细胞基因敲除--CRISPR-Cas9技术流程

CRISPR/Cas9技术基本流程基因组编辑（Genome Editing）步入Cas9的时代

专业的CRISPR/Cas9介导的knock-out和knock-in就

在南京尧顺禹！

https://www.360docs.net/doc/9811213555.html,

南京尧顺禹—CRISPR/Cas9技术专业服务公司

一、CRISPR/Cas9技术介导的基因敲除和敲入

1、基本原理

CRISPR/Cas9靶向基因改造（敲除、敲入）技术是最新发展起来的一种强有力的用于基因组编辑（genome editing）的分子生物学工具，现已广泛应用于人、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、家蚕、线虫、酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻和小麦等各类动植物个体或细胞基因组的遗传学改造。相较于TALEN（Transcription Activator-Like Effector Nuclease）技术，CRISPR技术的效率要高得多，而且采用CRISPR技术可以一次性的对多个基因同时进行基因敲除和/或敲入（Science, 2013, 15 February, p. 823）。而先前担心CRISPR/Cas9技术的脱靶问题，最近已有美国马萨诸塞州坎布里奇博大研究所（Broad Institute in Cambridge, Massachusetts）的合成生物学家张丰（Feng Zhang）通过使用带有点突变的Cas9完全解决（Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380-9）。美国哈佛大学的George Church认为，CRISPR/Cas9技术的高效率和易用性将是其它已有基因组改造技术包括TALEN等所无法匹敌的（Science. 2013 Aug 23;341(6148):833-6）。

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），即成簇规律间隔的短回文重复序列。Cas9蛋白是一种能够降解DNA分子的核酸酶（nuclease），其中含有两个酶切活性位点，每一个位点负责切割DNA 双螺旋中的一条链。CRISPR在大约40%的细菌和90%的古细菌（archaea）的基因组中均有存在，它依赖crRNA (CRISPR RNA能够与tracrRNA 配对，形成双链RNA结构，这种双链RNA分子能够介导Cas9核酸内切酶对与双链RNA分

子互补结合的DNA序列进行切割) 和tracrRNA (trans-activating chimeric RNA, 即反式激活嵌合RNA，一种非编码RNA，能够促进crRNA的形成，是Cas9蛋白发挥RNA介导的DNA 切割作用必不可少的辅助因子)对外源DNA进行特异的识别，然后使用Cas9对外源DNA进行序列特异性地切割降解，从在细菌和古细菌细胞发挥了一种获得性免疫的作用。利用这一细菌获得性免疫的工作原理，美国加州大学伯克利分校（University of California, Berkeley）的生化学家Jennifer Doudna研究团队将tracrRNA和空格RNA（spacer RNA）组合起来，形成一个所谓的“向导RNA”分子（single-guide RNA：sgRNA），然后将其与Cas9蛋白混合在一起，成功地对特定的DNA位点进行了切割（Science , 17 August 2012, p. 816）。由于sgRNA是通过其中的20核苷酸特异识别目标基因，设计起来非常方便，因此，在这一里程碑式的研究论文发表后，CRISPR技术得到了迅猛的发展。自2013年1月起，大量的有关利用CRISPR技术的文章发表在Science、Nature和Cell上，形成了一个CRISPR热潮。由于CRISPR系统是以RNA作为基因组定位工具，而ZFN（锌指核酸酶）和TALEN核酸酶则都是以人工组装的特异性DNA位点结合蛋白作为基因组定位工具，用ZFN和TAELN技术需要好几个月的实验结果，用CRISPR技术只需要几个星期就可以拿到（Science. 2013 Aug 23;341(6148):833-6）。

