细菌分离培养
试验一细菌分离培养
试验目的：1、掌握培养基的原理、分类及配置方法。
2、熟悉无菌操作技术、细菌标本的分离、纯化接种方法
3、熟悉细菌培养所用的基本仪器及使用方法。
试验仪器：生物安全柜、电热恒温培养箱、电冰箱、低温冰箱、蒸汽高压消毒器、超净工作台、电子天平、普通光学显微镜、鼓风干燥箱，电磁炉，微
波炉等
试验材料：
1、菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌（阴性、阳性各一）。
2、培养基：普通琼脂培养基（斜面、平板）。
试验步骤：
1、绪论录象（约30分钟）
2、宣读微生物实验室规则
3、细菌接种：
①平板倾注，每人倾注一个平板；
②平板划线，四区划线，分离单个菌落。
③细菌斜面接种。
4、结果报告
5、讨论
讲述：
一、细菌的人工培养
微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、气体环境、pH等。微生物的种类不同，培养的方式和所需要的条件也不尽相同。
（一）影响微生物生长的因素
微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到外界许多因素的影响。影响微生物生长的因素很多，简要介绍如下。
1) 营养物质
细菌所需要的营养浓度非常之低，所以在自然界中，它们到处生长，可谓是无孔不入。然而营养太低时，细菌生长就会遇到困难，甚至还会死亡。故有的营养要求相对较高的细菌，培养时需加相应的营养物质，以维持其生长需要。
２）温度
在一定的温度范围内，每种微生物都有自已的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。微生物只有处于最适生长温度时，生长速度才最快，待时最短。超过最低生长温度，微生物不会生长，温度太低，甚至会死亡。超过最高生长温度，微生物也要停止生长，温度过高。也会死亡。一般情况下，每种微生物的生长温度三基点是恒定的。但也常受其它环境条件的影响而发生变化。
根据微生物最适生长温度的不同，可将它们分为三个类型：
a.嗜冷微生物：其是适生长温度多数在- 10℃－20℃之间
b.中温微生物：其最适生长温度一般在20℃－45℃之间
c.嗜热微生物：生长温度在45℃以上。
３）湿度
水分是微生物进行生长的必要条件。芽孢、孢子萌发，首先需要水分。微生物是不能脱离水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生长，而不能生活在纯水中。各种微生物在不能生长发育的水分活性范围内，均具有狭小的适当的水分活性区域。
４）气体
A 氧气按照微生物对氧气的需要情况，可将它们分为以下五个类型。
a.需氧微生物
这类微生物需要氧气供呼吸之用。没有氧气，便不能生长，但是高浓度的氧气对需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧气浓度大于大气中氧气浓度的条件下生长。绝大多数微生物都属于这个类型。
b.兼性需氧微生物
这类微生物在有氧气存在或无氧气存在情况下，都能生长，只不过所进行的代谢途径不同罢了。在无氧气存在的条件下，它进行发酵作用，例如酵母菌的无氧乙醇发酵。
c.微量需氧微生物
这类菌是需要氧气的，但只在0.2大气压下生长最好。这可能是由一它们含有在强氧化条件下失活的酶，因而只有在低压下作用。
d.耐氧微生物
这类微生物在生长过程中，不需要氧气，但也不怕氧气存在，不会被氧气所杀死。
c.厌氧微生物
这类微生物在生长过程中，不需要分子氧。分子氧存在对它们生长产生毒害，不是被抑制，就是被杀死。
B其他气体：有的细菌生长需要氮气、二氧化碳等气体
物理因素：如射线----日光、紫外线、声波；
5）其他因素：化学因素：Ph、消毒剂、防腐剂等
生物因素：抗生素、细菌素、噬菌体等
（二）培养基
营养成分：水、氮源、碳源、无机盐、生长因子
1、培养基的主要成分凝固物质：琼脂、明胶、卵蛋白及血清等
抑制剂：加入某些化学物质（如抗生素等药物），
抑制某些非目的菌生长，有利于目的菌的生长
培养基、厌氧培养基
2、培养基的分类按固型成分：固体培养基（2-3%）平板、斜面
半固体培养基（0.25-0.3%）
液体培养基
按工艺：天然培养基、人工培养基
3、培养基的制作过程：配料---溶解---调pH---过滤---分装---高压灭菌---
（必要时要做检菌试验）备用
（三）、培养方法
根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。
1、需氧培养：也称“ 好气培养”。就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。
2、二氧化碳培养：某些细菌（如布鲁菌、脑膜炎奈瑟菌等）须在一定浓度的二氧化碳环境中才能生长；常用烛缸法、化学法、二氧化碳培养箱
3、厌氧培养：也称“ 厌气培养”。这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。
常用：疱肉法、焦性没食子酸法、硫乙醇酸钠法、气袋法、厌氧罐法、厌氧箱培养法
4、微需氧培养法：有些微需氧菌（如幽门螺旋菌等）在低氧压的条件下生长良好，可用抽气换气法充5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气于培养罐中，37度培养。
（四）接种方法选择
含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化。
平板的用途：
①供分离划线；分离划线的目的是为了得到单个菌落，以备进一步鉴定；
②扩大培养，得到更多的菌苔。
斜面的用途：
①斜面培养一般用于保存菌种。
②纯培养以得到更多菌苔，用于鉴定。
无菌操作
培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。
二、示教：
1、接种环的制作及使用：接种环的拿法及注意事项；
接种和分离工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
2、平板的倾注方法；琼脂量约占平板深度的1/3-1/2为宜。
3、细菌平板四区或三区划线方法：平板的拿法，划线时手法要轻、密，但不能重叠。
