淀粉样物质染色液(Puchtler 碱性刚果红法)使用说明
淀粉样物质染色液（Puchtler碱性刚果红法）使用说明
货号：G1533
规格：4×50ml
保存：室温，避光，3个月。
产品组成：
名称G1533储存
试剂A：苏木素染色液50ml RT，避光
试剂B：酸性分化液50ml RT
试剂C：氯化钠溶液50ml RT
试剂D：刚果红染色液50ml RT，避光
试剂E：Puchtler碱化液1ml RT
产品说明：
淀粉样物质是一种无固定形状的细胞外嗜酸性物质，可存在于不同的组织、器官，导致的疾病称为淀粉样变。淀粉样物质主要是由蛋白质构成，该蛋白大部分排列成反向的β折叠层结构。目前研究发现传统的甲紫染色法灵敏度低、特异性差，经典的而且有效的方法是刚果红染色，1922年Bennhold发现了刚果红可以用于活体内淀粉样物质的鉴别，并应用到组织切片。
淀粉样物质染色液(Puchtler碱性刚果红法)主要由刚果红染色液、苏木素染色液等组成。其染色原理在于淀粉样物质对刚果红比其他的组织结构具有更大的亲和力，其羟基与刚果红的氨基结合，从而使淀粉样物质染成红色。
操作说明（仅供参考）：
1、常规固定，脱水包埋。
2、切片厚度4μm，常规脱蜡至水。
3、入苏木素染色液浸染5min。
4、酸性分化液分化2～5s，立即入水终止分化，水洗2次后镜下控制至恰当程度。
5、自来水冲洗2min。
6、入Scott蓝化液或水洗返蓝。
7、自来水冲洗2min。
8、按氯化钠溶液:Puchtler碱化液=100:1的比例配制碱性氯化钠溶液，即配即用。切片入碱性氯化钠溶液浸染15-20min。
9、按刚果红染色液:Puchtler碱化液=100:1的比例配制碱性刚果红染色液，即配即用。切片直接入碱性刚果红染色液浸染20-30min。
10、无水乙醇快速轻轻冲洗2-3次。
11、二甲苯透明，中性树胶封固。
染色结果：
淀粉样物质粉红色或红色
细胞核蓝色
注意事项：
1、切片脱蜡应尽量干净，否则影响染色效果。
2、酸性乙醇分化液应密闭保存，一旦开启尽快用完。
3、刚果红染色液染色时尽量采用浸染，如果滴染，应置于湿盒防止溶液挥发。
4、碱性氯化钠溶液和碱性刚果红染色液即配即用。
5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
革兰氏染色的实验原理
革兰氏染色的实验原理 ●G＋细胞壁的网状结构致密，交联度高，用乙醇处理后，发生脱水作用，肽聚糖层孔径缩小，透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。 ●G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染呈红色。 涂片固定→结晶紫初染（碱性）→碘液媒染→乙醇（丙酮）脱色→番红复染（碱性）
◆◆◆原理： 当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的兰紫色，碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有舦聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，用酒精脱色时细胞壁脱水，使舦聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同，由于其细胞壁舦聚糖层较薄，类脂含量较高，，所以当脱色处理时，类脂质被酒精溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 ◆◆实验步骤： 1、制片 涂片——干燥——固定 2、初染 滴加结晶紫染色1——2分钟，水洗； 3、媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟； 4、脱色 滴加95%酒精脱色，25-30秒，立即水洗； 5、复染 用番红液复染约2分钟，水洗； 6、镜检 干燥后，用油镜观察。 细菌：细菌是一种具有细胞壁的单细胞微生物，在适宜条件下，能进行无性二分裂繁殖，其形态和结构相对稳定。一般体积微小，通常需要借助光学显微镜才能看到，其测量单位用微米表示。
PH1237 标准革兰氏染色液实验与操作方法
PH1237|标准革兰氏染色液 Standard Gramˊs Stain Catalog No：PH1237Size：?4×100mL|?4×250mL Store at RT 简介 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。 细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。 红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Standard Gramˊs Stain采用最经典的革兰染色配方,临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组份 名称4×100ml4×250ml Storage 试剂(A):结晶紫染色液100ml250ml RT避光 试剂(B):Gram碘液100ml250ml RT避光 试剂(C):脱色液100ml250ml RT 试剂(D):沙黄染色液100ml250ml RT避光 自备材料 1、接种环或挑取细菌的其他工具 2、酒精灯 3、载玻片 4、光学显微镜 操作步骤 (仅供参考)： 1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，混合均匀，涂成一薄层。 2、干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。 3、固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3~5次，每次1s，温度不宜过高，防止菌体蛋白变性，放置待凉后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。 4、初染：滴加结晶紫染色液染色1~2min，清水冲洗去染色液。 5、媒染：滴加Gram碘液，并覆盖载玻片，室温放置1~2min，水洗。 6、脱色：滴加脱色液，摇动10～30s，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液，终止反应。
抗酸染色——标准操作
抗酸染色 一、原理 本试剂盒采用WHO推荐的Ziehl-Neelsen法分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。 二、试剂 石碳酸复红染液、酸性酒精溶液、亚甲蓝溶液 三、方法 1.涂片：参见各标本操作程序涂片，涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰
2.固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色 3.染色 3.1 滴加石碳酸复红染液盖满玻片，染色10分钟或更久，无需加温 3.2 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水 3.3 滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1-2分钟，如有必要，需流水冲去溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止 3.4 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水 3.5 滴加亚甲蓝溶液，染色30秒钟 3.6 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检 3.7 一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块 四、结果判定 1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色
