新型金属卟啉光敏剂的合成及其抗肿瘤活性

第28卷第1期 武　汉　化　工　学　院　学　报 V o l .28　N o.12006年01月 J.　W uhan Inst .　Chem.　T ech. Jan.　2006

文章编号:10044736(2006)01000104

新型金属卟啉光敏剂的合成及其抗肿瘤活性

黄齐茂1,闻雪静1,谢小英1,胡　磊1,潘志权1,徐汉生2

(1.湖北省新型反应器与绿色化学工艺重点实验室,湖北武汉430074;

2.武汉大学化学与分子科学学院,湖北武汉430072)

摘　要:合成了新型Β取代卟啉光敏剂2氢醌5,10,15,20四(4羟基苯基)卟啉铜( )(Cu ( )P )和2氢醌5,10,15,20四(4羟基苯基)卟啉锌( )(Zn ( )P ),并初步研究其抗肿瘤活性.实验结果表明:

2氢醌5,10,15,20四(4羟基苯基)卟啉锌( )对慢性骨髓性白血病肿瘤细胞(K 562)具有很好的光敏毒

性,Zn ( )P 的浓度为320nmo l L 时,就能抑制90%以上的白血病肿瘤细胞的生长.关键词:光敏剂;金属卟啉;合成;抗肿瘤活性中图分类号:O 621.3 文献标识码:A

收稿日期:20050520

基金项目:国家自然科学基金(N o .20471045)

作者简介:黄齐茂(1974),男,湖北汉川人,讲师.研究方向:药物中间体、大环化合物及其生物活性.0　引　言

光动力治疗(Pho todynam ic T herapy ,PD T )作为一种新的治疗方法,在治疗肿瘤方面具有效果明显、副作用小、创伤康复快等优点[1].目前该疗法已用于多种癌症的治疗[2],它利用特定光敏剂对肿瘤或非正常组织的选择性光损伤而达到治疗目的[3].因此,光敏剂的合成及其对特定肿瘤细胞的光敏毒性是PD T 研究的关键.白血病(血癌)是一种造血组织的恶性疾病,特点是某一类型的白血病肿瘤细胞在骨髓或其他造血组织中肿瘤性增生,慢性骨髓性白血病是其中的一种.

本文合成了2氢醌5,10,15,20四(4羟基苯基)卟啉锌( )(Zn ( )P )、2氢醌5,10,15,20四(4羟基苯基)卟啉铜( )(Cu ( )P )两种新型Β取代多羟基金属卟啉,并对其在光照或不光照,以及不同光敏剂浓度的条件下对慢性骨髓性白血病肿瘤细胞K 562的体外抑制作用进行了比较.结果表明化合物Zn ( )P 对该肿瘤细胞具有很好的光敏毒性.这说明新型Β取代多羟

基金属卟啉的光敏毒性主要是由于光照下产生的单线态氧.生物活性测试结果表明Zn ( )P 在抗肿瘤光敏剂方面具有很好的应用前景.

1　实验部分

1.1　仪器与试剂

高压汞灯,西安教学仪器厂,450～800nm ,50W ;PH S 3C 型精密pH 计,上海精密科学仪器有限公司;二氧化碳恒温培养箱,美国Fo r m a Scien tific ;YJ

875型超净工作台,苏州净化设备

厂;I M T 2型倒置生物显微镜,日本O lym pu s .

肿瘤细胞株:慢性骨髓性白血病肿瘤细胞系

K 562肿瘤细胞在37℃、

5%CO 2及饱和湿度条件下,培养于含10%胎牛血清的R PM I 1640培养液中,由武汉大学医学院提供;R PM I 1640培养基,美国Gibco ;胰岛素、胰酶,上海化学试剂公司;胎牛血清,浙江省金华市清湖犊牛应用研究站.1.2　合成

Β氢醌多羟基卟啉Cu ( )P 和Zn ( )P 的合成路线如下

:

1.2.1　2硝基5,10,15,20四(4甲氧基苯基)卟啉(1a-1b)的制备　按参考文献[4]制备化合物1a和1b.