平板培养基接种的分离培养法
4、斜面接种方法:蛇形划线。
注意事项：
1、倾注平板时，皿盖要半开，留有通气孔，待琼脂凝固后立即盖上皿盖，翻转
放置，以防蒸馏水流淌到培养基上，影响培养结果。（平板表面有水，
影响分离；蒸馏水由抑制细菌生长作用）
2、先做标记后操作，试管标记在管壁上，平板标记在皿底上。
3、平板划线时要尽可能轻且密，切忌用力过重划破琼脂和重复划线，失去分离
意义。
4、斜面蛇形划线，可反复重复划。
5、培养时，试管要站立培养，以防长生蒸馏水影响结果；而平板要倒扣既皿底
朝上培养，防污染。
报告要求：
1、准备一个本子，一定要有封皮，本皮写上课程名称、专业、年级、姓名及学
号
2、每个试验报告要另起一页，要有题目、目的、材料、步骤、结果及讨论，缺
一不可。
3、值日生要严格履行职责，认真清扫，关好水、点、门窗，离开实验室前要吿
知带教老师。
实训六 细菌的分离、移植及培养
实训六细菌的分离、移植及培养性状的观察 目的要求能利用不同的被检材料进行细菌的分离培养，观察细菌的培养特性，并会进一步移植培养。 仪器及材料温箱、病料、实验用菌种、营养琼脂培养基、肉渣汤(疱肉)培养基、接种环、酒精灯、烙刀、镊子、剪子等。 方法与步骤 (一)细菌的分离培养 1．平板划线分离法（视频四）平板划线是通过将被检材料连续划线而获得单个菌落，因而划线愈长，获得单个菌落的机会也愈多。具体操作步骤如下： (1)右手持接种环于酒精灯上烧灼灭菌，待冷。 (2)无菌操作取病料若为液体病料，可直接用灭菌的接种环取病料一环；若为固体病料，首先将烙刀在酒精灯上灭菌，并立即用其将病料表面烧烙灭菌，然后用灭菌接种环从烧烙部位插入组织中缓缓转动接种环，取少量组织或液体。 (3)左手持平皿，用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧(角度大小以能顺利划线为宜，但以角度小为佳，以免空气中细菌污染培养基)。 (4)将已取被检材料的接种环伸入平皿，并涂于培养基一侧，然后自涂抹处成30～40°角，以腕力在平板表面轻轻地分区划线。 在细菌病诊断或药敏试验时，为了提高效率，常可将皿盖放于酒精灯附近，左手持培养基，使划线的平面与右侧台面的角度小于90°且在酒精灯附近，右手持接种环取病料连续划线。 (5)划线完毕，烧灼接种环，将培养皿盖好，用记号笔在培养皿底部注明被检材料及日期，倒置37℃温箱中，培养18～24h观察结果(实图6-1)。凡是分离菌应在划线上生长，否则为污染菌。 2．倾注分离法取3支融化后冷至50℃左右的琼脂管，用灭菌的接种环取一环培养物(或被检材料)移至第一管中，随即用掌心搓转均匀，再由第一管取一环至第二管，搓转均匀后，再由第二管取一环至第三管经同样处理后，分别倒入三个灭菌培养皿中，待凝固后，倒置于37℃温箱中培养24h观察结果。(实图6-2) (二)厌氧菌的分离培养厌氧菌的分离培养常用肉渣汤(疱肉培养基)培养法。先将试管倾斜，使培养基表面露出一点，然后接种被检材料或菌种，接种后将试管直立，即封闭液面。最后置37℃温箱中培养24～48h。 (三)细菌移植 1．斜面移植(实图6-3) (1)左手持菌种管及琼脂斜面管，一般菌种管放在外侧，斜面管放在内侧，两管口并齐，管身略倾斜，斜面向上，管口靠近火焰。 (2)右手拇指、食指及中指持接种环在酒精灯上烧灼灭菌。 (3)将斜面管的棉塞夹在右手掌心与小指之间，菌种管棉塞夹在小指与无名指之间，将二棉塞一起拔出。 (4)把灭菌接种环伸入菌种管内，挑取少量菌苔将其立即伸入斜面培养基底部，由下而上在斜面上弯曲划线，然后管口和棉塞通过火焰后塞好，接种环烧灼灭菌。
痢疾杆菌分离与鉴定培训
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
实验四：细菌的接种、培养和分离技术
实验四：细菌的接种、培养和分离技术 一、实验目的与要求： （1）掌握从环境（土壤、水体、活性污泥等）中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能 （2）掌握细菌纯种分离的方法：稀释平板分离法和平板划线法。 （3）掌握几种接种技术：斜面接种技术、穿刺接种、稀释平板涂布法等。 二、实验原理 在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养。一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 三、实验器材 1、牛肉膏蛋白胨培养基 2、盛9ml无菌水的试管，盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，1ml和5ml无菌 吸管，无菌培养皿； 3、接种环，土样，酒精灯等。 四、操作步骤 1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，并标明培养基的名称。 2、贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口径2-3厘米的位置。 3、点燃酒精灯。 4、接种 取接种环右手拿接种环(如握钢笔一样)、在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。 环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触边壁，使其冷却。 取菌种待环冷却后轻轻沾取经稀释10倍的土壤悬液-环，然后将接种环移出菌种管，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。 接种在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环在平板上划线。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种： ⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图A)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。 ⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线(图B)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。 环灭菌将接种环烧红灭菌。 5、挑菌将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置25℃和28℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