革兰氏染色液配制
革兰氏染色液 保质期：2-8度一年. 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，媒染剂碘液进入菌体后与结晶紫结合，革兰氏阳性菌对碘与结晶紫摄取量多且牢固，不易被酒精脱色。革兰氏阴性菌对碘与结晶紫摄取量少，不牢固，易被酒精脱色。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。 操作步骤： 1、标本处理： （1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。（2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm 离心10min.，取沉渣涂片染色。 2、涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的涂片进行染色。 3、染色方法： 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能会呈阴性反应。 （1）.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。 （2）.加上碘液后染色1分钟，水洗。 （3）.加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约30-60秒，水洗,吸去水分。
（4）.加上蕃红后，染色1分钟，水洗。 （5）.吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。 4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。 注意事项： 1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。 2．玻片通过火焰温度不能太高。 3．若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。 4．碘液变透明，则不能使用。 5.水洗时动作要轻柔,沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。 革兰氏染色液如果用量少，买现成的比较话算，如果用量大，自己配起来也溶液，就是试剂种类多了点。其配制方法如下： (1)结晶紫(crystal violet)液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸铵水溶液80mL 将两液混匀置24h后过滤即成。 (2)卢戈(Lugol)氏碘液：碘0.33g，碘化钾0.66g，蒸馏水100mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至100mL即成。配成后贮于棕色瓶内备用，如变为黄色即不能使用。 (3)95%乙醇：用于脱色，脱色后可选用以下(4)或(5)的其中一项复染即可。 (4)番红溶液：番红O(safranine，又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。
标准革兰氏染色液
标准革兰氏染色液 简介： 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram 于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G +)和革兰阴性菌(G -)两大类。细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Leagene Standard Gram ˊs Stain 采用最经典的革兰染色配方, 临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组成： 自备材料： 1、 接种环或挑取细菌的其他工具 2、 酒精灯 3、 载玻片 4、 光学显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、 涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与 的水混合均匀，涂成一薄层。 编号 名称 DM0015 4×10ml DM0015 4×100ml DM0015 4×250ml DM0015 4×500ml Storage 试剂(A): 结晶紫染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(B): Gram 碘液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(C): 脱色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 试剂(D): 沙黄染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 使用说明书 1份
微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色
微生实验报告 姓名： xx 专业年级：2011级生物技术 学号：1032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔
径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种： 金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂： 草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚： 乙醇=7:3），xx柏油。 3、器材： 废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片： 取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干： 让涂片自然晾干。 3．固定：
革兰氏染色法的步骤
革兰氏染色法的步骤 详细阐叙革兰氏染色法的步骤 浏览次数:174次悬赏分:0 |解决时间:2011-5-25 17:44 |提问者:肖箫 2011shaw 最佳答案 革兰氏染色 一、目的:在细胞发放之前,利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测,判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。 二、原理: 通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色。 三、实验用品准备: 灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器 四、操作: 1 涂片:取灭过菌的载玻片于实验台上,用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央,用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层,涂布面不宜过大。 2 干燥:将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。 3 固定:固定常常利用高温,手持载玻片的一端,标本向上,在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次,共约2-3秒种,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60℃),放置待冷后,进行染色。 4 初染:在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴,使染色液覆盖涂片,染色约 1min。 5 水洗:斜置载玻片,在自来水龙头下用小股水流冲洗,直至洗下的水呈无色为止。 6 媒染:用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上,使染色液覆盖涂片,染色约1min。