2、CRISPR/Cas9技术特点：

2.1 无基因序列、细胞、物种限制；

2.2 实验设计简单准确、实验周期短、成本低；其中适合于sgRNA识别的目标序列在基因组上广泛特异存在。

2.3 成功率几乎可达100%；毒性低，使用带点突变的Cas9(D10A)可避免脱靶效应（Cell. 2013 Sep 12;154(6):1380-9）。

2.4 活性明显高于人工构建的ZFN和TALEN核酸酶活性。

2.5 克服了常规的ZFN和TALEN方法中制备有活性的人工合成核酸酶较繁琐的确点，更有专业网站辅助设计可特异识别目标基因的gRNA，设计过程非常简单易行。

2.6 CRISPR/Cas9技术是在DNA水平上进行基因敲除，将暂时性的基因敲降（Knock down）如RNA干扰（RNAi）和MO敲降等转变成永久性的基因敲除（Knock Out）转变，建立的稳定可传代的基因敲除的细胞系或突变体系可极大地方便研究者的深入研究。

2.7 融Cas9、sgRNA和报告基因于一个质粒，一个质粒搞定一个基因的修饰。更有报告基因，方便使用荧光显微镜或药物筛选，加速获得基因突变的细胞系。

图1、CRISPR/Cas9 识别目标基因组DNA

(改自Mali et al., 2013. Science, 339(6121):823-6.)

图2、Cas9（D10A）介导的双切口增强基因组编辑的特异性

(引自Ran et al。，2013 Sep 12;154(6):1380-9)

3. CRISPR/Cas9技术应用

3.1 应用于动植物及微生物基因组水平上的编码基因的靶向基因敲除。

细胞内基因组DNA在被CRISPR/Cas9复合体（含Cas9和sgRNA）特异识别后，Cas9核酸内切酶特异切割目标基因组DNA双链，产生DSB（Double-Strand Breaks）损伤，从而诱发DNA损伤修复机制。其中的NHEJ（Non-homologous End Joining）修复是一种易错修复，在修复过程中会随机引入或删除核苷酸对，导致目标基因内核苷酸对的删除或插入（indel），从而形成移码突变，造成目标基因的突变，实现基因敲除。而如果在编码基因的目标外显子的5’侧翼和3’侧翼分别设计一个sgRNA，则可以实现删除目标基因内片段式的基因敲除。

3.2 应用于动植物基因组水平上的非编码基因如lncRNA （long non-coding RNA）和microRNA的靶向基因敲除。

通过在非microRNA前体的发夹结构5’侧翼和3’侧翼游处分别设计一个sgRNA，可以删除发夹DNA结构片段，从而实现对microRNA 的敲除。而如果microRNA成熟片段内含有sgRNA识别序列，则可以直接实现删除或插入式（indel）的基因敲除。同样地，运用CRISPR/Cas9

技术可以实现对lncRNA等的基因敲除。

3.3 应用于动植物及微生物基因组水平上的编码基因的靶向基因敲入。

Cas9切割目标基因DNA双链产生DSB（Double-Strand Breaks）损伤还诱发细胞启动同源重组修复（homologous repair: HR）。此时，若能提供同源修复模板供体（donor），而此供体亦已引入如点突变、保守区域替换、或加入标签编码序列（如GFP、Flag、HA....）等，则研究者可实现在基因组特定位置的基因敲入。

3.4 多基因同时敲除。

由于CRISPR系统是以RNA作为基因组定位工具，因此将一份Cas9和多个针对不同目标基因的sgRNA表达元件同时转入细胞或胚胎，就可轻松实现多个基因的一次性的同时敲除。

3.5应用于动植物基因组水平上目标基因的表达激活和表达抑制。

Cas9含有两个酶切活性位点，每一个位点负责切割DNA双螺旋中的一条链。如果把两个活性位点均突变掉，则该Cas9不在具备核酸内切酶活性，不过，它仍能通过sgRNA结合在目标基因的启动子上。如果在双突变的Cas9（dCas9）的C端加上VP16等具激活活性的功能结构域，则可以特异地激活目标基因的表达。如果在双突变的Cas9（dCas9）的C端加上EVE等抑制活性的功能结构域，则可以特异地抑制目标基因的表达（Cell. 2013 Jul 18;154(2):442-51）。