微生物检验第九章 细菌的培养与分离技术讲义
第九章细菌的培养与分离技术 本章内容 一、基本条件 二、细菌的接种与分离技术 三、细菌培养的方法 四、细菌的生长现象 五、细菌L型的检查 基本条件 （一）细菌实验室：生物安全柜。 （二）无菌实验室 （三）基本设备和器具：温箱、CO2培养箱、厌氧培养设备；显微镜；高压蒸汽灭菌器、干烤箱；接种环和接种针；火焰灯或酒精灯；平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。 细菌的接种与分离技术 平板划线分离法：分散生长，各自形成菌落。 连续划线法：杂菌不多。 分区划线法：杂菌多。 斜面接种法：单个菌落纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。 液体接种法：多用于一些液体生化试验管的接种。 穿刺接种法：半固体培养基，接种针。 倾注平板法：测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数。将标本适当稀释后，取一定量加入已灭菌的平皿内，再倾入已溶化并冷却至45℃左右的定量培养基，混匀，待凝固后倒置、培养。
涂布接种法：常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。 细菌的培养方法 培养条件：根据临床初步诊断及待检细菌的种类，选用不同环境条件进行培养。 细菌的生长现象 分离培养基上菌落的生长现象 观察菌落的大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度等。 血琼脂上的溶血： α溶血：菌落周围出现绿色环状，红细胞外形完整无缺。 β溶血：菌落周围形成一个完全清晰透明的环，红细胞溶解。 γ溶血：没有溶血，红细胞无溶解。 双环：菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部分溶血的第二圆圈。 气味 液体培养基中的生长现象 肉汤培养基的混浊度、沉淀、菌膜，气味和色素等。细菌数量达106～107CFU/ml，培养肉汤才见混浊。
实验三 细菌纯种分离、培养和接种技术
实验三细菌纯种分离、培养和接种技术 一、实验目的 (1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。 (2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。 (3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。 二、实验原理 水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。它反映的是检样中活菌的数量。 所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称。水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。 水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。 三、实验材料 1、菌落总数的测定： 1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。 2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。 2、大肠菌群的测定： 1)培养基： ①乳糖胆盐蛋白胨培养基： 蛋白胨20g，胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。 制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，121℃灭菌15min。 ②伊红美蓝琼脂培养基： 制法：将伊红美蓝琼脂粉溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。 平板划线法：接种是采用平板划线的方法将初发酵的大肠杆菌进行接种。
细菌分离培养及药敏试验方法及步骤
细菌分离培养方法及操作步骤 无菌取血液或脏器、淋巴结划线接种于鲜血琼脂平板或血清琼脂平面培养基、普通肉汤培养基，37℃恒温培养24 h，观察其生长特性。目前细菌分离培养的常用方法有平板划线分离法、加热分离法和实验动物分离法。 平板划线接种法 这是目前临床上最常用的分离接种方法。它可以从被检病料中通过划线可使细菌分离、分散生长而形成单个菌落（有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌），以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。具体操作： 1、右手持接种环，在酒精灯上火焰灭菌； 图1 病料采集图2 接种环灭菌 2、待接种环冷却后，挑取被检料少许，左手持琼脂平板，以食指为支点，用拇指和无名指将平皿揭开一空隙。大约20℃时，迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基的边缘。
3、在涂布处来回移动作曲线形划线接种。（注意：划线时，以腕力使接种环在琼脂平板表面划动，尽量不要划破培养基，划的线条要密，但不能重复旧线，以免培养物形成菌苔。） 图3 平板划线接种法 4、划线完毕，合上平皿盖，将琼脂平板倒置，放入37℃温箱内培养18－24小时。 注意：分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37℃孵育箱内30分钟，这样表面即干燥有利于分离培养，又使培养基预温，对培养某些较娇弱的细菌有利。