1.2.2　2硝基5,10,15,20四(4羟基苯基)卟啉(2a-2b)的合成　由化合物1a(1.0g,1.19 mm o l)按参考文献[5]脱甲基,再用硅胶作固定相,乙酸乙酯作淋洗剂,进行柱层析分离提纯,收集主要色带(第二带),用丙酮、环己烷混合溶剂重结晶,得0.7g紫色晶体2a,产率75%.UV vis (CH3OH)Κm ax:420,581,652nm.I R(KB r)Μ: 3394(OH),3054(A r C-H),1594,1444(A r), 1510,1342(NO2),1237,1169,1043(C-O), 1006(N-Cu)c m-1.M S(FAB)m z:785(M+).

A nal.calcd fo r C44H27N5O6Cu:C67.30,H3.47, N8.92;Found:C66.82,H3.35,N8.59.

2b的合成方法与2a类似,紫色晶体,产率及结构表征数据如下:

2b产率69%.UV vis(CH3OH)Κm ax:422, 518,554nm.1H NM R(300M H z,CD3COCD3)?: 9.3(5,10,15,20m eso A r-OH,4H),9.0～8.9(Β吡咯-H,7H),7.4～7.3(5,10,15,20 m eso A r-H,16H).I R(KB r)Μ:3396(OH), 1605,1430(A r),1513,1382(NO2),1262, 1167,1045(C-O),1002(N-Zn)c m-1.M S (FAB)m z:787(M+).A nal.calcd fo r C44H27N5O6Zn:C67.14,H3.46,N8.90;Found: C67.49,H3.75,N9.21.

1.2.3　2氢醌5,10,15,20四(4羟基苯基)卟啉(3a-3b)的合成　将100m g(0.13mm o l) 2a与10g对苯二酚混合均匀,加入到氩气保护的100mL锥形瓶中,瓶口用空心塞轻轻塞住,迅速置于240℃的油浴中,电磁搅拌约2h后,将空心塞换为冷凝管,趁热加入30mL热水,抽滤,用热水洗至滤液无色.余下的固体用乙酸乙酯溶解,无水氯化钙干燥,浓缩,用硅胶作固定相,乙酸乙酯作淋洗剂,柱层析分离,收集主带(第三带),浓缩蒸干,真空干燥得100m g(0.12mm o l)紫色晶体3a,产率93%.UV vis(CH3OH)Κm ax:417,517, 541nm.I R(KB r)Μ:3401(OH),1506,1441 (A r),1210,1173,(C-O),1003(N-N i)c m-1. M S(FAB)m z:848(M+).A nal.calcd fo r C50H32N4O6Cu:C70.79,H3.80,N6.60;Found: C70.32,H4.01,N6.97.

3b的合成方法与3a类似,紫色晶体,产率及选择结构表征数据如下:

3b产率86%.UV vis(CH3OH)Κm ax:426,548,589nm.1H NM R(300M H z,CD3COCD3)?: 8.9(10,15m eso A r-OH,2H),8.5(Β吡咯-H,6H),8.1～8.0(10,15m eso A r-H, 8H),7.9(5,20m eso A r-H,8H,3吡咯-H, 1H),7.3(26’-H,1H),7.2(23’-H,24’-H,2H),3.6～3.5(22’-OH,25’-OH,5,20 m eso A r-OH,4H);I R(KB r)Μ:3400(OH), 1608,1461(A r),1231,1171(C-O),1003 (N-Zn).M S(FAB)m z:850(M+).A nal. calcd fo r C50H32N4O6Zn:C70.63,H3.79,N6. 59;Found:C71.14,H3.42,N6.87.

1.3　光敏剂对慢性骨髓性白血病肿瘤细胞的抑

制作用

测试方法见参考文献[6].卟啉化合物分别配制成0.64×10-6m o l L、0.32×10-6m o l L、0.16×10-6m o l L、0.08×10-6m o l L的甲醇溶液,灭菌后待用.空白(新鲜培养液+甲醇溶剂)对照同时进行.

1.3.1　肿瘤细胞的分离和传代培养　将肿瘤细胞加入50mL培养瓶中,向每个培养瓶中添加含有20%小牛血清的R PM I1640(20%R PM I)8 mL,37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养,3天后倒置显微镜观察,1周后换液,以后每3天用20% R PM I换液1次.待原代培养的肿瘤细胞增殖到80%时,用0.25%牛胰蛋白酶消化肿瘤细胞使之成为单细胞悬液,以1×104 c m3接种于培养瓶,倒置显微镜下观察.

