改进。
2、对于我的抗体。Ikb-α是多克隆抗体，非特异性很强，感觉十分难做；O CT-1虽然是单抗，但我基本上没有检测它应该的大小（90K左右），只是检测到其它的分子量，不清楚为什么，大概40多K 吧！
3、我想请问您用试剂盒的效果不影响实验是什么意思？那哪个牌子的试剂盒好用，还有，您检测的方法跟我的抗体一样吗？
4、我的配方里面一直是加好了DTT的，不现加现用有什么后果吗？
DXY网友kevinfong回复：首先我做的抗体跟你不一样，但我可以回答你的问题：
2.我用的大部分抗体多是多克隆抗体，也会有其他非特异性带，但是不论怎么目的带总是最明显的，基本上不会影响结果，而且我也发现不同的来源的细胞用同一种抗体，有的就不会用其他非特异性带，有的不管怎么都会有非特性带，有几个方法可以尽量消除非特性带，抗体的量少加一点，我抗体基本上都是1：1000以上，孵育过夜，二抗的量1：20000（北京中杉），再则可以减少上样量，我一般50-75ug左右，这些前提抗体必须效价高。我在抗体上吃过很大的亏，买了两家公司的抗体，都是进口有名的，都没杂出来，后来用了第三家的，就很顺利的做出来了。所以抗体很重要。所以，你首先得排除抗体的问题。我没做过Ikb-α和OCT-1，所以不敢断定你用的OCT抗体有问题，不顾第一次做，一般抗体量加多一定，先保证抗体能杂出来，接下来再做改善。
3.我指的是我用的试剂盒分离细胞浆细胞核组分，那它们去做我的实验包括Western和EMSA都能检测目的蛋白。至于哪个试剂盒好用，就不好说了。我用的是国产碧云天的。
4.一般情况下DTT都是另外配好冻-20度，用时加。但我在配细胞裂解液时就把所有的成分包括DTT配好了，然后分装-20度保存。用时也没发现有什么不妥的。所有，我觉得应该没有什么大的影响。
17动物组织蛋白提取
1.组织块迅速置于预冷的生理盐水中，洗去表面的血迹，将组织称量后切成较小的组织块（0.2-1.0g），放入组织匀浆器中，按组织100mg：提取试剂体积1ml的比例加入相应体积的蛋白提取试剂（需提前加入酶抑制剂）进行匀浆，至组织研磨完全。 2.超声处理（同细胞蛋白样品的制备），处理完后置冰上裂解4-5小时。 3.10000 g/min离心10min，取中层溶液，加入等体积的蛋白上样缓冲液（2X），或1/4体积蛋白上样缓冲液（5x）（AR1112）,置100℃水浴箱沸水浴中变性5分钟。 1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。 2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。 3、10,000×g 离心15分钟。 4、收集上清，进行下一步的实验。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 ①吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，细胞刮刮脱细胞，收集至离心管，1000rpm离心5分钟。洗涤后的细胞转移至洁净EP管，②冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis,Buffer 中加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。混匀后冰上保存数分钟待用。③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液。200μl移液器反复吹打，至蛋白析出。④4℃摇床，温和振摇15分钟。⑤14000rpm，4℃离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物。⑥BCA法测蛋白浓度。蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。 细胞提取步骤 1. 冰上操作，向细胞沉淀中加入200ul细胞裂解液，2μl 100mM的PMSF。 2. 200μl移液器反复吹打，至溶液变得粘稠。 3. 4℃摇床，温和振摇30min。 4. 15000rpm，4℃离心15min，上清即为细胞全蛋白提取物 5. 蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。
实验九-动物组织中核酸的提取和鉴定
实验七动物组织中核酸的提取和鉴定 【原理】 动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。 先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。 核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。 此三类化合物可用下列方法鉴定之。 1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C等。 H3PO4＋12H2MoO4→H3PO4·12MoO3 + 12H2O H3PO4·12MoO3H3PO4·6MoO3·3Mo2O5 2、嘌呤碱：能与苦 味酸作用形成针状结晶 3、戊糖： (1)核糖：经与强酸 (盐酸与硫酸)共热生成 糠醛，后者可与3;5二羟 甲基苯缩合成绿色化合 物。 (2)脱氧核糖：在强 酸中加热，可生成ω—羟 基γ—酮基戊醛，后者再 与二苯胺作用生成一蓝 色化合物。 上述二反应如下 【操作】