细菌药敏试验方法操作步骤 药敏试验是抗菌药使用以前必不可少的一个基本环节，一个正确的药敏结果能够科学的指导养殖户用药，减少抗菌素使用的盲目性，从而减少养殖户损失。在临床实际生产中具备重要意义。 1、在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。 图4 接种环划线 2、以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。
细菌分离培养及移植
细菌分离培养及移植 在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。 [目的要求] (1)掌握细菌分离培养的基本要领和方法。 (2)掌握厌氧菌培养的原理及其方法。 [实验材料] 菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤等。 器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。 培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂和鲜血琼脂平板、酒精灯、接种环(以上每人一套)。 [需氧性细菌分离培养法] 1．划线分离培养法此法为常用的细菌分离培养法。平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点：
(1)左手持皿，用左手的拇指、食指及 中指将皿盖揭开呈20。左右的角度(角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染)。 (2)右手持接种环，从大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤中取少许材料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线，方法如图(5-l)。 (3)划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。 (4)划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。 (5)接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置37℃培养。 2．纯培养的获得与移植法将划线分离培养37℃24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验等。具体操作方法如下：
(完整版)细菌培养技术
第二节细菌培养检测技术 节概述 细菌的培养技术是微生物实验中基本技术之一。大多数细菌均可用人工方法培养，只有将细菌培养出来才能对它进行研究和鉴定 知识点导航 一.培养基的种类 培养基（culture medium）是细菌生长繁殖所需要的各种营养物质的人工制品。适宜的培养基 能使细菌在体外迅速生长繁殖，便于对细菌进行分离和鉴别。可分为基础培养基、营养培养基、选 择培养基、鉴别培养基、厌氧菌用培养基和特殊培养基。 （一）基础培养基 只含有细菌生长所需的最基本营养成分，应用最广泛，为制备多种培养基的基础，常见的有肉 汤培养基、琼脂培养基。 （二）营养培养基 在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、腹水或酵母浸膏等有机物，可供营养要求较高的细 菌生长需要或增菌用。如结核分枝杆菌培养基中添加鸡蛋、马铃薯、甘油等。 （三）选择培养基 利用不同种类细菌对化学物质的敏感性不同而制成，使分离菌大量繁殖而抑制其它细菌生长的 培养基。培养基中含有的抑制剂能抑制非目的菌生长或使其生长不佳，有利于目的菌的检出和识别 。选择培养基多为固体平板，用于从标本中分离某些特定的细菌。 （四）鉴别培养基 培养基中加有某些特定成分，如糖、醇类和指示剂等，用于检查细菌的各种生化反应，以资鉴 别和鉴定细菌。 （五）厌氧菌用培养基 专性厌氧菌须在无氧条件下才能生长，故需在培养基中加入半胱氨酸、硫乙醇酸钠等还原剂，降低培养基中氧化还原电势，并应与外界空气隔绝，使培养基本身为无氧的环境。 （六）特殊培养基 为某些需要在特殊条件下才能生长的细菌培养之用。如高渗盐增菌培养基、高渗糖增菌培养基、改良Kagan氏培养基等。 二.培养基的制备 制备一般培养基的主要过程基本相似，包括调配、溶化、调整pH、过滤、分装、灭菌及检定和 保存。 三.细菌检验室的注意事项及无菌技术
初中八年级(初二)生物 实验四细菌的分离培养及培养性状的观察
实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察 在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。 目的要求 1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。 2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。 3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。 4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。 操作步骤 一．需氧性细菌分离培养法 1. 平板划线分离法 菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。 但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。划线法示意图见图4-3。 （1）连续划线法 以无菌操作用接种环直接取 平板上待分离纯化的菌落。将菌种 点种在平板边缘一处，取出接种环， 烧去多余菌体。将接种环再次通过 稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平 板边缘空白处接触一下使接种环 冷却，然后从接种细菌的部位在平 板上自左向右轻轻划线，划线时平 板面与接种环面成30～40度角， 以手腕力量在平板表面轻巧滑动 划线，接种环不要嵌入培养基内划破培 养基，线条要平行密集，充分利用平板 表面积，注意勿使前后两条线重叠。划 线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷 却后放置接种架上。培 养皿倒置于适宜 的恒温箱内培养。培养后在划线平板上 观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。 (2)分区划线法（四分区划线法） 取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法划线分离时平 图4-1连续划线法 图4-2分区划线法 图4-3 划线分离示意图