7细菌的革兰氏染色 (1)
微生物实验报告 细菌的革兰氏染色及形态观察 一、目的要求： 1、熟悉光学显微镜的使用方法。 2、掌握革兰氏染色法。 3、掌握大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的染色结果和形态特征 二、器材和器皿： 1、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 2、革兰氏染色液、香柏油、二甲苯 3、显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环等 三、实验原理： 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram 创立。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别很小，在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。 四、实验步骤： 1、取载玻片用纱布擦干，涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 2、涂片： 液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。 3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。 4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 5、染色：在菌膜上滴加草酸铵结晶紫液，染1min。 6、水洗：用蒸馏水轻轻冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。 7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。 9、复染：滴加蕃红复染约2min，水洗。至此，革兰氏染色结束。
增强革兰氏染色液
增强革兰氏染色液 简介： 在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Leagene Enhanced Gram ˊs stain 采用最经典的革兰染色配方进一步改进，使用复红复染液替代沙黄染色液，增强了染色效率，用于极难染色的细菌。临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与 的水混合均匀，涂成一薄层。 2、 干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。 3、 固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3~5次，每 次1s ，温度不宜过高，防止菌体蛋白变性，放置待凉后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。 4、 初染：滴加结晶紫染色液染色，清水冲洗去染色液。 5、 媒染：滴加Gram 碘液，并覆盖载玻片，室温放置，水洗。 6、 脱色：滴加脱色液，摇动，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液， 终止反应。 7、 复染：滴加复红复染液染色，水洗。 8、 干燥。镜检：置油镜观察。 编号 名称 DM0016 4×10ml DM0016 4×100ml DM0016 4×250ml Storage 试剂(A): 结晶紫染色液 10ml 100ml 250ml RT 避光 试剂(B): Gram 碘液 10ml 100ml 250ml RT 避光 试剂(C): 脱色液 10ml 100ml 250ml RT 试剂(D): 复红复染液 10ml 100ml 250ml RT 避光 使用说明书 1份
革兰氏染色
普通光学显微镜的使用及微生物形态观察与革兰氏染色法 胡雪芳 201300261033 【实验目的】 1.学习显微镜的结构、各部分功能和使用方法 2.学习细菌制片方法 3.学习细菌染色原理和方法 4.巩固无菌操作技术 5.学习图像结果的规范表示 【实验原理】 1.显微镜的结构和各部分功能 现代普通光学显微镜 利用目镜和物镜两组透 镜系统来放大成像，故又 常被称为复式显微镜。它 们由机械装置和光学系 统两大部分组成。在显微 镜的光学系统中，物镜的 性能最为关键，它直接影 响着显微镜的分辨率。而 在普通光学显微镜常配 置的几种物镜中，油镜的图1. 显微镜的构造放大倍数最大，对微生
物的研究最为重要，与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间加滴镜油，这主要有如下两方面的原因：1.1增加照明亮度 油镜的放大倍数可达100x，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照度却很大。而从显微镜的结构看，从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头）有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时，会因为射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率为1.52）。 1.2增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率和分辨力是指显微镜能辨别两点之间最小距离的能力。最小可分辨距离越小，分辨率越高。从物理学角度来看，光学显微镜的最小可分辨距离受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为： 最小可分辨距离= λ2NA 式中：λ为光源光波长，NA为物镜的数值孔径值。 光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4~0.7μm），而数值孔径值取决于物镜的镜口角和玻片与物镜间介质的折射率，可表示为： NA=n*sin? 式中：?为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距
革兰氏染色实验
革兰氏染色实验 革兰氏染色（Gram Staining）是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，可将细菌分成两类，即革兰氏阳性（Gram Positive）与革兰氏阴性（Gram Negative）。(这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年所发明)。 未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。 阳性紫色，阴性红色 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌： 革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要的病原菌。