(一)核酸提取 l、用酚提取法： （1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。 （2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。 （3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。 （4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。 2、用三氯醋酸提取法 （1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏4ml比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。每组量取肝匀浆5ml于带塞离心管中，3000转／分离心5分钟。 （2）将离心后的上清液倾去，于沉淀中加95％乙醇5ml充分混匀，在水浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾后将火关小，避免酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。 （3）倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入10％NaCI溶液4ml，置沸水浴中8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出；冷却后再离心， （4）将上清液倾入另一离心管中，再离心一次，除去可能存在的微量残渣，将上清液倒入一试管。 取等量95％的乙醇，逐滴加入到上清液中，即可见白色沉淀逐渐出现，静置10分钟后。将其内容物摇匀后倒入一圆底离心管中，离心5分钟，将上液倾去，所得白色沉淀即为核酸钠。 (二)核酸的水解： 在有核酸沉淀的离心管中加入蒸馏水2ml。振摇至沉淀溶解后，加入10％H2SO42mL摇匀，于沸水浴中加热10分钟，即得核酸水解液，用流水冷却后进行下列定性试验。 (三)鉴定： l、嘌呤碱的鉴定： 取中试管一支，加入饱和苦味酸约2ml，再加入核酸水解液4—6滴，摇匀。静置于室温中，观察有无黄色针状结晶出现，。 2、脱氧核糖的鉴定：
各种动物蛋白原料的加工方法
各种动物蛋白原料的加工方法 1、鱼粉的加工海杂鱼、淡水鱼及海产品加工下脚料等，均可作为鱼粉加工的原料，先将原料通过晒干、烘干或水煮后晒干等程序，然后加工成粉状即成，水煮法经高温处理，质量一般较好。 2、肉骨粉的加工主要原料是肉食品加工下脚料，以及不合乎卫生要求的动物屠体组织，将原料加水蒸煮，一般脏器煮1小时，头、蹄组织煮2-3小时。煮后去掉汤表面的油脂，经烘干粉碎即成。加工较好肉骨粉呈淡红色，水分不超过6%，粗蛋白质含量达40%以上。 3、血粉的加工主要以屠宰动物血液为原料，将血液放入锅内加热，直到血液凝固和水分蒸发后，晾在水泥地板上直至干燥，然后加工成粉状即成，值得注意的是：血液加热时要不断搅拌，加入0.5%-1.5%的生石灰，煮后将血块装入麻袋内挤压沥水，使水分沥掉50%以上，再晾晒，并每隔1-2小时翻动1次，直至晒干为止。加工血粉蛋白质含量可达70%-80%，水分不超过10%，土法加工的血粉应立即饲喂。 4、羽毛粉的加工原料为禽类羽毛。将羽毛用水冲洗干净、晒干，然后在耐酸的锅中按1:6的比例先放入羽毛，再放入0.2%的稀盐酸液，加盖煮沸到用手轻轻拉断时捞出，沥去酸液，然后在阳光下晒干，用粉碎机加工成粉即可。加工好的羽毛粉蛋白质含量在70%左右。 5、骨粉的加工以动物骨头为原料，将动物骨头放入普通锅中连续煮沸7-8小时，待骨头上的脂肪煮出后，在阳光下晒干，然后加工成粉状即成，也可将骨头堆在金属架上进行焙烧，粉碎后即成骨粉，骨粉是补充钙磷元素的好饲料。 6、蛋壳粉的加工以新鲜洁净蛋壳为原料，将蛋壳洗净放入锅内煮沸，
捞出后再放入60℃的铁锅内焙炒，炒脆后取出粉碎即成蛋壳粉，蛋壳粉是补充钙的好饲料。 7、蚕蛹的加工蚕蛹是缫丝工艺的副产品。将蚕蛹放入锅内，反复煮沸数次，去掉油脂，捞出后晒干、粉碎成末即成蚕蛹粉，蚕蛹粉含粗蛋白质为45%左右，适宜饲喂猪及家禽。
动物组织学复习题及答案
动物组织学与胚胎学复习题及答案 第一章组织学绪论 一、单项选择题1．光镜下观察组织石蜡包理切片厚度一般是 A.100um B.50um C.5-10um D.1um 左右 E.0.1-0.5um 2．透射电镜下观察的组织切片厚度一般是A.50-80nm B.5-10nm C.1-2nm D.100-500nm E.1um 左右 3．组织异染性的含义是 A.染色快速 B.染色困难 C.染色鲜明 D.染色需加还原剂 E.以上都不对 4．观察体外培养细胞首选的显微镜是 A.—般光镜 B.倒置相关显微镜 C.相差显微镜 D.暗视野显微镜 E.偏光显微镜 5．PAS 反应是检测组织内的 A.核酸 B.脂类 C.蛋白水解酶 D.多糖类 E.抗原 6．细胞的表现型是指 A.细胞结构和功能的特点 B .细胞分布状况 C .细胞功能静止和活动的变化 D.细胞形态结构的变化 E.细胞增殖状态 7．光镜组织切片和电镜组织切片 A.均为超薄切片 B.均用化学染料染色 C .均可制冷冻切片 D.均为固定组织 E.均可摄彩色照片 8．扫描电镜是主要用于观察 A.生物膜内部结构 B.细胞器的内部结构 C.组织和细胞的表面结构 D.细胞内的多糖 E .细胞核内的结构 9．组织的分类是根据 A.细胞的数量和密度 B .细胞排列的型式 C .细胞的代谢特点 D.细胞间质的组成 E.以上均不对 10．扫描电镜术不同于透射电镜术的一点是
