紫斑牡丹内生真菌分离培养分子鉴定及抑菌活性研究
World Journal of Forestry 林业世界, 2018, 7(3), 83-89
Published Online July 2018 in Hans. https://www.360docs.net/doc/8980464.html,/journal/wjf
https://https://www.360docs.net/doc/8980464.html,/10.12677/wjf.2018.73011
Study on Identification and Antimicrobial
Activity of Endophytic Fungi Separation
from Paeonia rockii
Huimin Tian, Xiaojian Qi, Yuan Yin, Yuan Gao, Manyi Zeng
Life Science of Chifeng University, Chifeng Inner Mongolia
Received: Jun. 29th, 2018; accepted: Jul. 13th, 2018; published: Jul. 20th, 2018
Abstract
In this study, the endophytic fungi of root, stem, leaves from Paeonia rockii were isolated and cul-
tured. According to the morphological and cultural characteristics and other biological characte-ristics, the isolates were identified by rDNA-ITS sequence analysis. The antibacterial test was per-
formed on the isolates and Fusarium oxysporum by the plate-to-lime method to screen endophytic
fungi with antibacterial activity. The results showed that 20 endophytic fungi were obtained from Paeonia rockii and 11 species were identified by rDNA-ITS sequence analysis. J2 was Paraphoma chrysanthemicola(Hollós) Gruyter (epigamous),Boeremia sp. (phorozoon); J6H was Aspergillus calidoustus Varga, and J7HEI was Colletotrichum coccodes (Wallr. S. Hughes); J8 is Gibberella intri-cans Wollenw (epigamous), Fusarium sp. (phorozoon); G9 is Phoma multirostrata (PN Mathur, SK Menon & Thirum.) Dorenb. & Boerema (phorozoon) Boeremia sp. (epigamous); G1 and G6 are Py-renochaeta lycopersici RW Schneid. & Gerlach, J1 is Nodulosphaeria cirsii (P. Karst.) L. Holm, G5 is Gibberella sp. (epigamous), and J6HUI2 is Didymella glomerata (Corda) Qian Chen & L. Cai; J7HUI is Peyronellaea sp. J1 and J6HUI are new to China, of which G5, G9, J1 and J2 can inhibit Fusarium oxysporum in different degrees, the average inhibition rates being 57%, 57.2%, 28.8% and 54.8%, respectively.
Keywords
Paeonia rockii, Endophytic Fungi, Molecular Identification, Antimicrobial Activity
紫斑牡丹内生真菌分离培养分子鉴定及抑菌活性研究
田慧敏，齐小剑，尹元，高原，曾满意
赤峰学院生命科学学院，内蒙古赤峰
田慧敏 等
收稿日期：2018年6月29日；录用日期：2018年7月13日；发布日期：2018年7月20日
摘 要
本研究对紫斑牡丹的根、茎、叶内生真菌进行分离培养，根据形态学特征、培养特性及rDNA-ITS 序列分析相结合的方法对分离到的菌种进行鉴定，并对其与黄瓜枯萎病原菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum 同时接种进行抑菌试验，以筛选抑制尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum 的内生菌菌株。结果表明，从紫斑牡丹中获得20株内生真菌，经形态和分子共鉴定出11种，J2为菊拟茎点霉菌Paraphoma chrysanthe-micola (Hollós) Gruyter ，J6HUI 为Aspergillus calidoustus Varga ，J7HEI 为马铃薯刺盘孢Colletotrichum coccodes (Wallr.) S. Hughes ，J8为木贼镰刀菌Fusarium equiseti (Corda) Sacc ；G9无性型为多喙茎点霉Phoma multirostrata (P.N. Mathur, S.K. Menon & Thirum.) Dorenb. & Boerema ，有性型为Boeremia sp.；G1、G6为番茄棘壳孢Pyrenochaeta lycopersici R.W. Schneid. & Gerlach ，J1为Nodulosphaeria cirsii (P. Karst.) L. Holm ，G5为Fusarium sp.，J6HUI2为Didymella glomerata (Corda) Qian Chen & L. Cai ；J7HUI 为Peyronellaea sp. (派伦霉属)，J1和J6HUI 为中国新记录种，其中4株具有抑菌作用，G5、G9、J1和J2对黄瓜枯萎病具有不同程度的抑制作用，平均抑菌率分别为57%、57.2%、28.8%和54.8%。
关键词
紫斑牡丹，内生菌，分子鉴定，抑菌实验
Copyright ? 2018 by authors and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.360docs.net/doc/8980464.html,/licenses/by/4.0/
1. 引言
植物内生真菌是指在健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙中度过全部或近乎全部生活周期而不使寄主表现任何症状的一类真菌[1]，主要为子囊菌及其无性型，少数担子菌和接合菌。内生真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间，从寄主中吸收营养物质，如光合产物和矿物质供其生长所需，同时内生真菌为寄主生长发育提供水分、矿质元素等，二者互利互惠[2]。植物内生真菌普遍存在于植物组织中，其代谢物不仅能刺激植物生长发育、增强寄主的抗逆性，如抗旱、抗寒等能力[3]，而且能提高植物对病虫害的抵抗力[4]-[9]，研究发现植物内生真菌能产生具有多种生物活性的新型化合物，如抗菌素、植物生长调节剂、免疫抑制活性物质、抗肿瘤活性物质等，极有可能成为发现和生产生物活性物质的重要来源，在医药、农林业等领域具有潜在的应用前景。
紫斑牡丹(Paeonia rocki )是芍药科芍药属植物，因其花大色艳，植株高大，香味浓郁，在世界上享有崇高声誉，是中国特有植物，极富观赏价值。许多研究者对牡丹内生真菌做了研究，发现从牡丹分离到的多种内生真菌具有抑菌活性[10] [11] [12] [13] [14]，然而国内关于紫斑牡丹内生真菌的报道极少，且尚未见抗逆性菌株筛选相关研究，本研究采用组织分离法对紫斑牡丹的根、茎、叶内生真菌进行分离培养并做抑菌实验，以期寻找具有抑菌作用的菌株。
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田慧敏等
2. 材料和方法
2.1. 供试材料来源
供试标本实验材料为采集于农场、学校等地的牡丹植株，新鲜健康植株的各部分组织，如根、茎、叶，当天进行处理分离培养。
2.2. 内生真菌的分离和纯化
选取健康的牡丹植株，截取根、茎、叶3个部位，用自来水冲洗干净，晾干表面的水分，0.1%升汞漂洗1 min，然后用冰醋酸冲洗，再用75%酒精，漂洗0.5~1 min，无菌水反复清洗。样品经过处理后，在无菌状态下切成0.2 cm × 0.2 cm片，置于PDA培养基上培养，每个皿放置4个样品。在28℃的条件下培养3~7 d，观察记录皿中材料，取切口处培育出的菌落，挑取切口处，挑菌落边缘的菌丝转接到新的PDA培养基，进行2~3次的纯化筛选到内生真菌，每次将最后一次冲洗完的无菌水涂布在PDA培养基上作为对照组。
2.3. 内生真菌的分子鉴定
2.3.1. 内生真菌基因组提取及PCR扩增及测序鉴定
基因组DNA快速提取法提取培养菌种基因组DNA，用天根PFU PCR mix进行PCR扩增，用引物ITS1F/ITS4R (TCCgTAggTgAACCTgCgg/TCCTCCgCTTATTgATATgC)对G1、J2、J6HUI、J6HUI 2、J7、J7HUI、J8扩增ITS区域；用引物27F/1492R (L) (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG/GGTTACCTTGTTACGA CTT)对J1、G5、G6和G9扩增16S rDNA区，对所得PCR产物进行切胶纯化回收(DNA凝胶纯化试剂盒，AXYGEN)，使用NL4对回收DNA片段进行DNA测序(3730 xl, ABI)。
2.3.2. DNA序列比对分析
将得到的DNA序列在GenBank数据库和UNITE进行Blast检索比对，从结果中挑选出同源性较高的DNA序列，查找相似性最高的菌种，确定分离菌株的分类地位。利用软件MEGA6.01按照最大似然法构建系统进化树，发育树的每个分支的统计学显著性分析重复次数为1000次。
2.4. 对黄瓜枯萎病菌的抑制实验
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum, FO)在无菌操作台上将黄瓜枯萎菌接种于PDA培养基(d = 10 cm)中心，周围接种相应的内生菌四个接种点，置于20℃~25℃，培养48 h后测量抑菌圈直径，抑菌率= D CK?