1.3.2　细胞株的培养及检测　将冻存的肿瘤细胞株解冻复苏后,置于二氧化碳培养箱,于37℃、5%二氧化碳、95%湿度条件下进行培养.待肿瘤细胞生长旺盛,即用0.25%的胰酶溶液消化,分瓶并扩大培养.将对数生长期的肿瘤细胞系用胰酶消化后收集肿瘤细胞悬液,以2%的台盼兰染液染色,计算活肿瘤细胞数,收集对数生长期的肿瘤细胞,调整肿瘤细胞数目至105个细胞 mL,按每孔0.5mL接种于24孔板,再加入0.5mL培养基进行培养.

1.3.3　选择对数生长期肿瘤细胞　用

2.5g L 胰酶消化,加入100mL L小牛血清1640培养液使之成为单细胞悬液,调整肿瘤细胞数目至104细胞 mL,悬浮于新鲜含10%胎牛血清的R PM I 1640培养液中,接种于24孔板中,每孔接种1 mL上述肿瘤细胞悬液,用血球计数板分别计数,取平均值,作为肿瘤细胞计数的基数(起始数).24孔板分两批3组;按照分组不同,分别加入:对照组(新鲜培养液+甲醇溶剂1mL),Zn( )P组

2武汉化工学院学报第28卷

(L 320:10%R PM I 1640+0.64×10-6m o l L

Zn ( )P 按1∶1比例配制,终浓度为0.32×10

-6

m o l L ;L 160:10%R PM I 1640+0.32×10-6

m o l L Zn ( )P 按1∶1比例配制,终浓度为0.16

×10-6m o l L ;L 80:10%R PM I 1640+0.16×

10-6m o l L Zn ( )P 按1∶1比例配制,终浓度为0.08×10-6m o l L ;L 40:10%R PM I 1640+0.08×10-6m o l L Zn ( )P 按1∶1比例配制,终浓度为0.04×10-6m o l L ),Cu ( )P 组(操作同前).样品作用后的肿瘤细胞悬液分别用高压汞灯光照30m in 和不光照,然后肿瘤细胞在37℃、

5%CO 2及饱和湿度条件下,恒温孵箱培养16h ,0.4%台盼兰染色,作肿瘤细胞计数,方法同前.绘

制生长曲线,照相观察肿瘤细胞形态及死亡变化

情况.

2　结果与讨论

2.1　光敏剂的抗肿瘤效果

不加光敏剂,用波长为400～800nm 的光照或不光照的空白对照表明,少量溶剂及光照对肿瘤细胞的存活率无明显影响.台盼兰染色的慢性白血病肿瘤细胞(

K 562)显微图片见图1.

图1　台盼兰染色的慢性白血病肿瘤细胞(K 562)显微图片

F ig .1　M icrographes of the hum an ch ronic m yelogenous leukem ia cells (K 562)stained w ith T rypanblau

图1(a )(空白对照,恒温孵箱培养16h ,高压汞灯照射30m in )中,细胞生长状态良好,形状规则,排列均匀致密.而在不同浓度光敏剂及相同光照强度的共同作用下,K 562肿瘤细胞存活率明显要低,细胞形变明显.由图1(b )(320nm o l L Zn ( )P 恒温孵箱培养16h ,高压汞灯照射30m in )可以看到只剩下不到图1(a )10%的细胞,且

细胞核膜皱褶,染色质凝集成块,细胞形状已很不规则.这一效果一方面可能是光敏剂的光动力效

应,即光敏剂在光照下产生的活性氧(R eactive O xygen Sp ecies ,RO S )导致肿瘤细胞坏死或凋

亡[7],另一方面也有可能是药物与肿瘤细胞的直接作用,究竟是光动力效应还是直接作用,可以通过比较不光照时对肿瘤细胞的抑制效果或直接通过与DNA 的作用结果来判断.图1(c )(160nm o l L Zn ( )P 恒温孵箱培养16h ,不光照)中细胞的存活率远比光照条件时高,细胞的形变也不太明显.这说明药物的暗毒性远低于药物的光毒性,也就是说,药物对肿瘤细胞的抑制作用,主要源于作用过程中的光敏效应,即药物的毒性来自于光动力过程中产生的活性氧.

