脊髓缺血再灌注损伤过程中的脊髓血流量与组织病理学变化

脊髓缺血再灌注损伤中的脊髓血流量与组织病理学变化的相关性

杨小玉朱庆三刘光耀段德生

吉林大学中日联谊医院骨科长春市仙台大街2号130031

【摘要】目的探讨脊髓缺血再灌流损伤过程中的脊髓血流量与组织病理学变化的关系。方法脊髓缺血再灌注损伤模型建立，通过阻断大鼠腹主动脉造成脊髓腰尾段缺血。按缺血和再灌流各时间段分别阻断开放腹主动脉。应用激光多谱勒血流仪，分别连续测定腰髓血流变化。取缺血前、缺血30分钟、缺血60分钟，缺血30分钟再灌2、4、6、9、12、24h局部脊髓组织进行组织病理和透射电镜检查。结果：在缺血30分钟时腰髓局部血灌流量迅速下降至基线值的-77.51%(P值=2.01E-17) 。再灌流时，局部血流迅速增高并超过基线水平。再灌流10分钟，局部血灌流量与基线的百分比变化值为60.38%(P值=3.3E-7)，随后逐渐降低，再灌流30分钟后，局部血灌流基本恢复基线水平(3.7% P值=0.437899)，以后血流量低于基线水平，出现缺血后延迟低灌流。直至再灌流4小时(-23.5%,P值=1.34E-3)，低灌流保持相对稳定，血流未见恢复。结论再灌注期组织损伤较缺血期严重，且病理学改变程度与再灌流有时间相关性，同时表明再灌流后脊髓发生了二次损伤，脊髓微循环障碍在脊髓缺血再灌注损伤中起重要作用,是脊髓再灌注损伤过程中的重要病理学基础。

【关键词】脊髓缺血再灌注损伤血流激光多普勒血流测定仪组织病理学

Correlation of Histopathology Changes and Spinal Cord Blood Flow in Spinal Cord Ischemical Reperfusion Injury .／Yang Xiaoyu ,ZHU Qing san ,LIU Gingchen, ,LI Yingpu，ZHAO Baollin ,YANG Xiaoyu ,LIN Ye,XING Hongjian orthopedics’department of China-Japanese friendship hospital,，Jilin university Changchun City.130031

【Abstract】Objective:To study the correlation of histopathology changes and spinal cord blood flow after spinal cord ischemical reperfusion injury . Method Model Set-up of ischemic spinal cord injury. Occlusion of the abdominal aorta produces lumbosacral spinal cord ischemia. Abdominal aorta was obstructed and opened according to events of ischemia - referfusion. Laser- Doppler flowmetry was employed to measure hemodynamic changes in the oumbal spinal cord. The lumbo-sacral cord tissue blook was rapidly dissected for the examination of histopathology and transmission electron microscopy according to preichemia, 30 min of ischemia, 60 min of ischemia,and 2, 4, 6, 9h and 12h of reperfusion respectively. Results: The lumbar local SCBF decreased rapidly to – 77.51%(p=2.01E-17), percentage changes of the mean baseline value after 30 min of ischemial. The onset of reperfusion, the SCBF increased rapidly and exceeded the baseline level.The SCBF was 60.38% (p=3.3E-7) of baseline at 10 min of reperfusion. And the local blood perfusion basically recovered baseline level after 30 min of perfusion(3.7% of baseline, p=0.437899). After wards, the SCBF decreased gradually. Up to 4h of reperfusion(-23.5% of baseline, p=1.34E-3) , the SCBF did not return to the baseline level. Conclusion

基金项目：吉林省科学自然基金项目资助（990563-1）

第一作者简介：女（1959－）教授医学博士后，研究方向：脊柱外科基础

电话（0431）－5649255E-mail:yangxiaoyu 88@https://www.360docs.net/doc/fe14981676.html,

Damage of spinal cord tissue in the hypoperfusion phase is serious than its ischemia phase , There are time correlation in the degree of pathology changes and hypoperfusion .At the same time , twice lesion of spinal cord has been occured by spinal cord hypoperfusion. Microcirculation disorder of spinal cord is important base of the pathology.