D X/D CK × 100，D CK = CK菌落直径，D X = 对峙培养后尖孢镰刀菌的菌落直径。
3. 结果与分析
3.1. 紫斑牡丹内生真菌分离鉴定结果
从紫斑牡丹根、茎中共分离出内生真菌20株，经分子鉴定共鉴定出11种。从表1可以看出，从紫斑牡丹中共分离出11株内生菌分属8个属，从根部分离出的内生菌经鉴定，分属三个属，分别属于镰孢菌属(Fusarium)、棘壳孢属(Pyrenochaeta)和(Boeremia)。从茎部分离出的内生真菌经鉴定，分属7个属，分别属于(Nodulosphaeria)、派伦霉属(Peyronellaea sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、拟茎点霉属(Paraphoma sp.)、镰孢属(Fusarium sp.)和Didymella。G6与G1同属，都为Pyrenochaeta lycopersici (番茄棘壳孢)。其中G9生活史中出现了无性型和有性型，G9无性型为多喙茎点霉多喙茎点霉Phoma multirostrata (P.N. Mathur, S.K. Menon & Thirum.) Dorenb. & Boerema，有性型为Boeremia sp.。J1 (Nodulosphaeria cirsii (P. Karst.) L. Holm)和J6HUI (Aspergillus calidoustus)为中国新记录种。图1、图2为11种菌在PDA培养基上的培养特性。
田慧敏 等
Table 1. Molecular identification and group composition of endophytic fungi from Paeonia rockii 表1. 紫斑牡丹内生真菌分子鉴定结果及类群组成
编号 No. 基因登录号 GenBank accession
相似菌株 Similar species
一致性 Similarity/%
G1 — 番茄棘壳孢Pyrenochaeta lycopersici
99% G5 — 镰孢菌属Fusarium sp. 99% G6 MH212160 番茄棘壳孢Pyrenochaeta lycopersici 99% G9 MH212161
Boeremia sp/多喙茎点霉Phoma multirostrata
99% J1 — Nodulosphaeria cirsii
99% J2 MH212158 菊拟茎点霉Paraphoma chrysanthemicola
99% J6H MH212156 Aspergillus calidoustus 99% J6H2 MH212159 Didymella glomerata 99% J7H MH212155 派伦霉属Peyronellaea sp. 99% J7HEI MH212154 马铃薯刺盘孢Colletotrichum coccodes 99% J8
MH212157
木贼镰刀菌Fusarium equiseti (Corda) Sacc.
99%
A-B. J1：Ophiobolus cirsii ；C. Paraphoma chrysanthemicola ；D. 派伦霉属Peyronellaea sp.；E. Aspergillus calidoustus ；F. 派伦霉属Peyronellaea sp.
Figure 1. Culture character of endophytic fungi from Paeonia rockii on PDA medium I 图1. 紫斑牡丹内生菌PDA 培养特性I
A . Colletotrichum coccodes ; B. Fusarium sp.; C. Pyrenochaeta lycopersici ; D-E. Gibberella tricincta /Fusarium sp.; F. Boeremia sp.
Figure 2. Culture character of endophytic fungi from Paeonia rockii on PDA medium II 图2. 紫斑牡丹内生菌PDA 培养基菌落
II
田慧敏等
Figure 3. Phylogenetic tree of ITS for 11 samples and the similar species from Genbank
图3. 供试样品及来自Genbank的最相似物种的ITS序列构建的系统发育树
田慧敏等
3.2. 系统发育树分析结果
根据分子鉴定结果，选取35个近缘种的菌株与分离所得内生真菌菌株构建系统发育树。从图3可见，进化树分成三大支，J7HEI与Colletotrichum coccodes聚在一起，属黑盘孢目Melanconiales；其余聚为一大支；其中J2为Paraphoma chrysanthemicola，J7H为Peyronellaea sp.，G9为Boeremia sp.，J1为Nodulosphaeria cirsii都为球壳目Sphaeropsidole；J6H为Aspergillus calidoustus，J6H(2)为Didymella glomerata，G5为Fusarium sp.，J8为Fusarium equiseti，G1和G6为Pyrenochaeta lycopersici，聚为一大支，都为丝孢目Hyphomycetales。
3.3. 抑菌试验结果
对所有菌株与黄瓜枯萎病进行抑菌实验，结果表明，J2、G9、G5和J1对所测试的黄瓜枯萎病均具有不同程度的抑制作用。
从表2中可以看出菌株J2平均抑菌率达57.2%，菌株G9平均抑菌率达57.0%，G5平均抑菌率54.8%，J1抑菌率最小，平均抑菌率达35.3%。
J1最大抑菌圈直径为33.5 mm，能明显抑制黄瓜枯萎病菌的生长，平均抑菌率28.8%，黄瓜枯萎病菌与J1接触之前，初期菌落直径为10.5 mm，5天后菌落直径为26.3 mm (见图4(A)、图4(B))，与J1菌圈接触后，黄瓜枯萎病菌菌落直径最大为26 mm且不再生长，J1菌落3天后菌落直径为25.8 mm，抑菌率为14.2%，8天后抑菌率达60%，最后10天后将黄瓜枯萎病菌覆盖。