革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆 菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎 双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克 雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢 疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜 血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍 乱弧菌、阴沟肠杆菌等。革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中 占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐药，产生“新德里金 属酶”（NDM-1）的绝大多数细菌都是革兰氏阴性菌（主要是大肠 杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌）。 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的两大类细菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。 细胞形态和结构 细胞的基本结构包括细胞壁和原生质体两部分。原生质体位于细胞壁内，包括细胞膜（细胞质膜）、细胞质、核质和内含物。另外细胞还含有有些特殊结构，主要有荚膜、芽孢、鞭毛和菌毛等4种。 1.细胞壁
革兰氏染色液配制
革兰氏染色液配制 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
革兰氏染色液 保质期：2-8度一年. 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，媒染剂碘液进入菌体后与结晶紫结合，革兰氏阳性菌对碘与结晶紫摄取量多且牢固，不易被酒精脱色。革兰氏阴性菌对碘与结晶紫摄取量少，不牢固，易被酒精脱色。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。 操作步骤： 1、标本处理： （1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。 （2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm?离心10min.，取沉渣涂片染色。
2、涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的涂片进行染色。 3、染色方法： 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能会呈阴性反应。 （1）.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。 （2）.加上碘液后染色1分钟，水洗。 （3）.加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约30-60秒，水洗,吸去水分。 （4）.加上蕃红后，染色1分钟，水洗。 （5）.吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。 4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。 注意事项：
抗酸染色概要(1)
夹层杯抗酸染色制片法概要 一：标本的预处理：消化和离心 1.将标本至于夹层杯中加消化液消化至液体清亮（2~5分钟可灭活细菌）（若是其它 容器取痰的，可小心的在痰上加些许消化液，待痰不再粘附其上后转入夹层杯）（夹 层杯可装液体不超过杯身三分之二）（非痰类标本亦须加适量消化液消化）。 2.将本杯置于离心机内对称平衡放稳，以4500转/分钟转速离心5分钟，弃去液体（轻 快的倒掉），放在干片机内烘烤（干片机提前开启至60度）。 二：染色：初染和洗脱和复染 1.加A液在60度温度下染色5分钟。 2.B液脱色（尽量将红色脱净）。 3.C液复染一分钟。 （每次弃去染色液后需以缓慢小水流沿杯壁将杯中剩余液体洗清沥干）。（加染液液量以可覆盖膜片为适量） 三：制片：取片和阅片 1.将染色后的片子烘干。 2.用取片针顶起杯底纳米膜片，用镊子夹出，轻轻印干水分，用中性胶倒封于玻片上， 弃去保护膜。（水分将会影响胶水对膜片的粘附） 3.阅片。（可利用“红十字”找寻视野） 四：注意事项 1.膜片上的细菌的保护：本制片法的原理为通过离心沉降并烘烤将目标菌粘附在膜片 上后进行染色，在操作过程中必须避免直接冲刷、液体剧烈振荡、大力印擦等而将 膜上已粘附的细菌冲走，这些失误会严重影响阳性率。 2.各标本间的交叉污染：标记混淆、杯中液体互溅、液体转移等将会使结果严重不可 靠。 3.脱色的程度：脱色不完全将导致膜上非抗酸菌或其它物质也呈现红色，脱色过久过 重会影响抗酸杆菌所着色，二者都将影响后续镜检。 4.B液：其重要成分为酒精盐酸，易挥发，用完务必盖好盖子。 5.操作时间段的把握：请有效利用机器与时间间隔，避免标本堆积。
2021年革兰氏染色实验步骤
革兰氏染色 欧阳光明（2021.03.07） 一．实验流程： 1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 2、涂片： 液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。 3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。 4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 5、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。 6、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。 7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液
无紫色，立即水洗。 9、复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。 二．染色结果：革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。 备注： 1.革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌。 2.革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。
实验二 革兰氏染色法
实验二革兰氏染色法 【实验目的】 1.学习并初步掌握革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 3.巩固显微镜油镜的使用方法。 【实验仪器、材料】 1.菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌菌液。 2.染色剂：革兰氏染色试剂盒（结晶紫染色液、碘液、脱色液（95%乙醇）、复红染液）。 3.仪器及其他物品： 显微镜、香柏油、无水乙醇、载玻片、擦镜纸、滤纸、酒精灯、试管架、废液缸、记号笔、接种环、镊子、打火机等。 【实验内容】 革兰氏染色法 一、染色标本制备 1.涂片取一张洁净的载玻片，滴加少许生理盐水，用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，与生理盐水研磨均匀，做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（事先在载玻片的反面滴加菌液的相应位置做好标记） 2.干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥。(温度不宜过高) 3.固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常