【Key】Spinal cord Ischemical reperfusion injury Blood flow Laser- doppler flowmetry Histopathology

脊髓损伤(spinal cord injury SCI)一直是困扰医学界的一大难题。临床研究中常见到SCI在解剖上并非完全横断,伤情并不严重,减压后症状有所缓解，但以后发展为“二次瘫痪”。临床上对于SCI 治疗常见于针对缺血恢复血供,而忽视了脊髓再灌注损伤。近二年许多研究表明[1-3]，SCI 后动物双后肢出现二次瘫痪与脊髓组织延迟性低灌流密切相关, 脊髓微循环障碍在脊髓二次损伤中起着重要作用, 因而提出了脊髓存在着缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia reperfusion injury I/R),然而,由脊髓再灌注引发的微循环障、病理生理、生化因子参与的脊髓组织进行性、自毁性破坏病理过程仍不十分清楚。因此，本文针对缺血再灌注损伤中脊髓血流量与组织病理学变化进行了动态观察，为临床阻遏脊髓继发性损害提供科学实验依据。

1.材料和方法

1.1脊髓缺血再灌注损伤模型建立：

实验动物分组:Wistar大鼠,体重180-260g,平均220g, 雌雄不限,随机分为正常组、单纯缺血组和缺血再灌组。正常组：(仅麻醉动物不进行阻断血流量)，单纯缺血组:阻断血流30、60min。单纯缺血再灌组：根据所需时间点设计缺血30min后再灌注60min、2、4、6、12、24h组,每组5只鼠，总计40只鼠。

1.2 手术方法:

用戊巴比妥纳35mg,kg-1ip麻醉后将鼠称重采用Zivin[4]法复制模型，鼠俯卧位置于特制台上, 背部剪毛，无菌操作下，腰椎取背部正中切口，切除L2-L 4双侧椎板,充分显露L3-L4节段硬脊膜。然后仰卧位于台上，腹部剪毛，取腹正中切口。手术分离腹主动脉至肾动脉水平，在左肾动脉起始部远端用Scoville-Lewis动脉夹夹闭腹主动脉，根据所需测定时间点进行阻断血流，暂时关闭腹腔至动物苏醒。然后再次麻醉动物，打开刀口后松夹恢复血流，重新关腹。制成脊髓缺血－再灌注损伤模型，可调式加热垫置于动物身下，室温保持22℃,通风良好。

1.3脊髓I/R损伤血流动力学监测

选用Peri Flux PF3激光多普勒血灌流监测仪(Laser Doppler Perfusion Monitor),由瑞典Perimed AB公司生产(Perimed AB,Stockholm, Sweden)。技术参数为：激光二极管光源，2mW氦－氖激光(He-Ne Laser),波长为632.8um。光行探头:PF303不锈钢探头( Stainless Steel Probe ,直径为1.0mm,纤维分离(Fibre Separation) 0.25mm。一台瑞典ALR公司(Advanced Logic Research, Inc)生产的386台式微机(Power Flex 20sx) 与激光多普勒Peri Flux PF3相连,通过专门的软件程序PERISOFT进行操作,显示并记录波形,计算并存储血流数据。将光纤探头PR303用微型支架固定于L1-2脊髓节段背侧硬脊膜表面上,触而不压,既适于动物呼吸又保持测定区域恒定。术野和探头覆盖1%琼脂液(溶于0.9%生理盐水)。被测区域为避开可视血管，距后中央沟1-2mm局部区域。血流仪增益(Gain)为1,最大上限频率( Upper Frequency Limit)12Kz,即宽频(Wide band)状态。开机预热30 分钟后，先测定腰髓局部基线血流,连续记录10-20分钟。然后按缺血和再灌流各时间段分别连续测定血流变化，显示血流变化的LDF输出信号被记录并存储在微机内的专门软件PERISOFT程序中,确定时间区段(Event),计算平均值。

1.4病理形态学观察

将实验组缺血前、缺血30、60min 、缺血30min再灌4、6、12、24h,分别在活体状态下取同一节段脊髓行病理学检查。

1.4.1石蜡切片光镜观察

实验组大鼠用小剪刀将脊椎管扩大,切除周围神经根, 将同一节段脊髓取出，用4%多聚甲醛固定24h 后常规石蜡切片,HE染色,光镜观察。

1.4.2尼氏染色:缓冲亚甲兰法

新鲜组织固定于10%甲醛液，按常规脱水、浸蜡、包埋，石蜡切片5μm，切片脱蜡至水,蒸馏水洗,入缓冲液亚甲兰染色内染10分钟,0.2N 醋酸盐缓冲液(PH4.6)分化1-3分钟,并在显微镜下观察,至尼氏体清晰为止。4%钼酸铵液处理3-5分钟,蒸馏水洗, 常规脱水透明,中性树胶封片,尼氏体染成鲜兰色。随机选取缺血前、缺血30分钟、再灌流4 小时各组脊髓前角有核细胞各30个,应用Luzes- F 型图像分析系统(Japan),在20倍物镜下测定尼氏体平均灰度和平均面积。