细菌的分离培养及培养性状的观察
实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察 在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。 目的要求 1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。 2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。 3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。 4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。 操作步骤 一．需氧性细菌分离培养法 1. 平板划线分离法 菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。 但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。划线法示意图见图4-3。 （1）连续划线法 以无菌操作用接种环直接取 平板上待分离纯化的菌落。将菌种 点种在平板边缘一处，取出接种 环，烧去多余菌体。将接种环再次 通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板， 在平板边缘空白处接触一下使接 种环冷却，然后从接种细菌的部位 在平板上自左向右轻轻划线，划线 时平板面与接种环面成30～40度 角，以手腕力量在平板表面轻巧滑 动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平 板表面积，注意勿使前后两条线重叠。 划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待 冷却后放置接种架上。培 养皿倒置于适 宜的恒温箱内培养。培养后在划线平板 上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片 镜检为纯种后再接种斜面。 (2)分区划线法（四分区划线法） 取菌、接种、培养方法与“连续划 线法”相似。分区划线法划线分离时平 板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最图4-1连续划线法 图4-2分区划线法 图4-3 划线分离示意图
病原菌的分离培养和纯化
普通植物病理学 实验十七、病原菌的分离培养和纯化 一、目的要求 (1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。 (2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。 (3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。 二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。 三、材料、仪器与用具 1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考) (1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。 (2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。 (3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。 (4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。 (5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。
(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。 (7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。 (8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms 。 (9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。 (10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。 2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。 3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml。先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心。 四、实验操作 (一)病原真菌的分离 1．组织分离法按照以下步骤进行： (1)取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。 (2)用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60c 左右的pda培养基倒人培养皿中，每皿倒10--15ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示：加入25％乳酸1～2滴，可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／ml)可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b(5．0μg／ml)可以抑制g—细菌生长；加链霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／ml)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)’时加