G5、J2和G9最大抑菌圈分别为44 mm、46.7 mm、48.7 mm，抑制作用极强，接菌2天后抑菌率达
42.7%、37.6%和33.9%，5天后菌落直径30 mm以上，黄瓜枯萎病菌被抑制，生长缓慢基本停止(见图
4(C)~(E))，8天后抑菌率70%以上，黄瓜枯萎病菌被覆盖。
Table 2. Antimicrobial activity of 4 endophytic fungi to Fusarium oxysporum
表2. 紫斑牡丹4株内生真菌对尖孢镰刀菌的抑制实验结果
菌株/抑菌率2天后5天后8天后平均抑菌率%
(茎1) J1 11.5 ± 1.53b 14.3 ± 2.18b 60.6 ± 2.17ab 28.8b
(茎1) J2 37.6 ± 1.27a 55.4 ± 1.47a 78.5 ± 2.23a 57.2a
(根5) G5 42.7 ± 1.22a 52.1 ± 1.44a 78.3 ± 2.10a 54.8a
(根9) G9 33.9 ± 0.84ab 53.7 ± 1.42a 74.7 ± 2.12a 57.0a
A.黄瓜枯萎病菌；
B. J1抑菌效果；
C. J2抑菌效果；
D. G5抑菌效果；
E. G9抑菌效果
Figure 4. Antimicrobial ring of 4 endophytic fungi to Fusarium oxysporum
图4. 接菌5天后4株内生真菌对尖孢镰刀菌的抑制圈
田慧敏等4. 讨论
植物内生菌作为植物微生物系统中重要的组成部分，对增强寄主植物对环境适应能力具有重要意义。利用植物内生菌防治作物病害是一个潜力巨大的新型领域。本研究从紫斑牡丹中共分离出11株内生菌。马铃薯刺盘孢Colletotrichum coccodes、贼镰刀菌Fusarium equiseti和Didymella glomerata可能为牡丹病原菌[15]，其他均为牡丹内生菌，J1和J6HUI为中国新记录种，其中4株具有抑菌作用。
尖孢镰刀菌可引起F. oxysporum，是一种世界性分布的土传病原真菌，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病，而本研究分离出的菌株G9、J2和G5对该病原菌具有很强的抑菌作用，为开发蔬菜、花卉枯萎病生防菌提供理论依据，本研究对内生真菌仅做了分子鉴定及简单的抑菌实验，而内生菌发酵产物的功能还需进一步研究，为菌物资源的鉴定及安全开发提供依据。
基金项目
赤峰学院创新项目(1601008)；内蒙古高等学校科学研究项目(编号：NJZZ16248)资助。
参考文献
[1]郭良栋. 内生真菌研究进展[J]. 菌物系统, 2001, 20(1): 148-152.
[2]官珊, 钟国华, 孙之潭, 等. 植物内生真菌的研究进展[J]. 仲恺农业技术学院学报, 2005, 18(1): 61-66.
[3]李飞, 李春杰. 内生真菌对禾草类植物抗旱性的影响[J]. 草业科学, 2006, 23(3): 57-62.
[4]Funk, C.R., Halisky, P.M., Johnson, M.C., et al. (1983) Anendophytic Fungus and Resistance to od Webworms: Asso-
ciation in Lolium perenne L. Bio/technology, 1, 189-191.
[5]郭绍霞, 张玉刚, 李敏, 等. 我国洛阳与菏泽牡丹主栽园区AM真菌多样性研究[J]. 生物多样性, 2007, 15(4):
425-431.
[6]White, J.F. and Cole, G.T. (1985) Endophyte Host Associations in Forage Grass III. In Vitro Inhibition of Fungi by
Acremonium coenophialum. Mycologia, 77, 487-489.https://https://www.360docs.net/doc/8980464.html,/10.2307/3793206
[7]兰琪, 姜广华, 吴文君. 农用植物内生真菌研究进展[J]. 世界农药, 2002, 24(3): 10-11.
[8]李桂玲, 王建锋, 黄耀坚, 等. 几种药用植物内生真菌抗真菌活性的初步研究[J]. 微生物学通报, 2001, 28(6):
64-68.
[9]杨润亚, 冯培勇, 李清. 植物内生真菌农药活性的研究进展[J]. 农药, 2006, 45(7): 440-444.
[10]苗翠苹, 余莹, 陈有为, 等. 滇牡丹内生真菌的分离及其抑菌活性研究[J]. 中国药学杂志, 2011, 23(10): 738-741.
[11]郑艳, 戴婧婧, 管玉鑫, 等. 凤丹内生真菌的分离及其抑菌活性研究[J]. 中国药学杂志, 2016, 41(1): 45-50.
[12]Huang, R., Jiang, B.G. and Li, X.N. (2018) Polyoxygenated Cyclohexenoids with Promising α-Glycosidase Inhibitory
Activity Produced by Phomopsis sp. YE3250, an Endophytic Fungus Derived from Paeonia delavayi. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 66, 1140-1146.https://https://www.360docs.net/doc/8980464.html,/10.1021/acs.jafc.7b04998
[13]张岚. 牡丹内生真菌多样性[D]: [硕士学位论文]. 洛阳: 河南科技大学, 2015: 1-62.
[14]王皎. 滇牡丹内生真菌PR-35的鉴定及次生代谢产物研究[J]. 天然产物开发与研究, 2011, 37(11): 1339-1342.
[15]赵丹. 牡丹根部茎部真菌病害及病原鉴定[D]: [硕士学位论文]. 洛阳: 河南科技大学, 2012: 1-78.