3.6 应用于动植物基因组水平上目标基因的甲基化、去甲基化等表观修饰。

如果在双突变的Cas9（dCas9）的C端加上甲基化酶或去甲基化酶

等，则可实现对目标基因的表观修饰。

二、本公司的CRISPR/Cas9技术优势

南京尧顺禹研发人员紧跟CRISPR/Cas9技术的进步，研发出了可适合客户不同需求的质粒骨架，在国际上首次构建了多种选择标记的Cas9质粒，仅需4天时间就可以构建出正确的含表达客户特异sgRNA 的Cas9质粒载体，更有多种报告基因可供客户选择，大大加速了客户获得突变细胞系的速度。具体步骤可简述为：1）第一天进行目标基因特异gRNA的设计，根据设计合成一对目标基因特异的Oligos。第二天获得Oligo后，与骨架质粒进行连接和转化。第三天挑克隆进行PCR 验证，同时送测，第四天可得到测序正确的质粒，同时进行质粒抽提。

南京尧顺禹拥有强大的技术支持团体，与国内外众多科研院所合作紧密。目前已为包括：美国宾西法利亚大学、Temple大学、台湾中研院、香港大学、台湾中原大学、复旦大学、南京大学、南京农业大学、南京医科大学、广东珠江水产所等多个国内外单位提供服务。涉及的物种包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、黄颡鱼、猪、羊、鸡、牛等。利用南京尧顺禹提供的Cas9系统，相关单位已建立了多个基因敲除的斑马鱼突变品系以及人和小鼠等动物的细胞系。

三、CRISPR/Cas9技术介导基因敲除详细说明

1、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的一般流程：

1.1 确定待敲除基因的靶位点

1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）

1.3 构建可表达sgRNA的Cas9质粒

1.4 含sgRNA 表达元件的Cas9质粒的活性检测

1.5 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系

2、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的详细过程：

2.1 确定待敲除基因的靶位点

根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显著子或在编码成熟microRNA的外显著子的5’和3’侧翼序列。耗时1-4小时。

2.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligos

确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显著子序列输入到在线的免费设计gRNA的软件Input框中，然后进行设计运算，软件会自动

输出gRNA序列。

一般地，基因特异的gRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer Adjacent Motif，前空格序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）前的20个nt。而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。因此， gRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为gRNA模板序列。

根据选择的gRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos。耗时1-2小时。

2.3 构建可表达sgRNA的Cas9质粒

将合成的Oligos以逐步降温的方法退火成双链，然后与尧顺禹生物提供的Cas9质粒进行连接，连接后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。

次日在LB琼脂平板上，挑取单克隆6个，溶于20ul LB液中，涡旋后，将部分菌液接种到LB液中，37oC下250 rpm生长，另部分的菌液用作模板进行快速PCR，经电泳确定阳性克隆后，将相对于的细菌送商业公司测序，同时将部分菌液接种到LB液体，37oC下250 rpm培养过夜。耗时2天。

2.4 含sgRNA 表达元件的Cas9质粒的活性检测

待测序结果确定序列正确后，小抽得到高浓度高纯度的正确的含sgRNA表达元件的Cas9质粒，用于转染细胞。转染细胞使用

Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，待细胞在96孔板上铺满约70-80%时，使用2 ug Cas9质粒用Lipofectamine 2000转入细胞。如果细胞用脂转困难，可采用电转。选用带有荧光报告基因的质粒，则在24小时后可通过荧光显微镜直接观测转染效率。

将发生转染的细胞如293T细胞或者HepG2细经胰酶消化后，提取基因组DNA用作PCR模板。扩增含目标片段DNA的引物设计（可在设计gRNA时同时设计合成）在目标基因敲除靶位点的5’和3’侧翼，一般地应距离靶序列100-150bp，扩增片段大小在300-450bp。扩增时，应以未转染的细胞基因组DNA作为扩增的阳性对照。用普通Tag酶进行扩增，循环数为35。退火温度以引物性质而定，一般为56-62o C。扩增后的PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，如果是单一条带，可直接进行和T-载体进行连接。然后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。