实验四细菌的分离培养及培养性状的观察
实验四细菌的分离培养及培养性状的观察 在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污 1 2 连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20ml培
养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。划线法示意图见 图4-3。 （1）连续划线法 将菌 取出接 养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯 种后再接种斜面。 (2)分区划线法（四分区划线法） 取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法
划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖， 2次平 . 至约 分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样方法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37℃温箱内培养24h。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板内的菌落数较多而
密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。 3.芽胞需氧菌分离培养法 如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于80℃水浴箱中维持15～20分钟，或85℃加热10分钟，再进行培养。材料中若有带芽孢的细菌仍可存活而 而对 放入灭菌乳钵或组织匀浆器内，加3～5倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下或静脉）入易感实验动物,待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。例如，疑有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再
细菌鉴定学习
现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告 课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验 实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察 学生姓名：专业：环境工程学号： 同组学生姓名： 指导老师： 实验地点：实验日期：2018 年 10月16日 一、实验目的和要求 1.掌握微生物接种培养技术 2.掌握微生物分离纯化技术 3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。 二、实验内容和原理 土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。 1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离 与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分 离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的 混入。 2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且 采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微 生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可 以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数 3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表 面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落 的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。用途一般多用于筛选菌株。一般用 于平板培养基的回收率计数。优点是可以计数，可以观察菌落特征。缺点是吸收量较少，较麻烦，平板不于燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度天的话，长不出单菌落。 4.稀释倒平板法：稀释倒平板法是将细菌与液态的培养基混合后倒入培养皿再冷却凝固，使样品中 的微生物细胞充分分散开，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，单个细胞及聚在一起 的细胞可以生长繁殖，形成一个肉眼可见的菌落，统计菌落数目，即可用以评价样品中的微生物 的数量。所以细菌在培养基的内部和表面都有,适合厌氧型微生物。 5.菌种保藏：菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征 和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。保藏菌种一-般是选用它的休眠休，如孢 子;芽孢等等，并且要创造一一个低温;干燥; 缺氧;避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体 能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，