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川芎内生真菌的分离与鉴定
川芎内生真菌的分离与鉴定 汪杨丽，严铸云，郭晓恒，宋杰，陈新，万德光 成都中医药大学药学院中药材标准化实验室，四川成都 (610075） E-mail：wangyangli27@https://www.360docs.net/doc/8980464.html, 摘要：目的：探讨川芎内生真菌类群与川芎品种和产地的关系。方法：采用平板分离法分离川芎的内生真菌，采用点植法对分离菌株进行分类鉴定。结果：从6个产地的川芎根茎样品共获得内生真菌50株，经形态观察分类鉴定为1纲、3目、4科、13属。结论：不同产地及不同品种川芎的内生真菌在数量、分布、种群及其组成存在差异，推测川芎的道地性可能和川芎内生真菌种群有关。 关键词：川芎，内生真菌，分离鉴定 川芎为伞形科（Umbelliferae）藁本属植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛的功效，是著名的川产道地药材。四川都江、彭州为川芎的主要产区。此外，云南丽江、甘肃庄浪和华亭、江西等地也产，分别称“云芎”、“西芎”、“抚芎”[1～3]。有关不同产地及不同品种川芎的化学成分品质、药理、药效的研究报道较多[4]，但至今未见从川芎根茎分离内生真菌及其内生真菌种群多样性的研究报道。根据内生真菌和植物互惠共生的关系[5，6]，本文对不同产地及不同品种的川芎进行内生真菌的分离，探讨川芎在特定生境中的微生物群落结构的特征。 1. 材料与方法 1.1材料 1.1.1植物来源（见表1） 1.1.2 培养基 PDA培养基[7]（马铃薯葡糖糖培养基）＋青链霉素混合液[8]（用于分离）；PDA 培养基；促孢培养基（KH2PO41g、KNO31g、MgSO4.7H2O 0.5g、KCl 0.5g、淀粉0.2g、葡萄糖 0.2g、蔗糖 0.2g、琼脂15～20g、蒸馏水 1000ml、PH自然)。 表1 各种川芎的样品情况 药材名原植物部位采集地采集时间 川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 根茎四川彭州敖平2006.5.20 川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川都江堰石羊2006.5.22 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川彭州小鱼2006.7.24 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川汶川水磨2006.8.10 西芎L. sinense Oliv. 根茎甘肃平凉市华亭马峡2006.9.14 云芎L. chuanxiong Hort. cv. Jinxiong根茎云南丽江泸沽湖2006.8.17注：以上品种经成都中医药大学严铸云副教授鉴定 1.2方法 1.2.1. 内生真菌的分离先去掉新鲜川芎的须根，用自来水将川芎根茎表面洗净，用5%的NaClO溶液浸泡5min，用自来水反复的漂洗，稍干后切成适宜大小的小块，在无菌的条件下，用75％酒精中浸泡5 min，用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干，然后用无菌刀片将表皮削去，分别切成5 mm×5 mm×1 mm的小块种植于PDA培养基内，每个培养皿中放7小块，每个样品6个培养皿，置28℃恒温箱中培养3～15d，观察到培养基上从各植物组织块内部向周围
几种真菌的分离与鉴定教学文案
常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。
真菌的分离培养及形态观察
真菌的分离培养及形态观察 真菌分离培养应考虑所分离真菌的特性，配制合适的培养基，选择所需的气体环境。同时, 由于真菌分离材料常污染有大量细菌，所以可在培养基中加入抗菌素并在分离培养过程中严格执行无菌操作。 目的要求 1．掌握真菌分离培养方法。 2．认识真菌菌落的特征，比较与细菌菌落有何不同。 3．了解真菌载片培养法。 4．掌握观察真菌的基本方法，并观察其形态特征。 操作步骤 —、真菌的分离培养方法 （－）平板划线分离法 1．取适合真菌的琼脂培养基融化，冷至45℃，注入无菌平皿中，每皿15～20ml，制成平板待用。 2．取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。 3．将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线(同细菌的划线法)。 4．划线完毕，置温箱中培养2～5d，待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查，若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。另外，也可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯培养。 （二）稀释分离法 1．取盛有无菌水的试管5支（每管9ml），分别标记1、2、3、4、5号。取样品（如田土等）1g，投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。 2．用1ml灭菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1ml悬浮液注入2号管中，并摇匀；同样由2号管取1ml至3号管，依此类推，直至5号管。注意每稀释一管应更换一支灭菌吸管。 3．用2支无菌吸管分别由4号、5号试管中各取1ml悬液，并分别注入2个灭菌培养皿中，再加入融化后冷至45℃的琼脂培养基约15ml，轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成平板。然后倒置温箱中培养，2～5d后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。 二．真菌培养性状观察 （一）真菌在固体培养基上的生长表现 1 .酵母菌菌落：酵母菌在固体培养基上多呈油脂状或蜡脂状，表面光滑、湿润、黏稠，有的表面呈粉粒状、粗糙或皱褶。菌落边缘有整齐、缺损或带丝状。菌落颜色有乳白色、黄色或红色等。 2. 霉菌菌落：将不同霉菌在固体培养基上培养2～5d，可见霉菌菌落呈绒毛状、絮状、蜘蛛网状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定的局限性（直径1～2mm或更小）。很多霉菌的孢子能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同的颜色，如黄色、绿色、青色、黑色、橙色等。 （二）真菌在液体培养基中的生长表现 1. 酵母菌注意观察其混浊度、沉淀物及表面生长性状等。
酵母的分子生物学鉴定
生物技术通报 ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ ?技术与方法? ２００８年第５期 收稿日期：２００８－０３－１４ 基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３）项目基金（２００３ＡＡ２１４０６１，２００６ＡＡ０２０２０３） 作者简介：唐玲（１９８３－），女，硕士研究生，研究方向：分子生物学；Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｎｇｌｉｎｇ１０１４９９＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：闫云君（１９６９－），男，教授，博士生导师；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｙｕｎｊｕｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ；Ｔｅｌ：（０２７）８７７９２２１４ 酵母种类繁多，不仅作为一种重要的工业微生物被广泛应用于各个领域，近年来，人们还利用酵母发酵来生产抗生素，维生素和酶等高附加值的产品，但酵母也会引发食物、制造物的腐坏变质，从而给人们带来巨大的经济损失，有的酵母还是人体和动物的致病菌（如，Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）。近两个世纪以来，酵母菌分类主要依据形态学鉴定和生理生化特性。目前，已发展起来各种用于酵母快速检测的商业化的试剂盒，可实现部分酵母（多是针对导致疾病的部分致病酵母）的鉴定，但是该类试剂盒对酵母的检测不仅费时，而且鉴定结果准确性不高。由于受到环境因素的影响，某些酵母菌属、种在形态学及生理生化特性方面差异极不显著，在这样的背景下，以化学为基础的分类法建立起来，通过细胞壁的成份、生物合成以及同功酶电泳图谱分析来 对酵母进行分类鉴定。现在，随着分子生物学的发展，ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交，染色体组型分析（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ），染色体ＤＮＡ的限制性片段长度的多 态性分析（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａ ｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＤＮＡ），线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ）及核糖体ＤＮＡ序列分析（ｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），实时ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ），基因芯片 （ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ）等分子生物学的方法广泛地应用于酵母的鉴定中。