1.4.3电镜标本制备及观察

按40kg·kg-1用3%戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉后,剪开腹腔,暴露心脏,经左心室穿刺,先用37℃,0.9%生理盐水心脏灌洗,再用2.5%戊二醛进行灌洗固定。取腰髓在解剖显微镜下定位于脊髓前角,经1%锇酸后固定,逐级乙醇, 丙酮系列脱水,Epon812包埋,半薄切片定位,LKB 超薄切片机切片,片厚700A。经醋酸双氧铀-柠酸铅双重染色, 在日产JEM-1200EX透射电镜下观察并摄片。

1.5 数据处理

所有测定值以平均值±标准差(mean value ±standard deviation, X ±S) 表示。统计学意义通过Microsoft Exce15.0 for windows电子表格软件中的F 检验和t检验进

行评价,P 值<0.05为具有显著性差异。

2. 结果

2.1脊髓I/R 后脊髓血灌流量的动态变化

L1-L2脊髓血灌流量(spinal cord blood perfusion, SCBP)平均基线值是301.3±

46.89 PU(表1)。缺血初始 SCBP 迅速下降，单纯缺血10min 时，平均SCBP 下降至38.92±16.87PU,与基线的百分比变化为-74.37%,单纯缺血30min 平均下降至41.79±14.44 PU,与基线的百分比变化值为-75.37(P 值=2. 01,E-16)再灌流时,SCBP 迅速增高超过基线水平。再灌注10min,SCBP 值为426.26±72.11PU,(P 值=3.4E-08) 与基线的百分比变化值为35.21%,以后 SCBP 逐渐降低。再灌30min ，接近基线水平(327.42±70.26pu,P 值=0.434,17.16%)以后持续低于基线水平,再灌注60min(243.18±30.27, -19.10%,P 值=0.244)再灌注4小时,降至180.32±30.75PU, -40.08%P 值=0.1515)以后未见恢复。(见表1和图1)

图1、鼠脊髓缺血再灌注后腰髓血流变化

表1 鼠脊髓缺血灌注后腰髓血流值

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TIME SCBP(PU) △% percentage of thebaseline

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baseline 301.3±46.89(30)

I 10min 38.92±16.87(5) -74.37%

I 30min 41.79±14.44(5) -75.37%

P 10min 426.26±92.11(4)** 36.21%

P 30min 327.42±70.26(4)△ 17.16%

P 50min 255.38±64 (4)* -18.39%

P 60min 243.18±30.27(4)** -19.10%

P 90min 246.05±53.31(4)* -21.37%

P 120min 240.94±52.12(4)* -23.01%

P 150min 224.16±50.97(3)* -28.37%

P 180min 206.41±45.56(3)* -34.04%

P 210min 196.09±91.79(3) -37.34%

P 240min 180.32±30.75(3)** -40.08%

P 360min 176.88±61.56(3)** -43.48%

P 540min 150.11±32.42(3)** -52.03%

50

40

30

40 0 10 20 30 60 90 120 240

P 600min 130.11±32.43(3)** -58.42%

P 720min 130.89±41.34(3)** -58.17%

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注:PU:血灌流单位,Baseline:缺血前的基线值:I:缺血; P,再灌流,括号内数为动物数(以下同)。与基线值比较:*P值<0.05,** P值<0.01; △P值>0.05.

2.2病理结果

2.2.1光镜检查

①HE染色缺血前组:前角运动神经元无明显变化, 缺血30min再灌注6小时,可见部分神经元胞体放大,胞浆胞核着色变浅。②尼氏染色缺血前组:前角运动神经元轮廓清楚,多极形, 细胞核大多位于中央,核仁清晰可见。尼氏体呈网班状均匀排列于核周，胞浆均匀，深染。③缺血30分钟组:前角运动神经元肿胀,圆形,胞核偏位, 核仁尚清楚。尼氏体呈细尘状颗粒，浅染，松散，排列紊乱/或位于细胞周边部。④再灌流4小时组:前角运动神经元固缩,变小,呈三角形。胞核结构大多萎缩消失。尼氏体溶解，消失，胞浆呈空状改变。⑤再灌注6、12、24h小时, 随着缺血再灌时间延长,病变有逐渐加重趋势。