实验四 细菌的划线分离与培养
实验四细菌的划线分离与培养 一、实验前要说明的几点问题 点名,查看学生出勤情况。总结上次作业，提出作业中出现的问题并讲解。 二、板书部分 （一）目的要求 1.掌握需氧菌分离培养的基本要领。 2.了解厌氧菌的分离培养原则及方法。 （二）实验容 1.用普通琼脂平板做一次划线分离培养。 2.用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养。 3.用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄球菌的移植培养。 4.用划线法进行真菌的分离培养（示教） （三）作业 1.为什么要进行细菌的分离培养？ 2.进行分离培养应注意哪些事项？ 3.细菌分离培养的方法有哪些？（重点叙述平板划线法） 4.叙述真菌的划线分离方法。 三、实验容 主要容有分离培养及目的、注意事项、分离培养的方法、真菌的培养方法、患病动物病料中分离培养、钓菌、移植。 1.什么是分离培养及目的：分离培养是细菌学检验的基本技术之一。分离培养之目的，在于从被检材料中由多种细菌里分离出一种细菌。 2.注意事项： 1）分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。例如：链球菌在普通琼脂不长，要加血清或血液。大肠杆菌和葡萄球菌要求较低，普通的培养基即可生长。 2）防止污染。分离培养的整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必
须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。 3）防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料，应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。 4）初代分离时发现有多种细菌，观察找到目的菌落，再拿一肉汤培养基纯化培养。然后在接种实验动物，作成凝集抗原，做血清学鉴定，。还可以反过来做抹片染色观察。 3.分离培养的方法： 主要分需氧菌的分离培养方法、厌氧菌的分离培养方法和需要CO菌的培养分离方法。 1）需氧菌的分离培养法 （1）平板划线法：划线后有单个菌落，便于观察菌落的形态、溶血性等。方法左手拿琼脂平板，使其与水平面成45。角；右手拿铂金耳，使之与水平面平行，靠近酒精灯火焰操作。将接种环于酒精灯火焰中灼烧灭菌，待其冷却后，蘸取欲检材料少许，注意不要划破琼脂，不要划得太疏，以免造成浪费，不要重复划线，以免形成菌苔。划线方法：方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线，选择其中一种进行划线。划毕，将接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被检材料名称及日期，倒转置恒温箱中培养。 思考题：方格划线哪个地方会长出单个菌落比较多？ （2）倾注法：不常用，这里不做介绍 2）厌氧菌的分离培养方法 厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在。故在培养厌氧菌时，必须创造一个厌氧环境，一般以降低氧的力或保持减低的氧力为原则。目前应用于厌氧菌的分离方法颇多，现就其中较简便且常用的几种方法介绍如下： （1）焦性没食子酸法利用焦性没食子酸在碱性溶液能大量地吸收氧的原理进行厌氧培养。通常100cm3空间用焦性没食子酸1g，10%氢氧化钠或氢氧化钾10ml。具体方法有下列有平板培养法、干燥器培养法。平板培养法是将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约2cm的脱脂棉，置于平皿盖的面中央，其上滴加10%氢氧化钠溶液约5ml；在靠近脱脂棉的一侧放置焦性没食子酸约
细菌的分离与培养
细菌的分离与培养 实验目的： 掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。 实验材料： 菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。实验内容： 一、平板划线接种法（分离培养法） 原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。 用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。 课时安排：2课时 操作方法（三区划线法）： 1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。 2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。 3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。 4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。 5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。 二、液体培养基接种法 用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。 操作方法： 右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。 1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。 