分子生物学的方法不仅能够快速的将各种酵母鉴定到属或种，而且鉴定的结果精确度更高。随着数据库中分子信息量的增加，近年来应用分子生物学技术鉴定酵母菌种的研究越来越广泛。 １核糖体ＤＮＡ鉴定法 核糖体ＤＮＡ普遍存在于生物中，真核生物的 核糖体ＲＮＡ中包括２６Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ和５Ｓ４种不同 酵母的分子生物学鉴定 唐玲 刘平黄瑛杨江科闫云君 （华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室，武汉４３００７４） 摘 要： 酵母种类繁多，与人类的关系极其密切，但目前由于研究方法的不同，对于酵母的分类还存在着不同的分 类体系。而准确快速的对酵母进行鉴定，既可以有效防止食品腐化变质，又可以增加经济效益，同时也为酵母的分类鉴定奠定一定的理论基础。对常用的核糖体ＤＮＡ鉴定法、ＤＮＡ指纹图谱鉴定、脉冲场电泳鉴定、实时ＰＣＲ和基因芯片等分子生物学鉴定方法在酵母鉴定工作中的研究情况进行了比较。 关键词： 核糖体ＤＮＡ ＤＮＡ指纹图谱脉冲场凝胶电泳实时ＰＣＲ基因芯片 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＹｅａｓｔ ＴａｎｇＬｉｎｇＬｉｕＰｉｎｇＨｕａｎｇＹｉｎｇＹａｎｇＪｉａｎｇｋｅＹａｎＹｕｎｊｕｎ （ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７４） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｙｅａｓｔｓｈａｖｅｗｉｄｅｒａｎｇｅａｎｄａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｈｕｍａｎｂｅｉｎｇｓ．Ｔｈｅｒｅｅｘｉｓｔｓｏｍｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｏｆ ｙｅａｓｔｓｂａｓｅｄｏｎｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｔｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏｆｉｎｄａｎａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｙｅａｓｔｓ，ｔｈｕｓｂｅｉｎｇａｂｌｅｔｏｐｒｅｖｅｎｔｆｏｏｄｃｏｒｒｕｐｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｅｃｏｎｏｍｉｃｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ａｌｓｏ，ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｂｏｕｔｔｈｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｂｅｐｒｏｖｉｄｅｄ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｄｅｓｃｒｉｂｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｙｅａｓｔ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ，ＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，ｐｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄｇｅｎｅｃｈｉｐｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ＲｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇＰｕｌｓｅｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ
普通细菌培养鉴定操作规程
普通细菌培养鉴定操作规程 1 检验目的 做疾病的病原学诊断，查找于疾病有关的病原菌以及了解微生物与疾病的关系，指导临床治疗及预后和流行病学的调查。 2 原理 人体很多部位与外界相通，存在栖息菌群，但不致病，当菌群失调或分离到致病菌则具有临床意义；另外机体某些部位是无菌的，如检出细菌则视为致病菌。并排除采样及操作污染。 3 标本要求 （1）标本类型：血液，骨髓，脑脊液，胸水，腹水，尿液，等体液；痰液，前列腺液，脓液，组织分泌物或穿刺液等。 （2）标本采集：见标本采集手册 （3）标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。 （4）标本拒收状态：非无菌方式采集的标本或未按要求部位采取的标本。 4 容器和添加剂类型 均使用灭菌器皿盛放标本 5 试剂 （1）试剂名称：革兰氏染液、氧化酶试剂、3%触酶、血平板、中国蓝平板、SS平板、柯玛嘉平板、相关生化试剂等。 6仪器设备： （1）接种针、接种环、酒精灯 （2）梅里埃ATB药敏鉴定仪 （3）显微镜、SPX-150B型生化培养箱、超净工作台、台式离心机、天平 7 校准程序 (送市计量质量检测研究所校准) 8操作步骤
（1）所有标本按照培养目的增菌培养12-18小时后盲目接种，血培养发现阳性立即进行接种。 （2）接种：以上增菌标本及其他临床标本用接种环取标本接种环划线血平板及其他选择性培养基上,35℃培养过夜，观察结果。 （3）涂片：肉眼见细菌生长，取生长物涂片做革兰氏染色； （4）纯培养：根据需要接种血平板、巧克力、中国蓝/柯玛嘉或厌氧平板过夜培养以获得纯培养。 （5）鉴定：按照鉴定仪要求调配菌液浓度，细菌的鉴定见梅里埃ATB微生物鉴定系统 9质量控制： 参加我科质量管理小组组织的各项质量控制活动 10 生物参考区间 血液，尿液，脑脊液等无菌部位采取的标本未见细菌生长；其他标本如大便，痰液为正常菌群或未见致病菌。 11 患者检验结果的可报告区间 细菌鉴定到种或属；菌群调查报告比例。 12 临床意义： 为医生提供病原学诊断，并为进一步药敏实验提供依据。
杜仲内生真菌的分离及其鉴定
杜仲内生真菌的分离及其鉴定 摘要:从杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的根?茎?叶中分离得到80株内生真菌,经显微形态特征观察鉴定为14个属,其中根部33株涉及10个属,茎部26株涉及9个属,叶部21株涉及6个属?结果表明,杜仲的不同部位内生真菌的数量?分布和种群存有差异? 关键词:内生真菌;分离;鉴定;杜仲 Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Eucommia ulmoides Abstract: Eighty strains of endophytic fungi attributed to 14 genus were isolated and morphologically identified from the roots, stems and leaves of Eucommia ulmoides Oliv.. Among them, 33 strains of 10 genera were obtained from roots,26 strains of 9 genera from stems, and 21 strains of 6 genera from leaves. The results showed the facts that the quantity, population, and distribution of the endophytic fungi were varied in different tissues of Eucommia ulmoides. Key words: endophytic fungi; isolation; identification; Eucommia ulmoides Oliv. 杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是我国独有的杜仲科杜仲属中的单种植物,具有 降压?消炎?防癌抗癌等多种药用功效?杜仲全身是宝,经济价值极高[1]?近年来,杜仲研究?开发取得了突破性进展,更使其身价倍增?目前这一重要的药用植物在利用上一方面已出现野生资源匮乏?药材供应不足的问题,另一方面其产品开发与活性物质提取的研究又较活跃,故寻找类似的替代资源受到关注[2]?自发现了能够产生紫杉醇的内生真菌以来,植物内生真菌能够产生与宿主相同或相似的生物活性成分已逐步得到验证[3,4]?本研究对杜仲内生真菌的种类进行分离及鉴定,以期了解杜仲内生真菌的资源情况,进一步研究其生物多样性? 1材料与方法 1.1材料 分离所用材料为杜仲的根?茎?叶,采自西北农林科技大学林学院校园内,树龄约20年,树体健壮,无病虫害? 1.2培养基 分离培养基为WA-抗生素培养基:琼脂20 g,氨苄青霉素200 mg,链霉素200 mg,水1 000 mL?