次日在LB琼脂平板上，挑取单克隆50个，溶于20ul LB液中，涡旋后，将部分菌液接种到LB液中，37o C下250 rpm生长，另部分的菌液用作模板进行快速PCR，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳确定是否有条带，然后将大小相近的10个PCR产物等比例混合后，送商业公司测序，共送测5组PCR产物，同时送测一个以未转染细胞基因组为模板的PCR 产物（注：如果PCR产物仅为一条待，测序时PCR产物无需切胶）。待测序结果返回后，人工阅读测序色谱图。如再任何一组中发现有基因突变，即表明该sgRNA有活性，同时估算突变效率，为进行下一步实验做准备。耗时3天。

2.5 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系

按和上述同样的方法将Cas9质粒转染细胞，如果细胞用脂转困难，可采用电转。通过荧光标记观察转染效率，如果选择了带Neo抗性的质粒，则同时用G418药物筛选。如果有FACS，可直接分选带荧光的细胞。耗时6-7天。

或者当细胞长满培养皿时，将细胞消化成单细胞，采用有限稀释法，接种96孔板。根据前述突变率决定克隆接种数量，由于Indel突变是随机突变。因此，其中的2/3应该是移码突变。如突变率=30%，则建议接种克隆数为96个，最终约有5个阳性克隆。

在荧光显微镜下观测细胞克隆生长情况，选择带有荧光的克隆，适时进行胰酶消化后，提取部分细胞的基因组DNA用作PCR模板。然后以前述引物和PCR条件进行PCR扩增。PCR产物先进行2%琼脂糖凝胶电泳，如果出现条带，则将PCR产物直接送测序。测序时，PCR产物无需切胶。待测序结果返回后，人工阅读测序色谱图。可确定基因是否突变以及突变基因的基因型。耗时10-15天。

将携带有双突变等位基因的阳性克隆扩增，保存，稳转系建立成功。耗时7-10天。

3、利用Cas9质粒建立可遗传的基因敲除动物品系的一般流程：

3.1 确定待敲除基因的靶位点

3.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）

3.3 构建可表达sgRNA的Cas9质粒

3.4 体外转录sgRNA 和Cas9 RNA

3.5 将sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵检测sgRNA活性

3.6 将有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder 3.7 将Founder自交得到F1

3.8 F1自交得到F2

4、利用Cas9质粒建立可遗传的基因敲除动物品系的详细实验过程：4.1 确定待敲除基因的靶位点

和前述3.2.1相同

4.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）

和前述3.2.2相同

4.3 构建可表达sgRNA的Cas9质粒

和前述3.2.3基本过程相同，但需选择带有T7启动子的质粒

4.4 体外转录sgRNA 和Cas9 RNA

使用特定引物，以上述质粒为模板，以高保值酶分别对Cas9和sgRNA进行PCR扩增，循环数设为30个，20 l反应体系。然后将产物纯化用作体外转录模板。

体外转录时，Cas9 RNA需要戴帽和加尾，而sgRNA无需戴帽和加尾。

4.5 将sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵检测sgRNA活性

将体外转录的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入斑马鱼受精卵中进行活性检测；对于非斑马鱼基因，将含待敲除靶位点序列的DNA片段进

行扩增，然后和上述两种RNA共同注射入斑马鱼受精卵。待斑马鱼胚胎发育至24小时，随机选取5个胚胎，提取基因组DNA，然后以此为模板进行PCR扩增。然后按和3.2.4同样的方法进行sgRNA的活性验证。

4.6 将有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder

将体外转录的有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入动物受精卵，获得基因敲除的初建者。待初建者发育至可进行基因型鉴定时（斑马鱼为4个星期），剪取部分尾鳍，提取基因组DNA，作为PCR模板，然后按4.3.5同样的方法进行基因突变鉴定。选取有突变的斑马鱼用作传代实验。