A.组织勿需固定 B.勿需制备超薄切片 C.是以激光扫描标本 D.不在荧光屏上显像 E.可观察活细胞 二、多项选择题 1．冷冻切片的特点是 A.用树脂快速包埋 B.组织块可不固定 C .制片较迅速 D.细胞内酶活性保存较好 E.可制厚O.lum的切片 2．组织固定的意义是 A.使蛋白质迅速溶解 B.防止细胞自溶 C.使组织膨胀 D.使组织坚硬 E.防止组织腐败 3．组织化学术可检测组织内的 A.抗原 B.酶 C.脂类 D.糖类 E.核酸 4．现代组织学技术可显示和研究 A.细胞的受体分布 B.细胞内Ca2+等的含量测定 C.细胞内各种蛋白质的定位和定量 D.细胞内某种蛋白质的定位和定量 E.细胞运动，分泌,吞噬等动态过程5．透射电镜术中的组织块和组织切片 A.组织块大小与光镜术的相近 B.组织块用戊二醛,四氧化锇等固定 C.组织块石蜡包埋 D.切片用重金属电子染色 E.切片置在玻片上于电镜下观察 6．组织培养术 A.取新鲜组织和细胞 B.标本以高温灭菌 C.溶液和用具均需灭菌 D.标本培养于近似体内的条件下 E.可直接观察记录活细胞的行为 三、填空题 1 ．HE 的染色法的染料是________ 和 _______ ,组织切片中与前者亲和力强的着色结构称 ,与后者亲和力强的着色结构称,与两者亲和力均不强者称。2．组织块在包埋前需先经，常用的包埋剂是、和。 3．细胞间质是由 _______ 产生的，包括__________ 和 _______ 。 4．在光学显微镜下观察的固定标本除组织切片外，还有____________ 、_______ 和_______ 。5．银染法中若组织结构直接使硝酸银还原而显示的称为____________ ，若需加还原剂方能显示的 组织结构称 _______ 。 6．光学显微镜的最大分辨率是 ________ ，光镜下所见的结构称为_________ ；电子显微镜的分 辨率可达 _______ ，电镜下所见的结构称_________ 。 7．基本组织一般分为四大类，即 ________ 、_______ 、_______ 和 _______ 。
动物组织胚胎学专升本作业题参考答案
东北农业大学网络教育学院 动物组织胚胎学作业题 作业题（一） 一、名词解释 1.组织学：是研究动物体微细结构及其与功能关系的科学。研究容包括细胞、组织和器官组织三个部分。 2.胚胎学：是研究动物个体胚胎发育的科学。 3.皮：衬在心、血管和淋巴管面的上皮叫皮。皮薄而光滑，有利于血液和淋巴的流动以及皮细胞外的物质交换。 4.肌节：肌原纤维之相邻两Z线之间的部分，称为一个肌节，是肌肉收缩的基本结构和机能单位。 5.胎盘：是胎儿与母体进行物质交换的结构，它由胎盘的胎儿部分和母体部分所组成。 6.神经元：神经细胞是一种高度分化的细胞，具有很长的突起，能够感受刺激和传导神经冲动，是神经组织结构和机能的基本单位，因此又叫神经元。 7.骨单位：是位于、外环骨板之间的一些平行于骨干长轴排列的圆柱体。它们由许多呈同心圆排列的筒状骨板和中央的哈氏管所组成。 8. 胰岛：是胰腺中的分泌细胞团，散在分布于胰腺外分泌部的腺泡之间。胰岛主要有A、B、D、PP四种细胞，它们都具有蛋白质分泌细胞的超微结构特点；分别分泌高血糖素、胰岛素、生长抑素、分泌胰多肽。 9.尘细胞：肺巨噬细胞：数量较多，广泛分布于肺间质，也可进入肺泡腔。来源于单核细胞，有活跃的吞噬、免疫和分泌功能，起重要的防御作用。当吞噬进入肺的尘粒后，称为尘细胞。 10.肾单位：肾单位是尿生成和排泄的基本单位，由肾小体和肾小管两部分构成。 二、判断下列句子正确与否并用“√”或“×”标明 1～5√××××；6～10××××√ 三、单项选择 1～5DCDDB ；6～10DCBCA 四、填空题 1.细胞膜、细胞质、细胞核。2髓鞘、神经膜（施万）细胞。3骨骼肌、心肌、平滑肌。 4表皮、真皮和皮下组织。5过滤淋巴、参与免疫应答、产生淋巴细胞。6 鼻、咽、喉、气管、支气管、肺。 五、简答题 1. 外分泌腺的腺细胞有几种分泌方式，举例子说明。 1)透出分泌：分泌物以分子的方式透出细胞膜，例如胃壁细胞盐酸的分泌。 2）局部分泌也叫胞吐分泌。所形成的带包膜的分泌颗粒逐渐移到细胞的游离面并与质膜融合，将容物胞吐出去，细胞膜本身不受损伤。唾液腺和胰腺外分泌部都是此种分泌方式。 3）顶浆分泌胞质中形成的分泌物移到游离面质膜下后，顶着质膜向外突出，最后自突出部位与细胞折离，损伤的质膜很快修复。乳腺和汗腺细胞都为顶浆分泌。 4）全浆分泌当胞质充满分泌物后，细胞发生死亡性变化，最后整个细胞解体，连同分泌物一起排除，由邻近的腺细胞补充。皮脂腺细胞属于全浆分泌型。 2. 哺乳动物血液的组成。
动物组织各种固定液及优缺点
动物组织各种固定液及优缺点 编 号 类别名字配方优缺点或备注 甲醛：从组织学的观点来说,甲醛是一种良好的固定剂,它有很多的优点:1. 组织收缩较少,损伤少,保存固有物质好.2. 固定均匀,穿透力强.3. 能使组织硬化,增进组织弹性,有利于切片.4. 能保存脂肪及脂类物质.5. 成本较低. 缺点:1. 杂质含量较多,如甲醇,可钝化酶类,影响反应.2. 含有微量甲酸,导致固定液酸变,影响染色.3. 可产生福尔马林色素,影响观察.4. 不能固定尿酸和糖类物质.5. 容易挥发,污染环境,可导致标本干涸.6. 可长期存在于固定过的组织上.有人做过实验,组织用甲醛固定后在流水中冲洗5小时后,仍留有相当多的甲醛与蛋白质相结合,临床活检不用.因此要特别指出的是,在其后的各种技术操作中,要特别注意到甲醛的存在,必须要想办法除去它,否则将会给各种染色造成影响,甚至导致失败。 1 10%缓冲福尔马林固 定液甲醛100ml 蒸馏水900ml NaH2PO44g Na2HPO4 6.5g 该固定液是当今流行的固定液,因它对组织固 定较好,损伤较少,因对其后的各方面研究都较 好,尤其是对免疫组化的染色. 2 10%福尔马林固定液甲醛100 ml 自来水900ml 这是一种最简单的固定液，适合于边远地区携带的固定液，但由于它的单一性，因此，只要有条件的单位都不要求使用这种固定液。 3 10%福尔马林盐固定 液甲醛100ml 自来水900ml Nacl 9克 先将Nacl溶于水，再加入甲醛。