胆固醇结石病人使用熊去氧胆酸疗法的体外胆囊收缩性疗效评价

胆固醇结石病人使用熊去氧胆酸疗法的体外胆囊收缩性疗

效评价

BERT J.M. VAN DE HEIJNING, PhD, PAUL C. VAN DE MEEBERG, MD, PhD,

PIERO PORTINCASA, MD, PhD, HELEEN DOORNEWAARD, MD, FRANK J.P. HOEBERS, MD, KAREL J. VAN ERPECUM, MD, PhD, and GERARD P. VANBERGE-HENEGOUWEN, MD, PhD

熊去氧胆酸(UDCA)治疗期间，禁食胆囊体积会增加，机制尚未知。本研究在体外测试接受UDCA治疗后人类胆囊收缩性是否对乙酰胆碱和缩胆囊素响应。从15例在手术前三个星期使用UDCA(10mg/kg/天)治疗的患者和15例未治疗的患者取得胆囊组织。数据与在体收缩，胆汁成分，胆囊壁炎症相关联。治疗组的炎症分数更低。UDCA治疗可以增强体外胆囊收缩性：乙酰胆碱和缩胆囊素的剂量反应曲线都转移到左边，最大收缩应力产生在缩胆囊素较高的治疗组，而乙酰胆碱引起的最大应力并未增加。最大缩胆囊素诱导应力与禁食胆囊体积呈正相关，与胆汁胆固醇饱和指数呈负相关，但不与疏水性胆盐或胆囊壁炎症评分相关。总之，UDCA疗发可以提高体外胆囊收缩性，可能减少胆汁胆固醇的饱和相关。UDCA疗发会在禁食期间增加胆囊体积，而不源于降低胆囊肌肉收缩强度。

关键词：熊去氧胆酸；胆囊的能动性；张力测量学；胆结石；缩胆囊素；胆汁成分

熊去氧胆酸(UDCA)治疗期间，无论是在胆石患者和正常对照组禁食和残余胆囊体积都有所增加(1-5)。这一现象的机理尚不清楚。也有人提出增加表达十二指肠内的胆盐缩胆囊素(CCK)释放(6、7)。然而，UDCA治疗期间胆固醇胆石患者和正常受试者基底或餐刺激都没有观察到CCK水平的改变(1、8)。初步报告显示，向培养基中添加胆盐可能直接影响体外胆囊收缩性。疏水性胆盐和UDCA都具有这种抑制效应(9-12)。增加胆盐饮食对体外胆囊收缩性的影响，已出版的只有两个初步报告：在地面松鼠的胆固醇浓缩饮食中添加UDCA的体外胆囊收缩性，结果CCK的响应强烈受损(13)，类似的效果被发现在豚鼠与疏水性胆盐牛磺胆酸盐间(14)。UDCA治疗对体外人胆囊收缩性的效果尚不清楚。

胆结石患者与胆红素结石的患者相比体外胆囊收缩性减少，它可能会在胆囊平滑肌功能上显示一个胆汁中胆固醇过饱的抑制效应的(15、16)。因为UDCA治疗减少了胆汁胆固醇饱和，研究者会进一步提高该功效而不是降低体外胆囊收缩性。本研究旨在评估UDCA治疗对人胆结石患者体外胆囊收缩性和胆汁成分的效果。

材料和方法

患者和协议

从我们的门诊招募有胆石症状患者作为受试者。因为胆红素结石和胆固醇结石患者体外胆囊运动性不同，所有不透射线的结石患者都被排除在外(16)。也排除了怀孕妇女和糖尿病患者、肝脏疾病、胃肠道手术史或胆囊炎、胆囊壁增厚患者(> 3毫米)、胆管扩张或腹部超声估计结石体积>30%。因为可能会影响胆囊能动性，允许没有其他药物治疗。三十个受试者被分配到手术前三到四个星期UDCA治疗组(10mg/kg/天，随餐两剂，优思弗，Tramedico，荷兰)(N = 15)和未治疗组(N = 15)。治疗组患者在胆囊切除术前夜服用最后一剂优思弗。病人的特点见表1。