用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 二、染色 l.初染滴加结晶紫覆盖菌膜，染lmin，自来水缓缓冲洗，甩去积水。 2.媒染滴加卢氏碘液，染lmin，水洗，甩去积水。 3.脱色滴加95%乙醇数滴，20s~30s，见紫色脱下立即用水冲洗，甩去积水。 4.复染滴加石炭酸复红液，染lmin，水洗，甩去积水，标本片用滤纸吸干。 三、镜检 待染色片充分干燥后，用油镜观察。 【实验结果】 葡萄球菌呈葡萄状排列，呈紫色，为革兰氏阳性菌； 大肠杆菌为散在的短小杆菌，呈红色，为革兰氏阴性菌。 注：绘图展示染色结果 【结果分析、讨论（结论与评价）】 注：分析你的染色结果是否正确？如果不正确，请分析原因。
革兰氏染色液使用说明
革兰氏染色液使用说明 货号：G1060 规格：10ml/100ml 保存：阴凉处保存，保质期1年。 产品内容: 结晶紫；碘液；95%酒精；蕃红。 产品简介： 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌细胞壁较厚，肽聚糖网层次较多且交联致密，乙醇脱色时，肽聚糖脱水使孔径缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。革兰氏阴性菌细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，脱色后类脂外膜迅速溶解，缝隙加大，结晶紫与碘复合物溶出，因此乙醇脱色后再经番红复染，呈红色。 操作步骤： 1.涂片固定 菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2.染色 一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。 （2）加上碘液后染色1分钟，水洗。 （3）加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约20-60秒，水洗，吸去水分。 （4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。 （5）吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌 可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄 也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌体自行溶解， 都常呈阴性反应。 3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以均匀分散 开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈现假阳性。 注意事项： 1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。若涂片较厚，应延长脱色 时间，直至不再出现紫色为止。 2．玻片通过火焰温度不能太高。 3．碘液变透明，则不能使用。 4．水洗时动作要轻柔,沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。
细菌革兰氏染色液
革兰染色液说明书 【产品名称】 革兰染色液 【包装规格】 货号：DM0016 单瓶包装规格分别为：20ml、100ml、250ml、500ml、5000ml； 每套/盒包装规格分别为：4×20ml/盒、4×100ml/盒、4×250ml/盒、4×500ml/盒。 【预期用途】 用于细菌或真菌的涂片染色。 【检验原理】 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是由肽聚糖层厚度和结构决定的，经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时显现红色，红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来；在革兰阳性细胞染色中乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁不易脱色，所以保持着紫色。革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法(属复染法)，可用于标本涂片或菌落涂片，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以临床分类鉴定，染色结果将细菌分为革兰氏阳性菌(紫色)和革兰氏阴性菌(红色)两大类。 【主要组成成分】 试剂组成主要成分 1、结晶紫染色液结晶紫、乙醇 2、碘溶液碘、碘化钾 3、脱色液乙醇、水 4、沙黄染色液或复红染色液沙黄染色液：沙黄、乙醇 复红染色液：品红、乙醇 【储存条件及有效期】 5℃～35℃保存，原包装未开封染色液的有效期为24个月，在有效期内的已开封染色液应在开封后6个月内使用完，每次用后应及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。 【样本要求】 涂片时必须注意细心操作，涂片薄而均匀；制备的涂片应自然干燥，采用加热固定时，固定温度不宜过高，以背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变影响观察结果。 【检验方法】 1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与水混合均匀，涂成一薄层； 2、干燥、固定：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，也可以用甲醇或乙醇固定； 3、染色。 4、滤纸吸干或在空气晾干，镜检。 【检验方法的局限性】 采用陈旧标本涂片时有产生假阴性的可能。 【注意事项】 1、涂片之前，应事先在背面做好圆圈标记，以便判断后续试验的位置。 2、取细菌时，应注意自我防护，拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在
实验四 细菌的革兰氏染色与芽孢染色
实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色 一、目的要求 1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、实验材料 1.菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli） 2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液 3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。 三、实验原理 革染氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。 革染氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革染氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革染氏阴性菌。大肠杆菌是标准的革染氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革染氏阳性菌。 