这也是一种 较为简单的固定液，但由于加入Nacl，它是 一种重金属盐物质，加入了它可促进和改善染 色，增加染色的强度 4 Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液 75ml 甲醛 2 ml 冰醋酸 5 ml 该固定液中的冰醋酸，对胶原纤维等组织有膨胀作用。而甲醛对组织有收缩作用。两种试剂的混合使用，用以抵消彼此间的副作用。使组织固定达到优良的固定水平 5 醛糖钙固定液甲醛100ml 蔗糖300ml 乙酸钙20g 蒸镏水90ml 先将蔗糖和乙酸钙溶于蒸镏水，后加入甲醛。该固定液对于做酶的组织化学的研究效果较好，组织固定后，做冰冻切片，再给予显示。 酒精：优点：1、可保存尿酸结晶和糖原等物质。2、能在任何比例的情况下与水混合，如组织的脱水，切片染色前后都离不开酒精，通常都用95%的工业酒精来配成60%、70%、80%、90%等不同的浓度来使用。 3、可溶解苯类物质为染色步骤中的桥梁试剂。常规活检等切片上的石蜡必须除去，才能进行染色，能除去石蜡的物质有苯及汽油等，因此称它为桥梁试剂。 4、能除去切片上的水份，使切片无水化。切片经染色后，到无水酒精中已完全无水，这样处理对于切片的保存是有好处的，否则，切片将会褪色。5，可与其它试剂配成多种的混合固定液，加快固定，它的缺点是：1、可溶解脂类物质，凡要证明组织是否含有脂类和类脂物时，切不能用含有酒精的固定液去固定组织，也不能用石蜡切片。2、对组织收缩较大，不宜作单纯固定液。3、渗透力不强。当用酒精固定组织时，组织表面很快就被固定，并形成了一层蛋白膜，这层膜可阻挡固定液向里渗透，造成了中间组织固定不佳的现象。4、可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，凡经酒精固定的组织，核的染色都不好。 5、可脱去切片上已着染的各种颜色，切片经染色后，一是必须洗去多余的染液，二是必须脱去切片上的水。在用酒精洗切片时，必须仔细地掌握显微镜下观察，还要掌握酒精的浓度，低浓底的酒精脱色力强，稍不注意，便可脱去切片上大部分的颜色。切片脱水时，要较快地通过低浓度的酒精，以免使已着染的颜色被脱去。
组织蛋白提取
1. 提取蛋白裂解液配方： 25 mM HEPEs PH:7.4 5 mM EDTA 5 mM EGTA 50 mM NaCl 1 mM Na3VO3(矾酸钠) 1 mM sodium phosphophate 0.05% SDS 0.05% sodium deoxycholate (脱氧胆酸盐) 1% Triton-X 100 5 mM NaF 0.1% 2-mercaptoethanol 1 mM PMSF (1ul 100mmol/L+纯水99ul) 1uM Microcysin-LR 40ug/ml pepstatin A 40ug/ml aprotinin 40ug/ml leupeptin 2..组织蛋白提取及定量： 称量组织重量置小烧杯 用PBS清洗1-2次 加入组织裂解液【悬浮buffer储存液500ml+苯甲基磺酰氟（PMSF，有毒物）30+leapeptin （蛋白抑制酶）0.5ul于EP管混合，倒入盛组织的烧杯】 置冰上5min 用眼科剪剪碎 倒入5ml匀浆器（反复抽吸匀浆组织） 倒入或吸入EP管 离心（4°C 1000g 10min）取上清 用于蛋白定量或储存于-80°C 蛋白定量 取5ul蛋白样本+15ul去离子水（DW）+200ulBCA（A:B为50:1即196:4），分别混合样本与DW和BCA的A液与B液置于干净的96孔板上37°C，30min
酶联免疫测OD值（570nm，ELX-800型酶标仪） 由OD值计算蛋白浓度（用excel表或用下列公式计算） （OD值×987.7108－198.342）×103ng/ul；OD=样本OD值－空白对照OD值）
动物固体组织蛋白提取-Protocol(可编辑修改word版)
WT LOST 动物固体组织蛋白提取 Protocol 1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入 75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。 2、 裂解液配制：RIPA ：PMSF=100：1，现配现用。（1000ulRIPA+10ulPMSF ）。置入 4℃冰上。 3、抽蛋白（应冰上进行）： a 、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般 10ml 管体系中加入：7-8 粒磁珠、100mg 组织、1mlRIPA+10ulPMSF 、1 tablet Cocktail 。 b 、匀浆。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块， 一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8 分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000r/min 上下研磨制成 10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒，连续 3～5 次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用 Soniprep150 型超声波发生器以振幅 14 微米超声处理 30 秒使细胞破碎， 也可用国产超声波发生仪，用 40 安培，5 秒/次，间隙 10 秒反复 3～5 次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶 3 次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复 3 次左右），但有部分酶活力会受影响。 