表1 患者特点和胆道分析(平均值±SEM)

UDCA治疗组(N=15) 对照组（N=15）

年龄(年，范围) 45.5±3.3(23- 69) 40.4±3.8 (19-66)

男女比例2/13 2/13

身体质量指数(kg/m2) 25.16±1.6 26.16±1.3

炎症评分* 11.36±0.8 13.96±0.9a****

结石(N)：单一/多个5/10 4/11

浓缩的总胆脂质(g/dl) 7.96±0.6 9.56±0.9

胆固醇饱和指数(CSI)** 74.46±4.3 141.56±13.3b

疏水性指数*** -0.036±0.03 0.336±0.02c

UDCA (%总胆盐中的百分比) 49.26±3.2 1.76±0.6c

* 根据Nahrwold计算(24).

** 根据Carey计算(19).

*** 根据He uman 计算(21).

**** a，P<0.05；b，P <0.01；c，P <0.001。

大部分的未治疗组病人(N = 12)同意进行体内胆囊能动性超声分析；10例治疗组的分析可以取两次：UDCA治疗之前和之后。使用胆囊平滑肌条研究体外胆囊收缩张力测量学。实验室的研究人员(B.J.M.v.d.H., H.D., F.J.P.H., P.P.)将实验安排为患者接受具体治疗的盲法实验。对胆汁成分(胆固醇、磷脂和胆盐浓度和胆盐种类)和结石组成(胆固醇含量)进行了研究，胆囊切除术时取得了实验材料。

总胆脂质浓度的≥5 g/dl证明了所有患者胆囊功能没有胆囊管梗阻。经过胆囊炎症组织学评价。该协议由当地伦理委员会批准，所有患者知情同意。

胆汁分析。胆囊切除术后获得的胆汁和胆结石被立即转移到实验室进行分析。使用比色测定(Monotest，勃林格曼海姆，德国曼海姆)分析了胆结石的胆固醇含量(干重)。只有胆固醇结石患者在研究之列，经统计至少含有70%。Bligh和Dyer提取胆汁(2毫升)(17)。提取胆固醇和磷脂比色法测量(分别使用Monotest，勃林格曼海姆；SopaChem磷脂，Sopar生物化学，比利时布鲁塞尔)。Turley和Dietschy使用3α-羟基类固醇脱氢酶衡量总胆汁中总胆盐浓度(18)。Carey根据这些数据计算胆固醇饱和指数(CSI)(19)。通过胆固醇、磷脂和总胆盐和计算总脂质浓度，单位为克每分升。

通过等度的高效液相色谱法确定整个胆汁中共轭胆汁盐种类在Waters Bondapak c-18 5μm柱，使用甲醇磷酸盐(75/25%)缓冲液作为溶剂，pH值5.2，流速1ml/min，200nm波长检测(20)。Heuman计算了胆盐疏水性指数(21)。

在体胆囊能动性。餐后胆囊排空是研究在受试者摄入混合粉(2815 kJ，35克脂肪)后隔夜禁食2小时，在其他地方进行了详细描述(22)。

胆囊条的张力测量学。切除胆囊后立即将一块胆囊壁从主体剥离放入盘中加Krebs-Henseleit溶液（mM）：118 NaCl，4.69 KCl，2.51 CaCl2，25 NaHCO3，1.18 KH2PO4，1.18 MgSO4和5.55葡萄糖。通过钝性解剖温和去除后浆膜，准备出四个平行肌条(0.3×1.75厘米)。肌条是安放在一个10ml器官浴含有预热的(37°C)和连续曝气(95% O2/5%CO2)的Krebs-Henseleit方案(pH值7.4)中。一端固定在器官浴另一端连接到一个等距测力传感器(Radnoti玻璃技术有限公司，加州蒙罗维亚市)。每条都被延伸到初始张力10 mN(即1 g)。