菌种鉴定
?（1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。 ?（2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 CICC拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 ?（3）分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、 BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。 ?（4）API细菌数值鉴定系统 API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 ?（5）功能性分析及功能基因
临床标本细菌培养鉴定常见的15个疑问
问题1：如何正确应用药物敏感结果？ 正确运用药敏试验结果应考虑以下3个方面： 首先要确定病原菌，如未找到真正的致病菌，药敏实验不但不能指导用药甚至可能误导临床； 重视耐药监测，这是经验用药的一个重要的参考； 考虑到药敏试验的局限性：体外报告敏感的药物体内治疗不一定有效，而体外报告耐药的药物体内治疗不一定无效。 问题2：是否MIC越低的药物越好？ 不一定。因为不同药物对同种细菌，同一药物对不同细菌的折点均可不同，并且若细菌产生某些特殊耐药机制时，即使体外敏感也应报耐药，另外尚需考虑药动学和耐受性。因此，不能单纯比较MIC值而认为MIC越低的药物就一定越好。 MIC只表示一种药物对某一株细菌抗菌作用的强弱，MIC越低（离中介值越远）说明该药物对相应的病原菌的作用越强。只能比较同一种药对同一株菌，若MIC值升高，可认为其耐药性提高。 问题3：是否所有报告的细菌均为病原菌？ 不一定。原因如下： 所报告细菌为污染菌或定植菌，细菌培养结果的临床意义大小与所取标本有关。如为血液等无菌标本则临床意义较大，但即使血培养阳性也可能为污染菌。某些标本易受污染如痰标本易于受咽喉部携带菌的污染，尿培养易受下尿道、尿道口寄居菌污染。 可能为应用抗菌药后的菌群交替或菌群失调。特别是原为复数菌感染时，针对优势菌治疗一段时间后可能非优势上升为优势菌，或广谱抗菌药治疗后可
能出现真菌感染。 有２种以上病原菌时因生长速度不同、营养要求不同，培养结果不能真实反映病原菌的种类、数量。 问题4：为什么有时痰涂片结果与痰培养结果不一致？ 由于痰标本进行培养和涂片时选取的部位不一致； 某些快生长菌所占比例并不多，但由于生长速度快、营养要求低，能在培养过程中迅速变为优势菌而掩盖其他菌的生长； 标本从采集到接种的时间过长，造成部分苛养菌死亡，在涂片中看到的只是菌的残骸而非活菌。 问题5：我们想用的药物在药敏试验中没有做？ 1.天然耐药 2.可能是药物的敏感性被其他药物所预报 问题6：为什么有的菌报告很多种药物，有的仅报告几种药物？ 报告的药物种类根据细菌种类的不同而有所不同，如铜绿假单胞菌报告的药物较多，而嗜麦芽窄食单胞菌报告的药敏较少。 问题7：是否能将所用的药都做药敏试验? 1.没有必要：通过耐药机制和标志性药物可以预测其他抗菌药物的敏感性 2.没有可能：不是所用药物都可以做药敏试验（需要药物在体外稳定，需要有操作标准和解释标准） 问题8：选择药敏报告敏感的药物，为什么临床治疗无效？ ①体外药敏试验只能预测体内治疗效果，并不等同；一般来说，耐药＝治疗无效；敏感≠治疗有效；
真菌的培养及形态观察
题目：真菌的培养及形态观察 动物科学1204班聂孝明 20121546 指导教师：邹玲 摘要：了解酵母菌和霉菌的菌落特征及在培养基中的生长表现，还有真菌的分离培养方法和载片培养，学习真菌水浸片的制备及形态观察。本实验通过真菌的固体培养，酵母菌水浸片旳制备观察及划线分离培养的方法进行形态观察。在固体培养基上，观察到A菌落成绿色比较光滑、有分生孢子、菌丝有横隔为青霉。D菌落有大量直立菌丝并且顶部发黑、有孢子囊、菌丝无横隔为根霉。B菌落大而光滑、显微镜下菌体较大、有假菌丝并且出芽生殖的为酵母菌。 关键词：酵母菌霉菌形态观察分离培养 引言：真菌在自然界中分布广、数量大、种类多。酵母菌是单细胞微生物，细胞核和细胞质有明显的分化，个体直径比细菌大10倍左右，多为圆形或卵圆形，无性繁殖为出芽生殖，可以形成假菌丝，有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。用美蓝染色液制成水浸片可以观察期外形和区分细菌的死活。霉菌的营养体是分支的丝状体，较大，分为基内菌丝和气生菌丝，不同的霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子，细胞易收缩变形，孢子容易分散。利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰，完整，保持自然状态的霉菌形态。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌种：酵母菌，青霉，根霉的斜面培养菌种 1.1.2试剂：沙堡培养基、美蓝染色液、70%酒精、无菌水等 1.1.3其他：解剖针、玻片、盖玻片、接种环、显微镜等 1.2方法 1.2..1真菌的划线分离培养 培养基：将沙堡琼脂培养基融化后，冷却至45摄氏度，注入无菌平皿中，每皿15~20ml，做成平板备用。 接种：取待分离的材料少许，投入无菌水试管中，振荡，使分离菌悬浮于水中，将接种环火焰灭菌后冷却，取上述悬液，进行平板划线分离。 培养与观察：划线完毕后，置于28摄氏度温箱培养2~5天，待形成子实器官后，取单个菌落部分，制片镜检。若只有一种菌，既得纯培养物。如有杂菌可取培养物少许制成悬液，用作划线分离，有时反复多次可获得纯种。也可在放大镜下观察，用无菌镊子夹取一段分离的真菌菌丝，在平板上分离培养，即可得到真菌的纯培养物。 1.2.2真菌在固体培养基上的生长表现： 酵母菌在固体培养基上菌落呈油脂状或蜡质状，表面光滑、湿润、粘稠，有的表面呈现粉粒状，粗糙或褶皱，菌落边缘整齐、缺损或带丝状。菌落颜色有乳白色、黄色、红色等。将不同的霉菌在固体培养基上培养2~5d，可见霉菌有绒毛状、絮状、绳索状等。大小依霉菌种类而异，很多霉菌的孢子和菌丝能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同的颜色，如黄色、绿色、黑色、橙色等。 1.2.3真菌的形态观察 1.2.3.1酵母菌水浸片的制备：将美蓝染色液或蒸馏水滴于干净的载玻片中央，用接种环以无菌及操作取培养48h的酵母菌少许，均匀涂于液滴中，染色2~3min后加盖玻片。注意切勿产生气泡，然后低倍镜和高倍镜观察其细胞形态、芽殖方式，注意酵母菌的形态、大小和芽体，同时可以根据是否染上颜色来区别死活细胞。 1.2.3.2挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中，震荡试管制成孢子悬液，用灭菌滴管吸取
真菌的分离及常用培养基
真菌的分离及常用培养基 关键词：真菌抗生素念珠菌白假丝酵母菌北纳创联北京标准物质网 医学真菌形态学观察是认识真菌的第一步，但仅通过光学显微镜对其进行观察并不能直接鉴定为真菌，需要对疑似相关病变部位的标本进行采集及分离，然后在合适的培养基进行培养。 一、病变部位标本的采集分离 通常采集疑似病变部位的皮肤附属物、分泌物、血液、痰液、脑脊液等体液，注意标本的新鲜度、无菌性、充足性，而且要对所采集标本进行正确消毒，杀死其中混有的杂菌。标本为脑脊液时，需进行离心，收集沉淀物进行培养，标本为血液时，需要先行增菌培养后再分离，这样可增加阳性率，未增菌培养的阴性结果并不能排除阳性结果。 二、真菌培养常用的培养基 目前商品化的真菌培养基多为干燥脱水的形式，可以按照配制说明书进行配制，值得注意的是，使用后的装培养基的瓶盖须拧严，防止受潮，以各下次使用。 1.沙保弱培养基及含抗生素的沙保弱培养基沙保弱培养基是培养真菌最常用的培养基，绝大多数的真菌均可以在其上生长，沙保弱培养基还可以添加抗生素，从而抑制多数细菌和污染真菌的生长速度。含抗生素的沙保弱培养基多用于皮肤癣菌和绝大多数致病真菌的分离和培养，但值得注意的是含有抗生素的培养基会抑制念珠菌属、隐球菌和少量丝状真菌的生长。 2.玉米粉（厚膜孢子）培养基多用于鉴别念珠菌属，培养基中的吐温可以促进白假丝酵母菌产生厚膜孢子，同时可以加入1％葡萄糖促进红色毛霉菌生长，并抑制须毛霉菌的生长。 3.土豆葡萄糖培养基土豆培养基中需将土豆切成小于1cm。的小块，常用于诱导真菌形成孢子或产生色素。 4.脑-心浸液琼脂培养基是一类营养丰富的真菌培养基，人工配制过程较为烦琐，一般通过商品化的培养基按照说明书进行配制。BHI多用于室温培养致病真菌，也可用于35～37℃培养致病真菌的酵母相。