c 、将组织匀浆转入 1.5ml 的 EP 管中（eppendorf 管、离心管）。12000r/min 4°C 离心 15min 。 d 、离心后 EP 管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的 EP 管中。可-80℃保存。4、蛋白浓度测定。 a 、配工作液：溶液 A ：溶液 B=50：1（200ul ：4ul ）。 需测试复孔。标本 X ，则需 A 量=2* ；B=2*（X+1+1）*4。 c 、复孔，取蛋白 6ul 加入 0.6mlEP 管，再加入 54ulH 2O ，混匀。即 10 倍稀释。 d 、取 20-25ul 10 倍稀释蛋白样本加入 96 孔板平底板内，再加入 200ulAB 工作液，混匀振荡后，37℃ incubat e 30min 。 注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换 tip ，再加入工作液即起反应，应缩短时间。 e 、酶标仪检测 562nm 吸光度。Program f 、计算蛋白浓度。 根据标准曲线，如 Y=1.2745X-0.1684 其中 Y ：蛋白浓度；X ：吸光度。 最终蛋白浓度为：10*Y （ug/ul 、mg/ml ） g 、蛋白样本放-80℃冻存。 大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化， 这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。 Commassie 法（Bradford 法）： 原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料 G-250 结合，颜色从棕色变为蓝色，在 595nm 处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。 BCA 法： 原理：在碱性条件下，蛋白将 Cu++还原为 Cu+，Cu+与 BCA 试剂形成紫色络合物，测定其在 562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 现对这两种方法进行比较： 一、实验材料： 细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103）
全蛋白提取试剂盒
全蛋白提取试剂盒 Tissue or Cell Total Protein Extraction Kit 产品编号：C510003 包装规格：50 Assays 产品简介 本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取全蛋白，用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer 匀浆裂解组织或细胞，作用温和，提取过程简便高效,可以提取出培养细胞或动物组织中的决大多数蛋白质。获得的全蛋白可 用于Western Blot 、免疫共沉淀，酶活性分析，Pull down 和EMSA 等后续研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀 的研究，因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂，可以每次从107 个培养细胞或200 mg 动物组织提取蛋白质，本试剂盒可以 使用50次。 产品特点 1. 提取的蛋白质包括膜,核,核基质和胞质蛋白,而且最大限度保持蛋白质活性 2. 整个操作过程只需要30分钟左右 3. 即可以用于培养细胞（50x107 个），有可以用于动物组织（50x200 mg ）蛋白质的提取 4. 避免蛋白酶和磷酸酶对蛋白质的降解，保持蛋白质的完整性和天然活性 5. 不需要超速度离心，可以同时处理多个样品 运输和保存条件 常温运输，收到后请将磷酸酶抑制剂，蛋白酶抑制剂和PMSF 于 -20℃保存，其余2-8℃保存，保质期一年。 试剂盒组成 成分 C510003 Lysis buffer 50 mL 蛋白酶抑制剂 50 μL 磷酸酶抑制剂 250 μL PMSF 500 μL 操作步骤 A. 实体组织蛋白的提取 1. 在每1 mL 预冷的Lysis Buffer 加入5 μL 磷酸酶抑制剂,1 μL 蛋白酶抑制剂和10 μL PMSF 混匀。冰上保存数分钟待用。 2. 将100-200 mg 固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3 mm ×3 mm 左右的小块，尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，用PBS 洗涤两次，离心取沉淀后加入0.5～1 mL 上述配制好的预冷的Lysis Buffer ，4℃玻璃匀浆器上下手动匀浆15-30次。或超声破碎细胞，每次30s ， 3～4次，每次间隔1 min ，置于冰上冷却。均质匀浆或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于90％，同时没有明显的组织小块。 3. 取组织匀浆液转移到1.5 mL 预冷的离心管，冰上放置10 min 左右, 期间取出剧烈震荡2-3次； 4. 15000 g （13000 rpm)，4℃离心10 min ，取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物，进行蛋白定量和其他蛋白质相关实验。 5. 分装保存于-70℃，避免反复冻融。 s a n g o n b i o t e c h
动物病理名词