经过60分钟平衡期，将肌条置于次最大浓度的乙酰胆碱浴中(乙酰胆碱；10-5M浓度)来检查组织生存能力和响应再现性。每次接触乙酰胆碱(西格玛公司，圣.路易,密苏里州)，

Krebs-Henseleit方案已更新，允许肌条回到基线张力后下次注射于Ach浴。一旦一个稳定的反应实现，评估乙酰胆碱(10-8-10-3 M)的剂量反应曲线就确定了，累积剂量响应曲线CCK(八肽胆囊收缩素，Sigma) 10-12-10-6M。也随之确定。在实验结束时，吸干肌条的重量也确定了。

每个病人和每个病人组肌条收缩反应分析：剂量反应曲线的均值可以构建乙酰胆碱和CCK。等距力量被规范化为肌条横截面积上的肌肉压力，单位(牛顿/平方厘米)(23)。假定一个组织的密度为1.05克/立方厘米，通过重量和长度计算肌带的横截面积。

最大力时每个肌肉带对乙酰胆碱或CCK的回应是用来计算一个病人平均的“最大压力”。通过表达压力回应获得了一个特定的受体激动剂剂量的百分比最大应力（100%），半数有效量(ED50)。

在某些少于4条情况下，可以制备得到的外科标本；两个UDCA治疗的病人，只有CCK 进行了测试是错误的。

组织学分析。其余的胆囊被固定在甲醛(4%)中。使用光学显微镜研究了保留的部分(苏木精和伊红)，病人或治疗过程未告知。Nahrwold 等做了一个数值评分(最低0，最高84)用来量化程度，其中包括两个粘膜炎症参数、肌层和浆膜、炎症（24）。

统计学的提卡分析。结果表示为平均值±SEM。使用成对和未配对t测试或Wilcoxon的等级和测试分析数据。变量之间的相关性进行了线性回归分析。卡方测试是用于定性变量之间的比较。病人只能获得体外数据不包括在体外-体内相关性分析。统计学意义是定义为一个双尾概率不到5%(P<0.05)。

结果

病人特点和胆汁成分。治疗组和对照组患者可比对年龄、性别、体重指数和胆石成分(表1)。结石分析发现所有的干重胆固醇含量> 70%，确认没有包括胆红素结石患者的结石。所有病人的浓缩胆汁(总胆脂质浓度≥5g/dl)治疗组和对照组没有显著差异.治疗组CSI指数较低(74.4±4.3 vs 141.5±13.3, P<0.01)。U DCA成为治疗患者的主要胆盐，从24.5到60.1%，显示良好的合规治疗。因此，治疗过的患者胆盐疏水性指数较低(-0.03±0.03 vs 0.33±0.02, P <0.001) 。

组织学分析。两组组织学分析显示胆囊有小炎症(表1)。治疗组较对照组患者炎症分数低(11.3±0.8 vs 13.9±0.9, P <0.05)。线性回归分析显示胆汁胆固醇浓度(CSI)和胆囊发炎之间的正向关系(r=0.58, P =0.005)。没有发现胆囊炎症和胆汁盐疏水性指数之间显著相关性(r =0.35, P =NS)。

体内收缩性。基础禁食和残余胆囊体积我们作为二层组比较。在UDCA治疗组，意味着禁食的体积增加从27.0±3.6到42.7±6.5 ml (N=10, P<0.05)，相对排空保持不变(62 vs 65%)。整体(N = 22)发现胆囊炎症和禁食之间负相关(r = -0.51,P = 0.015)，或绝对胆囊排空(r = -0.57,P = 0.005)。

乙酰胆碱(M) 胆囊收缩素(M)