应用Luzed-F型图像分析系统,在20倍物镜下随机测定30个前角细胞的尼氏体平均灰度和平均面积,结果见表2。

表2、脊髓缺血再灌注损伤尼氏染色图象分析结果（x±s）

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ＮＩR

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mean gray 132.37±10.91 149.47±11.03* 188.51±12.34*

mean area 850.04±111.49 922.11±97.34 588.04±95.57*(mm2)

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* P<0.01 Ｎ=Normal Ｉ=Ischemia Ｒ=Reperfusion

缺血30分钟组，平均灰度明显高于缺血前组(P值= 5.88E-04),再灌流4小时组,平均灰度进一步升高，与缺血前比较P值=1.095E-16。注：灰度表示图像各部分颜色的深浅程度，切片底色越浅，灰度值越高。缺血30分钟组，平均面积与缺血前组没有明显差异(P值=0.844058)。但再灌流4小时组,平均面积较血前组明显减小(P值=2.49E-10)。

2.2.2电镜观察

①缺血30分钟组：可见神经元细胞基本正常，内质网排列分布杂散，局部有脱颗粒现象，游离核糖体增多，并可见突触结构，突触内可见突触小泡较多，有线粒体，神经胶质细胞核基质局部变化，核异染色质趋边，粗面内质网轻度肿胀，线粒体轻度凝聚，有髓神经纤维和髓鞘未见明显改变。脊髓灰质内毛细血管未见明显改变。

②缺血60分钟组：神经元实质内基质高度空化，线粒体凝聚，可见板层小体，粗面内质网排列成堆扩张，游离核糖体增多，神经胶质细胞核膜局部不清晰。

③再灌流4小时组：核膜不清,线粒体高度肿胀，空泡化。内质网互相离散，明显扩张，游离核糖明显减少。髓鞘板层轻度松解。

④再灌流6、12小时组：轴突基质空化，线粒体增多，基质集凝，神经元细胞核膜不清晰，核基质淡薄，胞质内游离核糖体增多，局部密集分布，可见空泡结构脂褐素。有髓神经纤维显示不规则形，毛细血管核内皮异染色质凝聚趋边，局部增厚，向腔内形成许多绒毛状突起，基质质密。

⑤再灌流24小时组：神经轴突内线粒体凝聚, 有线粒体嵴断裂，肿胀呈空泡状，有髓神经纤维严重分离，局部凝聚。

3.0 讨论

脊髓损伤(SCI)后，发生一系列缺血等病理生理改变，使脊髓的损伤进一步加重。由于脊髓血流(Spinal cord blood flow ,SCBF)变化能较好地反应脊髓组织的病理改变。因此，有关SCBF 的研究越来越受到重视。目前定量测定(SCBF)的方法很多，如常用的氢气清除法、放射性自显影法、微球法等[5]。但由于电极直接插入脊髓内，必然要引起脊髓损伤，改变脊髓循环的生理条件。同时如氢气清除法还要根据H2的浓度曲线来进行复杂计算脊髓血流量，必然要影响到结果的准确性。因此，本实验选用激光多普勒血流测定法(Laser Doppler Flowmetry,LDF)成功的建立了一个持续性监测脊髓I/R 损伤微循环血流的实验模型。它能够连续性、及时性、非侵袭性通过直接测定血流来反映真正的脊髓血流状态。本实验通过阻断鼠腹主动脉，持续监测L1-2节段脊髓血流。发现缺血30分钟，血灌流量平均下降85.37%，再灌流即刻血灌流量迅速升高，超过缺血前水平。再灌流10分钟左右达到最高点，血灌流量上升36.21%。再灌流30分钟，血灌流量基本恢复缺血前基线水平,以后逐渐降低,再灌流60分钟左右一直保持低于基线水平，直至再灌流4小时(血灌流量下降67.62%)未见恢复。证实了缺血30分钟、再灌流4小时脊髓发生了进行性延迟性低灌流(Delayed hypoperfusion)。与正常对照、缺血30分钟、再灌流4 , 6 , 9 , 12h局部脊髓光镜病理和电镜超微结构检查，证实了缺血30分钟就已有明确的病理改变，说明了缺血缺氧本身对脊髓的损伤;而再灌流4小时以后,在恢复血供的条件下，病理改变更加严重,揭示了脊髓存在着再灌流损伤(reperfusion injury)。本实验观察到局部SCBF改变与病理学检查结果具有极好的时间相关性。缺血时，血流下降明显，出现病理性损伤；再灌流时，出现延迟性缺血性低灌流，微循环功能不良，病理改变更加明显，表现出了再灌流损伤，同时我们还观察到缺血再灌后脊髓前角细胞超微结构改变要比单纯缺血性损害严重。如单纯缺血30分组与缺血30分再灌组有明显病理学差异。随着再灌流时间延长，脊髓前角细胞出现高度肿胀，核膜结构不清，胞质内空泡，线粒体增多凝聚，髓鞘神经纤维溶解、严重分离等缺血、缺氧改变。毛细血管内皮增厚基质致密空泡，有微绒毛毛状向血管腔内突入等内皮损伤改变，均证实再灌流使脊髓发生了二次损伤，并也证明这种脊髓二次损伤有某种损伤因子的共同参予并加重了再灌注损伤的病理过程，故导致了SCI后的继发性损害。