4.7 将Founder自交得到F1

以斑马鱼为例，将阳性Founder自交，得到F1。待F1生长至4星期时，进行剪取部分尾鳍，提取基因组DNA，作为PCR模板，然后按3.2.5同样的方法进行基因突变鉴定。选取有移码突变的斑马鱼用作建系。

8）F1自交得到F2

对于特定的基因，建立基因鉴定的酶切或PCR方法，通过将携带相同基因型突变等位基因的F1斑马鱼自交，获得纯合突变体、杂合突变体。如果纯合突变不致死，则可将纯合突变F2传代，从而建立纯合突变体系。如果纯合突变致死，则可将杂合突变F2传代，从而建立杂合突变体系。

Cas9产品及技术服务目录（2013）

一、质粒构建

货号产品名称产品特征

S-001G pYSY-CMV-Cas9-U6-gRNA-EF1a-eGFP质粒含CMV启动子驱动的人源化Cas9表达元

件；非洲爪蛙EF1a启动子驱动的绿色荧光报

告基因（eGFP）以及以人U6启动子驱动客户

特异sgRNA表达的表达元件。可直接用于细

胞转染进行基因敲除。

S-001R pYSY-CMV-Cas9-U6-gRNA-EF1a-mCherry 质粒含CMV启动子驱动的人源化Cas9表达元

件；非洲爪蛙EF1a启动子驱动的红色荧光报

告基因（mCherry）以及以人U6启动子驱动

客户特异gRNA表达的表达元件。可直接用于

细胞转染进行基因敲除。

S-001F pYSY-CMV-Cas9-U6-gRNA-EF1a-eYFP 质粒含CMV启动子驱动的人源化Cas9表达元

件；非洲爪蛙EF1a启动子驱动的黄色荧光报

告基因（eYFP）以及以人U6启动子驱动客户

特异sgRNA表达的表达元件。可直接用于细

胞转染进行基因敲除。

S-001N pYSY-CMV-Cas9n-U6-gRNA-SV40-Neo质粒含CMV启动子驱动的人源化Cas9（D10A）

（Cas9缺口酶）表达元件；SV40启动子驱动

的Neo抗性基因表达元件以及以人U6启动子

驱动客户特异sgRNA表达的表达元件。可直

接用于细胞转染进行基因敲除。

S-002G pYSY-CMV-Cas9n-U6-gRNA-EF1a-eGFP质粒含CMV启动子驱动的人源化Cas9表达元

件；非洲爪蛙EF1a启动子驱动的绿色荧光报

告基因（eGFP）以及以人U6启动子驱动客户

特异sgRNA表达的表达元件。可直接用于细

胞转染，一对质粒可实现基因敲除。

S-002R pYSY-CMV-Cas9n-U6-gRNA-EF1a-mCherry 质粒含CMV启动子驱动的人源化Cas9（D10A）

（Cas9缺口酶）表达元件；非洲爪蛙EF1a

启动子驱动的红色荧光报告基因（mCherry）

以及以人U6启动子驱动客户特异gRNA表达

的表达元件。可直接用于细胞转染，一对质

粒可实现基因敲除。

S-002Y pYSY-CMV-Cas9n-U6-gRNA-EF1a-eYFP 质粒含CMV启动子驱动的人源化Cas9（D10A）

（Cas9缺口酶）表达元件；非洲爪蛙EF1a

启动子驱动的黄色荧光报告基因（eYFP）以

及以人U6启动子驱动客户特异sgRNA表达的

表达元件。可直接用于细胞转染，一对质粒

可实现基因敲除。

S-002N pYSY-CMV-Cas9n-U6-gRNA-SV40-Neo质粒含CMV启动子驱动的人源化Cas9（D10A）

（Cas9缺口酶）表达元件；SV40启动子个驱

动的Neo抗性基因表达元件以及以人U6启动

子驱动客户特异sgRNA表达的表达元件。可

直接用于细胞转染，可直接用于细胞转染，

一对质粒可实现基因敲除。