贫血：循环血液总量减少或单位容积外周血液中血红蛋白量、红细胞数低于同龄、同性别健康动物的正常值，称为贫血。 栓塞：循环血液中出现不溶于血液的异常物质，随血流运行并阻塞血管腔的过程，称为栓塞。 梗死：由于动脉血流断绝，局部组织器官因缺血发生坏死而形成的区域，称为梗死。 水肿：过多的水在组织间隙或体腔中积聚，称为水肿。浮肿:皮下水肿称为浮肿。 积水：大量液体积聚在浆膜腔时，称积水或积液。 脱水：机体在某些情况下，由于水和电解质的摄入不足或丧失过多，而引起体液总量减少，并出现一系列功能、代谢紊乱的病理现象，称为脱水。 等渗性脱水：机体失水、失钠比例大致相等，又称混合性脱水。 高渗性脱水：以水分丧失为主，盐的丧失较少的一种脱水，又称缺水性脱水、单纯性脱水。 代射性酸中毒：由于代谢障碍引起体内固定酸生成过多或碱性物质（碳酸氢根）大量丧失，导致酸碱平衡紊乱的现象，称代谢性酸中毒。 萎缩：发育正常的器官、组织细胞，由于物质代谢障碍而发生体积缩小和功能减退的过程，称萎缩。 淤血：由于静脉回流受阻，血液淤积在小静脉和毛细血管里，引起局部组织中的静脉血含量增多的现象，称为静脉性充血，简称淤血。 槟榔肝: 由于淤血的肝组织伴发脂肪变性，故在肝切面形成暗红色淤血与土黄色脂变肝细胞区相间，眼观似槟榔状花纹，故称为“槟榔肝”。血栓：在活体的血管或心脏内，血液凝固或血液中的某些成分析出，黏集形成固体物质的过程，称为血栓形成，所形成的固体物质称为血栓。 坏疽：组织坏死后，受外界环境影响和腐败菌继发感染而引起的变化。肉芽组织：即幼嫩的结缔组织。富含新生毛细血管和成纤维细胞并有炎症细胞浸润。 肿瘤：在致瘤因素的作用下, 机体局部组织的细胞在基因水平上失去了对其生长的正常控制，导致克隆性异常增生形成的新生物。这种新生物常形成局部肿块，故称肿瘤。 疾病：是动物机体在一定病因作用下，引起的损伤与抗损伤反应，由于稳态调节紊乱，从而引起一系列功能、代谢和形态结构改变，临床出现许多不同的症状和体征：使机体与外环境的协调关系发生障碍，这种异常的生命活动过程，称为疾病。 瘀点：漏出性出血时，在皮肤、粘膜、浆膜和实质器官呈点状出血，称为血点或瘀点。瘀斑：严重时，呈斑块状出血，称为血斑或瘀斑。坏死：活体内局部组织或细胞的病理性死亡，称为坏死。 萎缩：由于物质代谢障碍，发育正常的组织，器官或细胞，发生体积缩小，功能减退的过程称为萎缩。 绒毛心：纤维素性心包炎时，心脏表面覆盖有易于剥落的黄白色薄层纤维素。病程稍长的病例，这种纤维素因心跳动而摩擦牵引、形成绒毛状，称为绒毛心。 修复: 机体对死亡细胞、组织的修补性生长过程及对病理产物的改造过程。肉芽组织：是由毛细管内皮细胞和成纤维细胞分裂增殖形成的幼稚的结缔组织。 炎症：机体在致炎因素作用下产生的防御意义的应答反应。炎症介质：在致炎因素的作用下，由细胞或血浆产生的参与引起炎症反应的化学活性物质。脱水：机体内水分因摄入不足或丧失过多，所造成水的负平衡，称为脱水。 水肿：是指过多的液体在组织间隙或体腔中积聚。 动脉性充血：指由于小动脉扩张而流入局部组织或器官中的血量增多。又称“主动性充血”，简称“充血”。 静脉性淤血：指由于静脉血液回流受阻而引起局部器官或组织中的血量增多，简称“淤血”。 渗出性出血：由于血管壁通透性增高，红细胞通过扩大的内皮细胞间隙和损伤的血管基底膜而漏出到血管外。 休克：微循环血液灌流不足导致重要器官机能代谢紊乱和结构损伤的一种全身性病理过程。 积水：指浆膜腔内有大量液体积聚。 病理性萎缩：依据病变范围可分为全身性萎缩和局部性萎缩 颗粒变性：指实质脏器的功能细胞胞浆内出现大量的细小的蛋白颗粒，同时细胞肿胀，功能低落。常见于心、肝、肾等实质脏器。 水泡变性：指实质脏器的功能细胞胞浆内出现大小不一的水跑，同时细胞肿胀，功能低落。常见于心、肝、肾等实质脏器。 脂肪变性：实质脏器的功能细胞胞浆内出现大小不一的游离脂肪小滴，同时细胞肿胀，功能低落。 凝固性坏死：在蛋白凝固酶的作用下，坏死组织发生凝固。坏死组织灰白或黄白色，质地干燥，界限清楚。有贫血性梗死、干酪样坏死、蜡样坏死、脂肪坏死。 坏疽：指组织发生坏死后，受外界环境影响和腐败菌感染而形成的特殊的病理学变化。 干性坏疽：常见于皮肤，坏死的皮肤干燥、变硬，呈褐色或黑色（由于硫化铁的影响）。 炎症渗出：炎症过程中，血液成份通过血管壁进入炎症灶的过程。 炎症浸润：炎症过程中，血液中白细胞穿过血管壁进入炎区，并在炎区组织间集聚，称之为炎症浸润。 虎斑心：心脏发生脂肪变性时，在正常心肌之间有灰黄色的条纹或斑点分布，外观上呈黄红相间的虎皮状斑纹，称为虎斑心。 肉芽组织：是指由毛细血管和成纤维细胞增殖形成的一种幼稚结缔组织。肉眼观呈颗粒状、鲜红色、质地柔软、类似肉芽。 出血性梗死：是指多发生在组织疏松的器官瘀血时，当其动脉阻塞后，梗死灶内组织间隙可容纳多量血液，而呈暗红色。 癌：是指来源于上皮组织的恶性肿瘤。 肉瘤：是指来源于间叶组织的恶性肿瘤。 心肌梗死：是指心脏冠状动脉供血区的持续性缺血，导致较大面积的心肌坏死。 黄疸：由于胆红素代谢障碍，胆红素在血液中积存过多，把机体的浆膜、粘膜、骨膜、脂肪等等染成黄色，称为黄疸。 蜂窝织炎：皮下或肌肉之间疏松结缔组织弥漫性化脓性炎症、称为蜂窝织炎。
动物组织细胞基因组DNA提取
动物组织细胞基因组DNA提取 一、实验原理 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。 二、仪器及试剂 1. 仪器： 恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌） 2. 试剂： （1）细胞裂解缓冲液： Tris (pH8.0) 100 mmol/L EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L NaCL 20 mmol/L SDS 10%