2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。 3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。 三、半固体穿刺接种法 用途：观察细菌动力，保存菌种。方法： 1、以无菌操作用接种针挑取单个菌落，立即垂直插入培养基中心至接近管底处循原路退回。 2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种针灭菌后放下。试管置37℃温箱孵育18-24小时，取出后对光观察穿刺线上细菌生长情况：细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等。 图5 液体（左）及半固体（右）培养基接种法 四、斜面培养基接种法 用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。
水处理生物学实验8 细菌纯种分离、培养和接种技术
南昌大学实验报告 学生姓名：学号：专业班级： 实验类型：√验证□综合□设计□创新实验日期：实验成绩： 实验八细菌纯种分离、培养和接种技术 一、实验目的： 1、学习从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分离、培养微生物，掌握一些常用的分离和纯化微生物的方法； 2、学会几种接种技术。 二、实验基本原理： 自然界中的微生物总是杂居在一起，即使一粒土或一滴水中也生存着多种微生物。要研究其中的某一种微生物，首先必须将它分离出来。 受污染的土壤或水体中，微生物的数量和污染物的降解之间存在着显著的关系.为了提高污染物降解速率,常需接种一些能降解目标污染物的高效菌。从经过富集、驯化培养的样品中筛选目标菌株，往往是获得高效降解菌的有效方法。 根据目标微生物特定的营养要求，设计相应的选择培养基。是快速高效获得目标菌的关键步骤。 土壤是微生物生活的大本营，有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化的到许多有价值的菌株，事实上，生产、工程上很多有益菌株都是从土壤中分离得到的。 从复杂的微生物群体中获得只含有一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。微生物纯种分类的方法有很多，常用的方法有两类一类是单细胞挑取法，采用这种方法能获得微生物的克隆纯种，但对仪器条件要求较高，一般实验室不能进行。另一类是单菌落分离（平板分离法），该方法简便是微生物学实验中常采用的的方法。通过形成单菌落获得纯种的方法有平板划线法、平板浇注（稀释混合平板法）、平板表面涂布法。 此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。其原理包括两方面：
细菌的分离培养技术
细菌的分离培养技术 一、常用培养基的制备 （一）肉膏汤培养基 (broth medium) 1、成分牛肉浸膏3～5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml 2、制法 (1)于1000ml蒸馏水中加入上述成份，混合加热溶解。 (2)调整pH为7.4～7.6，煮沸3～5min，用滤纸过滤。 (3)分装于适当容器内，高压灭菌103.43Kpa 20min ,置阴暗处或冰箱中贮存备用。 3、用途供一般细菌培养之用，亦可制备糖发酵管及琼脂培养基用。 （二）肉浸汤培养基(infusion medium) 1、成分 ⑴新鲜牛肉(去脂绞碎)500g 蛋白胨10g ⑵氯化钠5g 蒸馏水1000ml 2、制法 (1)取新鲜牛肉(兔肉)除去肌键、肌膜及脂肪，切成小块后用绞肉机绞碎或用刀剁碎，置于 糖瓷或铝制锅中，每500g碎肉加水1000ml混合后置冰箱中过夜。 (2)次日取出肉浸液，搅拌均匀，煮沸30min并常搅拌以免沉淀烧焦。如蛋白质已凝固， 即停止加温，补足失去水分。 (3)用纱布或绒布挤压过滤，使所有肉汁尽量挤出，再用脱脂棉滤入大三角烧瓶内。 (4)在滤液中加入蛋白胨(10g/L)、氯化钠(5g/L)，再加热使其全部溶解。 (5)调整pH至7.6～7.8，煮沸10min，以滤纸过滤。 (6)分装三角烧瓶，塞好棉塞，再用厚纸将瓶口扎好，高压灭菌103.43KPa 20min，冷却 后置阴暗或冰箱中保存备用。 3、用途 供作基础培养基用，营养较肉膏汤好。一般营养要求不高的细菌均能生长。 （三）普通琼脂培养基(agar medium) 1、成分
牛肉浸膏3～5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂20～25g 蒸馏水1000ml 2、制法 ⑴将上述成分置于三角烧瓶中，煮沸使其溶解(须防止外溢)，并补足由于蒸发失去的水分。 ⑵趁热调整pH至7.6，以绒布过滤，分装试管或烧瓶内，高压灭菌103.43KPa 15min。 ⑶琼脂斜面培养基制法：高压灭菌后，趁琼脂尚未凝固前，将其分装在已灭菌的试管内，斜放在台面上，待凝固后即成琼脂斜面培养基。 琼脂平板培养基制法：经高压灭菌后的培养基冷却至50～55℃时，打开瓶口棉塞，将琼脂倒入已灭菌的平皿内(直径9cm 的平皿约需培养基20ml)，待凝固后即成琼脂平板培养基。平板培养基制成后，通常都是倒置的，这种放置既便于取放，又有利于避免水分蒸发，以及保持无菌状态。普通琼指培养基亦可用市售的营养琼脂粉制备。取4.5g营养琼脂粉加蒸馏水100ml，高压蒸汽灭菌后倾注平皿即成。 3、用途供一般细菌培养用，并可作无糖培养基。 （四）半固体琼脂培养基(soft agar medium) 1、成分 ⑴牛肉浸液(或牛肉膏汤)100ml ⑵琼脂0.25～0.5g 2、制法 ⑴将琼脂加于肉浸液中，加热溶化。 ⑵以绒布过滤并分装试管，每管约1～1.5ml。 ⑶高压灭菌103.43KPa 20min后，直立放置，待凝固后即成高层培养基，保存备用。 3、用途保存一般菌种用，并可观察细菌的动力。 （五）血液琼脂培养基(blood agar medium) 1、配方一： ⑴成分： ①普通琼脂培养基100ml ②脱纤维羊血(兔血)8～10ml ⑵制法 ①将高压灭菌后的普通琼脂培养基(pH7.6)加热融化。