S-003 pYSY-CMV-Cas9-U6-gRNA质粒含CMV启动子驱动的人源化Cas9表达元

件以及以人U6启动子驱动客户特异sgRNA表

达的表达元件。可直接用于细胞转染进行基

因敲除。

S-004 pYSY-CMV-Cas9n-U6-gRNA 质粒含CMV启动子驱动的人源化Cas9（D10A）

（Cas9缺口酶）表达元件以人U6启动子驱

动客户特异gRNA表达的表达元件。可直接用

于细胞转染，一对质粒可实现基因敲除。

S-005G pYSY-U6-gRNA-EF1a-eGFP 质粒含非洲爪蛙EF1a启动子驱动的绿色荧

光报告基因（eGFP）以及以人U6启动子驱动

客户特异sgRNA表达的表达元件。

S-005R pYSY-U6-gRNA-SV40-mCherry质粒含非洲爪蛙EF1a启动子驱动的红色荧

光报告基因（mCherry）以及以人U6启动子

驱动客户特异sgRNA表达的表达元件。

S-005Y pYSY-U6-gRNA-EF1a-eYFP 质粒含非洲爪蛙EF1a启动子驱动的黄色荧

光报告基因（eYFP）以及以人U6启动子驱动

客户特异sgRNA表达的表达元件。

S-005N pYSY-U6-gRNA-SV40-Neo质粒含SV40启动子驱动的Neo抗性基因表达

元件以及以人U6启动子驱动客户特异sgRNA

表达的表达元件。

S-006 pYSY-U6-gRNA 质粒含以人U6启动子驱动单个客户特异

sgRNA表达的表达元件。

S-007 pYSY-T7-Cas9-T7-gRNA 质粒含T7启动子驱动的人源化Cas9表达元

件DNA片段和T7启动子驱动的可表达客户特

异gRNA的表达元件。可用于体外转录Cas9

RNA和客户特异sgRNA，用于胚胎注射，制作

基因敲除突变体。

S-008 pYSY-T7-gRNA质粒含以T7启动子驱动客户特异sgRNA表达

的表达元件。可用于体外转录客户特异

sgRNA，用于胚胎注射。

二、活性检测服务

货号产品名称产品特征

S-101 哺乳动物细胞法CRISPR/Cas9活性检测按客户要求构建可用于哺乳动物细胞基因敲除的

CRISPR/Cas9三位一体(含Cas9、sgRNA和报告基因)

或二位一体（含Cas9和sgRNA）质粒，通过转染细

胞，检测细胞，检测目标基因敲除活性。

S-102 斑马鱼胚胎法CRISPR/Cas9活性检测按客户要求构建可用于哺乳动物细胞基因敲除的

CRISPR/Cas9三位一体(含Cas9、sgRNA和报告基因)

或二位一体（含Cas9和sgRNA）质粒，通过体外转

录合成Cas9和sgRNA，将RNA和客户目标基因片段

共同注射到斑马鱼受精卵内，待胚胎发育至24小时

后，扩增目标片段DNA，然后通过酶切或测序等方法

检测目标基因敲除活性。

三、斑马鱼基因基因敲除品系的建立

货号产品名称产品特征

S-201 斑马鱼基因敲除技术服务提供不少于两个无效等位基因的斑马鱼基因敲除

（KO）杂合突变体，时间为5-6个月。

联系我们

南京尧顺禹生物科技有限公司

地址：南京市浦口·顶山都市产业园2号楼

咨询电话：+86-189********; +86-025-********;

传真：+86-025-********

电子邮箱：njfish365@https://www.360docs.net/doc/9811213555.html,; DNA_Cas9@https://www.360docs.net/doc/9811213555.html,

网址：https://www.360docs.net/doc/9811213555.html,