胰RNA酶20ug/ml （2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。 （3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。 （4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、 （5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。 三、操作步骤 1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml 的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。 2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行） 3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。 6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，5min。 8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。 9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。 10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
动物固体组织蛋白提取-Protocol
动物固体组织蛋白提取-Protocol
动物固体组织蛋白提取Protocol 1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。 2、裂解液配制：RIPA：PMSF=100：1，现配现用。（1000ulRIPA+10ulPMSF）。置入4℃冰上。 3、抽蛋白（应冰上进行）： a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般10ml管体系中加入：7-8粒磁珠、100mg组织、1mlRIPA+10ulPMSF、1 tablet Cocktail。 b、匀浆。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织
匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 c、将组织匀浆转入1.5ml的EP管中（eppendorf 管、离心管）。12000r/min 4°C 离心15min。 d、离心后EP管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的EP管中。可-80℃保存。 4、蛋白浓度测定。 a、配工作液：溶液A：溶液B=50：1（200ul：4ul）。 需测试复孔。标本X，则需A量=2*（X+1+1）*200；B=2*（X+1+1）*4。
动物的细胞和组织动物体结构与功能基本单位细胞
动物的细胞和组织动物体结构与功能基本单位 细胞 Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】
第一章动物的细胞和组织 1. 动物体结构与功能基本单位——细胞 2. 动物细胞周期与细胞分裂 3. 动物细胞的分化 4. 多细胞动物的组织、器官和系统 1 动物体结构与功能基本单位——细胞 细胞的发现及细胞学说的建立 细胞的发现 细小的细胞肉眼是看不见的，必须借助显微镜。 英国Robert Hooke (1665)自行设计制造了显微镜，在观察了软木薄片后，第一次表述了所看到的类似蜂巢的封闭状小室（实际为纤维质的细胞壁），并称之为cell。 荷兰Leeuwenhoek用改进的显微镜观察并发现了许多细菌、原生动物及动植物细胞，在1674年认识到了细胞核，同时还有其他一些科学家对细胞进行过研究。早期这种借助显微镜对细胞的观察持续了170多年，为细胞学说积累了丰富的资料。 细胞学说的建立： 1838——1839年，德国动物学家Schwann、植物学家Schleiden几乎同时分别对动植物研究后，提出了细胞学说：一切植物和动物都是由细胞组成，细胞是一切动植物的基本单位。 细胞学说提出的意义 人们通常认为：现代生物学的三大基石：细胞学说、进化论、遗传学。其中细胞学说又是生物学其他学科研究的基础。 细胞学说带动了生物科学和医学的发展，对整个生物学的发展起了巨大的促进和指导作用。细胞学的进一步发展需要有先进的研究技术，如：电子显微镜、分子生物学技术等极大地推动了细胞学研究。 细胞的基本感念
1.2.1 原生质 指细胞内所含的生活物质，由细胞膜包围，包括细胞核(nucleus)及其周围的细胞质(cytoplasm)。 1.2.2 细胞的大小和形状 细胞大小一般在10-100微米。最大的10厘米，如鸵鸟蛋；最小的微米，如支原体，衣原体等，必须借助显微镜观察。 细胞形状是多样性，举例说明。 1.2.3细胞的化学组成（自学） 细胞的基本结构 细胞按结构复杂程度可分为原核细胞和真核细胞两大类，如：细菌、蓝藻、支原体、放线菌等，由一个细胞组成，细胞小，为典型真核细胞的1/10，进化上古老（32亿年），胞内没有由膜包被的结构，如细胞核，线粒体等；真核生物是由原核细胞生物进化而来（17亿年），有一个或多个细胞构成，真核细胞结构复杂，又可分为植物细胞和动物细胞。 1.3.1 真核细胞和原核细胞的比较（结构） 原核细胞真核细胞 细胞壁蛋白质、磷脂、脂多糖、粘肽等 细胞膜两个致密层及中间透明区 细胞质核糖核酸和蛋白质，无高尔基体、细胞器的结构：有线粒体、 线粒体和内质网等细胞器（极少例外）叶绿体、内质网、高尔基 体、溶酶体、微管、微丝 等。 细胞核脱氧核糖核酸纤丝组成，无核膜，无核仁有明显的核仁和核膜