革染氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶紫初染以后，所用的细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革染氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革染氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上红色。 四、操作步骤 1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。 2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。 3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。 4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载 玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染色中最关键的一步。 6.复染：滴加番红液，染色2min，水洗。 7.用滤纸吸干，油镜镜检。 五、注意事项 为了保证革染氏染色结果的正确性，制片过程中要注意：要选用活跃生长的幼培养物作革染氏染色，涂片不宜过厚，火焰固定不已过热，脱色时间的控制。另外，可选用标准的革染氏阳性菌和革染氏阴性菌和未知菌一起混合涂片和染色。 六、实验内容 1.分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行革兰氏染色 2.对上述两种菌进行混合涂片，再进行革兰氏染色。 七、实验报告
实验三-普通光学显微镜的使用方法及细菌的革兰氏染色法
实验三-普通光学显微镜的使用方法及细菌的革兰氏染色法
实验三普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色、革兰氏染色法 生科15.2 周罡201500181104 【实验目的】 1.复习光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。 3.掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能，了解球菌、杆菌、放线菌、酵母、真菌在光学显微镜下的基本形态特征。 4.学习并掌握微生物的制片及简单染色的基本要求。 5.学习并掌握革兰氏染色法。 6.了解革兰氏染色原理。 7.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。【实验原理】 （一）普通显微镜的基本原理 1.基本原理 现代普通光学显 微镜利用目镜和物镜 两组透镜系统来昂达 成像，故又称为复式显 微镜。它们包括机械部
分和光学部分两部分。机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。 显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的 乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。 2.油镜微生物学使用的显微镜的物镜通 常有低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），油镜是三者中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与
实验七革兰氏染色法doc资料
实验七革兰氏染色法
实验四革兰氏染色法 一、目的要求 了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌； 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤
革兰氏染色标准操作程序
革兰氏染色标准操作规程 1 目的 确保革兰氏染色的正确操作，使革兰氏染色的操作得到有效控制，以提供稳定的实验结果。 2 适用范围 适用于本公司微生物实验室革兰氏染色实验。 3 职责 实验室技术人员应遵循此程序，确保按标准操作规程进行革兰氏染色。 4 程序 4.1革兰氏染色原理 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层较多且交联致密，故遇丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故丙酮处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过丙酮脱色后仍呈无色，再经番红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 4.2实验物品 灭菌玻片、接种环、移液器、酒精灯、计时器、显微镜、香柏油、革兰氏染色液等。 4.3实验步骤 4.3.1涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液器吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用移液器分别吸取10ul金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌位于待检品的两侧（中间要有足够的空间），分别作为阴阳性对照。用无菌接种环将液滴涂布成均匀的薄层，涂布面不宜过大。
4.3.2干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯火焰高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 4.3.3固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉得烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。 4.3.4初染：在涂片薄膜上滴加革兰氏结晶紫试剂1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 4.3.5水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 4.3.6媒染：取1-2滴革兰氏碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 4.3.7水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 4.3.8脱色：斜置载玻片，滴加革兰氏脱色剂脱色，至流出的脱色剂不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。 4.3.9复染：在涂片薄膜上滴加革兰氏番红精复染剂1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 4.3.10水洗：斜置载玻片，用洗瓶小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 4.3.11干燥：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下观察。 4.3.12观察：待标本片干后置显微镜下观察，用低倍镜观察，发现目标物后滴一滴香柏油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色。 4.4结果判定 显微镜观察由金黄色葡萄球菌制成的标本显示葡萄球状蓝紫色，大肠埃希菌制成的标本显示杆状红色，则实验过程有效。一方不成立则实验结果无效。 此时，如果样品在显微镜下呈蓝紫色，则判定样品菌株为革兰氏阳性菌；如果样品在显微镜下呈红色，则判定样品菌株为革兰氏阴性菌。 4.5实验结束 4.5.1实验结束后，按显微镜使用、维护和保养规程的要求，关闭和清洁显微镜。 4.5.2实验过程中用到的带菌工具，根据工具的不同选择不同的灭菌方式，确保物品丢弃前均已灭菌。