真菌学实验指导
本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。 本指导书适用于生物技术和生物科学专业。
1、实验：内生真菌的分离及鉴定 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????3 2、实验报告基本内容要求 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????7 3、实验报告格式????????????????????????????????????????????????????????????????8
实验内生真菌的分离及鉴定 实验学时：18 实验类型：综合 实验要求：选修 一、实验目的 1.了解真菌形态的基本特征。 2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。 二、实验内容 采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。 三、实验原理、方法和手段 （一）实验原理 根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。 （二）实验手段和方法 1、内生真菌分离纯化方法 1.1样品的表面消毒及预处理 分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。 老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。 对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒： 75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块 将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。 灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻
一种抗真菌抗生素的分离纯化及初步鉴定
一种抗真菌抗生素的分离纯化及初步鉴定 摘要:从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,编号为WS-23883,其发酵提取物对多种植物病原真菌具有很强的抑制活性?对其产物进行提取精制及制备液相纯化,获得了纯度达90%以上的化合物?生测表明,在20 μg/mL浓度下该抗生素对多种植物病原真菌的抑制率达100%?根据活性产物紫外吸收光谱,可判断其为一多烯大环内酯类抗生素?质谱分析表明,活性化合物分子质量约667 u,据此判断其为一四烯大环内酯类抗生素? 关键词:多烯大环内酯;抗生素;化合物;纯化;鉴定 Isolation, Purification and Preliminary Identification of A Kind of Antibiotic with High Antifungal Activity Abstract: One actinomyces strain WS-23883 was isolated from soil sample collected in Wuzhishan Mountain area, Hainan province. The extraction of the fermentation broth was bioassayed with some plant disease pathogens; and it exhibited high antifungal activity. The compound with purity above 90% was obtained through macroporus resin column absorbtion method and preparative HPLC. The bioassay showed that the inhitition ratio was 100% at the concentrition of 20 μg/mL. The UV absorption spectrum and mass spectrum showed that the compound was atetraene macrolide antibiotic. Key words: polyene macrolide; antibiotic; compound; purification; characterization 从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,其发酵提取物对多种供试植物 病原真菌及某些腐生真菌具有很强的抑制活性?采用常规方法对该菌的发酵产物进行了提取精制,得到了纯度在90%以上的样品,从目标产物的紫外吸收光谱可判断其为一多烯类抗生素?HPLC-MS检测表明,活性产物分子离子峰为667,可以确定其分子质量约为667 u,综合分析后确定其为一四烯大环内酯类抗生素? 1材料与方法 1.1菌株 1.1.1抗生素产生菌编号为WS-23883,从海南五指山采集的土样中分离得到,由湖北省生物农药工程研究中心保存? 1.1.2生测指示菌番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)?小麦颖枯病菌(Septoria nodorum)?小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)?水稻纹枯病菌(Rhizoctonia
产纤维素酶真菌的分离和鉴定
产纤维素酶真菌的分离、筛选与鉴定 一、采样 地点：深圳大学杜鹃山深圳大学文科楼荔枝园深圳大学文山湖树丛 用具：灭菌信封小铁铲小刀分离培养基手套 采样的方法：取采样地点的表层土或地面15cm下的土样约10g，装入信封，立刻到实验室分离纯化 二、培养基： （1）马丁氏培养基：KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂20.0 g、水1000ml，pH 自然。 （2）PDA培养基：PDA培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20 %土豆浸出液，1 %葡萄糖，2 % Agar。20 %土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。 （均需要加入抗生素100μg/ml） 产酶筛选培养基（CMC培养基）：羧甲基纤维素钠（CMC）20.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母抽提物2.0 g、NaCl 5.0g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂20g、蒸馏水1 000ml。 1%CMCNa底物溶液：1克CMCNa加热溶化于100ml pH值4.8，0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中。 0.lmol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓 0.1mol/L柠檬酸: 含柠檬酸·H2O 21.01克/1000毫升。 0.1mol/L的柠檬酸三钠: 含柠檬酸三钠·2H2O 29.4克/1000毫升。 0.1mol/L的柠檬酸40ml与0.1mol/L的柠檬酸三钠60.6ml混合即可。 刚果红染液：2% 刚果红溶液。 NaCl脱色液：2%氯化钠溶液。 三、实验方法 3.1 真菌菌株的分离 取土样方法如前所述。取1.0 g所采集的土样加入到装有9 ml无菌水的试管中，充分振荡混匀后，吸取上清液作一系列梯度稀释，10-1，10-2，10-3，将稀释液涂布在分离培养基（可选择查氏、马丁氏或PDA培养基的任两种，倒平板前加入100 μg/ml头孢菌素或链霉素等抗生素），于28℃下培养，待菌落成熟，形成孢子后（约需5-7 d）将单菌落上的少量孢子点种至纤维素酶产生菌筛选培养基（CMC平板）平板上( 用前加入适量抗生素来抑制细菌生长) , 28℃倒置恒温培养。培养5-7d后用刚果红染色、NaCl脱色后筛选菌落周围有明显透