固体组织蛋白提取
固体组织蛋白提取 1. 每100mg固体组织剪碎后加入0.5 ml裂解液，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次；或用高速机械匀浆器12,000 rpm 破碎组织。注意：初始组织的量应在10-100mg范围。肝肾组织蛋白含量高，提取时应加较少量的组织，否则形成的蛋白膜厚、致密且难溶。 2. 取0.5ml组织匀浆液转移到1.5ml离心管，加2倍体积的(1 ml)抽提试剂充分混匀。室温或4℃静置10分钟，偶尔晃动。注意：(1)组织量<10mg且静置时间短30min，在下一步离心时所形成的蛋白膜易碎，此时可静置30min。(2)提取脂肪组织时应4℃静置40min 以上以充分去除油脂。 3. 10,000g 4℃离心10分钟，溶液分为两相，中间为蛋白膜。吸除上层液体；随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体。蛋白膜将附着于离心管壁。注意：(1)离心速度过高将使蛋白膜过于坚固，难以溶解。(2)如果初始组织量较少(<10mg)，离心后难以得到完整的蛋白膜，此时可吸去上下层液体，加入0.5-0.8ml纯乙醇混匀，10,000g 4℃离心5分钟。弃所有液体，蛋白沉淀在管底。 4. 敞开管口，室温10分钟空气干燥沉淀。 5. 每100mg组织所得到的蛋白加 200ml用户自备的缓冲液，
95℃煮10分钟。室温放置20分钟溶解沉淀。注意：(1)可4℃过夜溶解沉淀，偶有少量不溶性组织纤维碎片可离心去除。(2)有时染色体DNA可与蛋白质一起被抽提出来，溶解时则形成粘稠物。延长95℃热变性时间、不时振荡、用注射针头反复抽吸，有助于彻底打断DNA。 3．样本组织RNA提取：取液氮保存的肺组织，研碎后加入RNAisoTMPlus，将 研碎的样品完全覆盖，室温静置至样品完全融化，在研磨至裂解液呈透明状。移至离 心管后加入l／5l埘AisoTMPlus体积量的氯仿，用力振荡后移至离心管中，室温静置 5min。12，000rpm／min 4 0C离心15min，取出离心管吸取上清夜，移入新的离心管。向 上清中加等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min。12，000rpm／min 4"C离心10min。 弃取上清，加入75％的乙醇lml，洗涤管壁后12，000 rpm／min4。C离心5min，弃去乙醇。室温干燥沉淀5min后加入适量RNase．free水溶解沉淀，完全溶解后置于--80℃ 保存。 4．按照试剂盒说明在微管中配制反应混合溶液，将提取的RNA),II入微管后70℃ 反应5min，离心收集。依试剂盒说明依次加入5×reaction buffer，Ribolock Ribonuclease inhibitor和10 mM Dntp mix，混匀后离心收集。置于25℃5min。加入逆转录酶，然 后置于25℃10min，再置于42℃60min，加热到70℃10min停止反应。 组织剪碎，称重，加裂解液（含蛋白酶抑制剂）后匀浆，超声破碎也可以，注意要在冰上进行。然后12000转，10分钟，4度，离心取上清，测蛋白浓度，加loading buffer煮沸5-10分钟，做western 天根有一款样本保存液，能迅速渗入组织细胞，高效抑制RNase活性
动物固体组织蛋白提取-Protocol
动物固体组织蛋白提取 1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较 快。 2、裂解液配制：：100：1，现配现用。（100010）。置入4℃冰上。 3、抽蛋白（应冰上进行）： a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般10管体系中加入：7-8粒磁珠、100组织、110、 1 。 b、匀浆。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 c、将组织匀浆转入1.5的管中（管、离心管）。12000 4°C 离心15。 d、离心后管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的管中。可-80℃保存。 4、蛋白浓度测定。 a、配工作液：溶液A：溶液50：1（200：4）。 *200；2*（1+1）*4。 需测试复孔。标本X，则需A c、复孔，取蛋白6加入0.6管，再加入542O，混匀。即10倍稀释。 d、取20-25 10倍稀释蛋白样本加入96孔板平底板内，再加入200工作液，混匀振荡后，37℃30。 注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换，再加入工作液即起反应，应缩短时间。 e、酶标仪检测562吸光度。 f、计算蛋白浓度。 根据标准曲线，如 1.27450.1684 其中Y：蛋白浓度；X：吸光度。 最终蛋白浓度为：10*Y（、） g、蛋白样本放-80℃冻存。 大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。 法（法）： 原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料250结合，颜色从棕色变为蓝色，在595处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。 法： 原理：在碱性条件下，蛋白将还原为，与试剂形成紫色络合物，测定其在562处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 现对这两种方法进行比较： 一、实验材料：