对于再灌流后出现的延迟性低灌流的原因，目前仍不十分清楚，有几种解释。有的作者认为是由于组织水肿压迫血管致SCBF降低[5]。根据张屹[6]等脊髓I/R损伤动物模型脊髓组织水份含量的测定结果，再灌流24小时水肿较前有所减轻，认为组织水肿不是造成SCBF下降的主要原因。Kogure[7]等指出中枢神经缺血后代谢紊乱是通过血流降低和/或再灌流不平衡而加重，这可能与受损组织的代谢需求相关系。Senter[]等实验表明损伤区局部的缺血缺氧很难通过脊髓本身的血液循环得到改善，即脊髓I/R损伤很难通过恢复血供而改善所存在的继发性损害，本实验结果证实了这一点。

脊髓微血管内皮细胞在I/R损伤中扮演着最重要的角色，与星形胶质细胞紧密连接构成血脊髓屏障的基本结构，脊髓I/R 过程中血管内皮细胞是最先波及的部位，而该部位的变化对组织损伤及功能恢复影响巨大。因而血管内皮细胞在缺血再灌注损伤中

日益受到重视，在正常情况下，内皮可分泌多种物质来调节血管张力，维持血液流动性，并调节血管内血栓形成。因此，我们认为缺血再灌流可引起大血管及微血管内皮细胞的损伤，使内皮细胞的形态和功能异常。它主要表现为微血管阻力增加，血管扩张的储备能力的减弱，毛细血管堵塞--通常为“无复流”现象。所以本实验总结为缺血、低灌流是严重脊髓损伤后主要的血流变化。而延迟性低灌流现象主要与血脊髓屏障损害、脊髓实质性微循环障碍、血管自由基化学过程改变相关。本研究同时给人另一启示：临床上对脊髓缺血损伤治疗上常常是针对缺血、恢复血供，往往忽视了再灌注所存在的继发性损伤，如何克服微循环障碍，阻断及抑制SCI缺血后继发性功能障碍，促进脊髓功能恢复是今后脊髓损害的治疗方向。

本实验观察结论，再灌注期组织损伤较缺血期严重，且病理改变程度与再灌流有时间相关性，同时表明再灌流后脊髓发生了二次损伤，脊髓微循环障碍在脊髓I/R损伤中起重要作用,是脊髓I/R过程中的重要病理基础。

参考文献

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2.Cassada, C. G. Tribble, S. M. Long, A. K. Kaza, J A. Kern Adenosine A2A agonist reduces paralysis after spinal cord ischemia: correlation with A2A receptor expression on motor neurons.[J] Ann. Thorac. Surg., September 1, 2002; 74(3): 846 - 850.

3.Lo?c Lang-Lazdunski a,Ischemic spinal cord injury induced by aortic cross-clamping: prevention by riluzole Eur J Cardiothorac Surg2000;18:174-181.

4.Murat Celik*, Necati G?kmen*,Erythropoietin prevents motor neuron apoptosis and neurologic disability in experimental spinal cord ischemic injury. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V ol. 99, Issue 4, 2258-2263, February 19, 2002.

5.何鸣谦.测定局部血流量的氢气清除法, 中华物理医学杂志, 1989, 11 :17

6.

6.张屹,等.脊髓缺血性损伤模型的制作。中华神经外科杂志，1991,7:84.

7..Kogure K, Busto R, Schwarzman RJ, et al. The dissesetion of cerebral blood flow, metabolism, and function in the early stages of developing cerebralinfarction. Amm Neurol, 1980,8:278.