真菌形态的几种观察方法
真菌形态的几种观察方法.txt39人生旅程并不是一帆风顺的，逆境失意会经常伴随着我们，但人性的光辉往往在不如意中才显示出来，希望是激励我们前进的巨大的无形的动力。40奉献是爱心，勇于付出，你一定会收到意外之外的馈赠。真菌形态的几种观察方法 真菌作为一种实验材料，在微生物实验室中的应用是相当普遍的，正确的培养观察方法，能够如实地反映其本质特征。下面介绍实验室中真菌形态的几种观察方法。 1．载片培养法 载片培养方法是实验室观察真菌形态的基本方法。此法的基本步骤是：在无菌条件下，用无菌吸管吸取融化的培养真菌的固体培养基，快速地滴一滴于无菌的载玻片上，待其冷却以后，用接种环沾取少许孢子或者挑取一点菌丝段于凝固的培养基上，上面放上无菌的盖玻片。然后，将此片子放入干净的培养皿中，培养皿底部放入潮湿的吸水滤纸，或者将培养皿底放入一些水，中间用玻璃棒隆起，将做好的培养片子搭放在上面，合适温度下培养。将培养好的片子取出，用小镊子轻轻地取下上面的盖玻片，把盖玻片转放于另一干净的载玻片上，待自然干燥后，两边用透明胶固定，用棉蓝染色液染色。 载片培养法还可以这样进行：将厚度约0.5mm的平板培养基用小刀切成大小0.5cm2的小块，挑取一小块培养基放于干净的载玻片上，同样的方法接种、培养观察。还可以用刀片将培养好的载玻片上的多余培养基割去，自然干燥后，用大一点的盖玻片盖上菌丝，用同样方法两边固定，染色观察，这种方法特别适用于产生无性孢子的真菌的形态观察。该方法要注意以下几点：滴的培养基不能太多，接种物不能太多，防止污染。 2．插片培养法 插片培养法是实验室观察真菌形态的另一种基本方法。这种方法的基本步骤是：将菌丝块接种于固体平板的中间。假如是以孢子接种，则将孢子稀释液涂布于固体平板上，然后，用小镊子夹起一块无菌的盖玻片，以45度角的角度斜插入培养基中，不要插入培养基太深，让菌丝爬上盖玻片；培养好了以后，再用小镊子将盖玻片取出，自然干燥以后，将盖玻片转移到一干净的载玻片上，用同样的方法两边固定，染色观察。该方法要注意：插片的角度要掌握好，不能太直或太平；当两面都有菌丝时，擦去背对中心的那面的菌丝，以避免干扰。 3．粘片法 粘片法是用透明胶粘贴菌丝或者孢子进行观察的方法。用剪刀剪取一小段透明胶，用小镊子夹住一个角，轻轻地粘一些菌丝或者孢子，然后将其放入一干净的载玻片上，在载玻片上滴一滴染色液，可以染色观察。此法要注意：粘贴时，不要用力粘的太多；粘上菌丝或者孢子的透明胶放入载玻片上，不要移动，要一次放好。 4．平板观察法 平板观察法是在平板上直接观察真菌的方法。对菌丝生长得比较稀疏的真菌和观察基内菌丝。此法比较直接真实地反映菌丝的形态特征，观察时将平板的上盖拿开，倒置于显微镜的载物台上。这种方法可以消除由于培养体变干或者放在菌丝表面的盖玻片等可能出现的影响。此
真菌的分离培养和鉴定论文
内蒙古广播电视大学 “一村一名大学生计划”毕业作业作业题目真菌的分离培养和鉴定___ 教学点名称：包头广播电视大学_ 学员姓名：张瑞光__________ 学号：1015004452077___ 专业：畜牧兽医专科____ 入学时间：2010秋_________ 指导教师：杨瑞芳 _________
真菌的分离培养和鉴定 【摘要】：从发霉的红薯上和酸败腐烂的苹果上挑取霉变物用沙堡琼脂培养基28℃培养2-3天，分离出几个真菌菌株。将分离株重新进行平板划线分离，挑取单菌落表面的少许孢子用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行载片小培养，经28℃培养2—3天于低倍镜下观察，通过菌丝和孢子对分离株进行鉴定。观察到簇生在分生孢子梗的顶端的呈帚状分枝的分生孢子和有隔菌丝，可鉴定为青霉类菌；观察到分生孢子梗上呈轮状着生、具有3个分隔、弯曲的孢子，可鉴定为弯孢霉类菌；观察到单细胞的芽殖孢子，并通过进一步的酵母菌生理生化测定，可鉴定为酵母菌。 【关键词】：真菌；菌落；菌丝；孢子 1 前言 真菌一词来源于拉丁文的“蘑菇”，现在真菌这一名词的概念不仅包括蘑菇，而是代表着一个相当庞大的生物类群。什么是真菌呢？从生物学的观点来看，它们是一大类真核微生物，无根茎叶，不含叶绿素，不能利用无机物来制造食物，靠寄生或腐生生活，仅少数为单细胞，其余为多细胞，大多数真菌有分枝或不分枝的丝状体，能进行有性生殖和无性生殖。从形态上分为酵母菌、霉菌、担子菌。 其实，真菌并不像其看起来的这般抽象，在我们的日常生活中几乎到处都有它们的存在，我们每个人都有过接触和
不同程度的感性认识。例如酿酒、制馒头用的酵母；酒曲的曲种（曲霉和根霉）；做豆腐乳的毛霉和红曲霉；发酵饲料的黑曲霉；味美可口的蘑菇、木耳、银耳、猴头；作为中药的神曲、麦角、虫草、茯苓、灵芝；此外还有食品、衣物、用具等因潮湿而发生的霉；引起农作物病害的小麦锈病等等都是真菌。 真菌与细菌的大小、形态、结构及化学组成差异很大，单细胞个体比细菌大几倍至几十倍，具有细胞壁，但不含细菌细胞壁的肽聚糖。有些真菌因环境条件的改变而改变形态，称之为真菌的两相性，如假皮疽组织胞浆菌在动物机体呈酵母菌样。而在人工培养基上呈丝状。 真菌不仅种类多，数量大，而且分布极为广泛，与人类生产与生活有着极密切的利害关系。有些菌丝可引起人与畜禽疾病，有些霉菌还产生毒素，直接或间接的危害人类健康。因此，了解真菌的培养方法，认识其形态十分重要。 近年来在真菌分类方面趋向于采用Anisworth&bisby 的《真菌学辞典》介绍的分类系统。该系统认为真菌不属于低等植物，而是属于单独成立的真菌界，界以下分为黏菌门和真菌门。真菌门再分为鞭毛菌亚门、接合菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门。本研究从自然界分离到几株真菌，并用真菌分类方法对其进行了鉴定。
利用ITS序列鉴定真菌
北方民族大学实验论文 题目：利用ITS序列鉴定真菌 学院：生物科学与工程学院 专业：生物技术 班级： 082 姓名：李晓飞李妍吾木尔古丽 张瑞莉陈波艾克拜尔 指导老师：刘建利 完成日期：2011年5月18日——2011年6月5日
利用ITS序列鉴定真菌 李晓飞李妍吾木尔古丽张瑞莉艾克拜尔陈波 （北方民族大学生物科学与工程学院银川750021） 摘要：采用实验室提供的两株酵母菌，活化培养后，经基因组DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段（ITS1区）进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后送至测序公司测序，所测序列经Genbank比对后，两株菌分别为掷孢酵母属TY-241菌株(Sporobolomyces sp)和假丝酵母ST-50菌株（Candida sp）。 关键词：ITS序列酵母菌PCR 菌种鉴定 1 材料与方法 1.1试验材料与试剂 实验室提供的红色掷孢酵母菌[1]和白色产香酵母菌。 YEPD液体培养基[2]配方：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，配成1L溶液，分装100/250ml，121℃灭菌15min。 裂解液[3]：1L裂解液中需加Tris1.2114g，EDTA8.767g，SDS5g，用1M的NaOH调至8.0，121℃灭菌30min备用。 醋酸钾溶液：1L溶液中含醋酸钾245.35g。 氯仿-异戊醇（24：1）：现配现用。 70%乙醇：用95%乙醇配制，现配现用。 10×TAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g，EDTA29.22g，用HCl调pH至8.0。 1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次。1.2主要仪器与设备 表一实验中使用的主要仪器 仪器名称型号产地 立式自控高压蒸汽灭菌器LDZX-40SSI 上海申安医疗器械厂 数显恒温水浴锅HH-4 国华电器有限公司 电泳仪DYY-12 北京市六一仪器厂 制冰机AF200PSC50R ΜSA 生物安全柜HFsafe 1200/C 上海力申科学仪器有限公司电冰箱BCD-219D 青岛海尔股份有限公司Sigma高速离心机3K30 Germany 电子精密天平HR-200 上海精科天平 酸度计DELTA302 上海 电子可调电炉101RF-3 天津市泰斯特仪器有限公司双层恒温振荡器THZ-9511K 太仓市实验设备厂 紫外分析仪WD-9403C 北京市六一仪器厂