图2是光照下不同浓度Zn ( )P 作用后,存活细胞数目图.由图2中可知:光敏剂浓度越大,存活细胞数目越小.这说明在相同光照条件下,光

敏剂浓度越大,其产生活性氧越多,对肿瘤细胞的

抑制和杀伤越明显,存活的肿瘤细胞就越少.

图2　不同浓度的Zn ( )P 光照下作用于K 562,成活

癌细胞的数目变化

F ig .2　Inactivati on of the hum an ch ronic m yelogenous

leukem ia cells (K 562)incubated w ith Zn ( )P in different concentrati on and irradiated w ith h igh p ressure m ercury

vapo r lamp

光敏剂产生活性氧有两种途径,即通常所说

PD T 中的T yp e 与T ype 机理[7]

,光照下,作为光敏剂的P (S 0)产生电子跃迁,变成激发态P (S 1),P (S 1)经过系间窜越,成为三线态的光敏剂P (T 1),P (T 1)进一步将能量传递给氧,生成非常活泼的单线态氧(1O 2),单线态氧与生物分子作

用,从而达到破坏肿瘤细胞的目的,这一过程为T yp e 机理,主要产生单线态氧;T ype 机理产

3

第1期黄齐茂等:新型金属卟啉光敏剂的合成及其抗肿瘤活性

生其他活性氧物种.Cu( )为顺磁性金属离子,会明显降低分子三线态寿命,进而使单线态氧产率降低[8].Cu( )P组的对照实验结果表明: Cu( )P的暗毒性及光毒性都比较低,光照下对慢性骨髓性白血病肿瘤细胞系K562细胞的抑制效果明显要比相应浓度的Zn( )P的效果差.这表明T yp e 机理为该Β氢醌多羟基卟啉PD T 的主要反应,即该光敏剂在光照下产生的活性氧物种主要应为单线态氧.

Zn( )P低至0.32×10-6m o l L仍然对慢性骨髓性白血病肿瘤K562细胞具有很好的抑制作用进一步表明其在光动力治疗上的应用前景.

3　结　语

对新型Β取代卟啉光敏剂2氢醌5,10, 15,20四(4羟基苯基)卟啉锌( )(Zn( )P)、2氢醌5,10,15,20四(4羟基苯基)卟啉铜( )(Cu( )P)的抗肿瘤活性初步研究结果表明,Zn( )P对慢性骨髓性白血病肿瘤细胞K562具有很好的体外抗肿瘤活性,10-7m o l L浓度就抑制了90%以上的肿瘤细胞K562的生长,由于单线态氧淬灭剂Cu( )抑制了光动力过程中单线态氧的产生,导致Cu( )P的光敏毒性较差;实验结果表明,2氢醌5,10,15,20四(4羟基苯基)卟啉锌( )(Zn( )P)在抗肿瘤光敏剂方面具有很好的应用前景.

致谢　感谢武汉大学应用生物化学实验室章晓联教授提供的实验条件和悉心指导.参考文献:

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18.

Syn theses and an titu m our activ ities of novel m eta lloporphyr i n s

a s tu m our photosen sitizers

HUAN G Q i m ao1,W EN X ue j ing1,X ie X iao ying1,H u L ei1,PAN Zh i quan1,XU H an sheng2

(1.H ubei Key L ab of N ovel R eacto r&Green Chem ical T echno logy,W uhan430074,Ch ina;

2.Co llege of Chem istry&M o lecular Sciences,W uhan U niversity,W uhan430072,Ch ina)

Abstract:2(H ydroqu inon2yl)5,10,15,20tetra(4hydroxylphenyl)po rphyrinato zinc( ) (Zn( )P)and2(hydroqu inon2yl)5,10,15,20tetra(4hydroxylphenyl)po rphyrinato copp er ( )(Cu( )P)w ere syn thesized and their an titum o r activities w ere p reli m inarily studied.T he resu lts show ed that Zn( )P had h igh an titum o r activity(in vitro)tow ards hum an ch ron ic m yelogenou s leukem ia cells(K562),and m o re than90%hum an ch ron ic m yelogenou s leukem ia cells w ere an tib lastic w h ile the concen trati on of Zn( )P w as320nm o l L.

Key words:pho to sen sitizer;m etallopo rphyrin;syn thesis;an titum o r activity

本文编辑:传一点4武汉化工学院学报第28卷