图1. 使用UDCA 治疗(UDCA 组)和没有接受治疗(对照组)的胆石症患者使用乙酰胆碱(Ach ，左)或胆囊收缩素(CCK ，右)后胆囊平滑肌条收缩应力的剂量反应曲线。数据点代表均值±SEM(误差线)，所有数据的测试都在同一组。乙酰胆碱，对照组(N=57)和UDCA 组(N=50)；CCK ，对照组(N=50)和UDCA 组(N=60)。* P<0.05；** P<0.02；*** P<0.01。

体外收缩性。在对乙酰胆碱和CCK 胆囊平滑肌条收缩反应有一个很大的个体间的变异差异。然而，如图1，在UDCA 治疗的剂量反应曲线对于乙酰胆碱和CCK 被转移到左边。UDCA 治疗病人的胆囊组织对几乎所有剂量测试的受体激动剂都更敏感；然而，CCK 的情况下ED50剂量(半数有效量达到最大收缩)是从16.7到10.2(P < 0.01;图2)大大降低了。乙酰胆碱的ED50值不受影响：治疗组和对照组分别为3.6和4.0。

图2. UDCA 治疗(UDCA 组)和未治疗(对照组)的胆石患者胆囊平滑肌条暴露于 (乙酰胆碱,左面板)或缩胆囊素(CCK,右面板)，其最大响应剂量的50%(ED 50)如图(注意区分ED 50单位) 。一个点代表一个病人的ED 50。水平线为平均值。* P<0.01。

图3. UDCA 治疗(UDCA 组)和未治疗(对照组)的胆石患者胆囊平滑肌条暴露于 (乙酰胆碱,左面板)或缩胆囊素(CCK,右面板)，其最大收缩应力如图。一个点代表一个病人的ED 50。水平线为平均值。* P<0.01。

1μM CCK(最大剂量应用)的压力回应，如图3所示治疗组肌条显著高于对照组(分别平均为 1.39 vs 0.87 N/cm2；P<0.05)。应对次最大剂量的0.1μM 乙酰胆碱的最大应力治疗组更高但没有显著性不同。

CCK 诱导相关最大压力与整组病人的CSI 指数是成反比的(r=-0.53, P=0.006)。在两个亚组发现一个类似的趋势（治疗组：r=-0.38，P=0.23；对照组：r =-0.42，P=0.15）。体外胆UDCA 组

对照组

囊运动性参数与UDCA的比例、胆盐疏水性指数或胆囊壁炎症评分没有显著相关性。

只有在整个组患者空腹胆囊容积积极关联了与最大CCK诱导应力(r=0.56, P =0.007) ，但是没有关联CCK ED50剂量。绝对的胆囊排空(mm)与最大CCK诱导应力(r = 0.59,P = 0.004)正相关和与CCK ED50剂量(r = -0.47,P = 0.025)负相关。

讨论

我们发现UDCA治疗诱导增加空腹胆囊容积(1-5)，符合之前的研究。增强胆囊疏散陪同禁食体积的增加，从而确保餐后胆囊排空不变，相对约65%。这证明了研究中的患者包括有足够的胆囊收缩样本。

目前的研究是第一个评估UDCA治疗体外胆囊收缩性的效果和胆囊肿大，显示UDCA治疗期间不是导致胆囊收缩性受损。相反，我们的数据表明UDCA治疗提高收缩胆囊平滑肌的潜力。对乙酰胆碱和CCK的剂量反应曲线都转移到左边(图1)，虽然产生最大应力反应两组相似，最大应力乙酰胆碱组高于CCK诱导治疗的患者(图3)。

如果乙酰胆碱的剂量反应曲线的胆囊收缩性平台剂量约0.1mM乙酰胆碱，从而真正接近最大应力。然而,在应用CCK的最高浓度(1μM)时曲线对数线性部分仍不平整；因此CCK 诱导最大应力指给最高剂量的受体激动剂时的应力测量(见图1和图3)。

唯一的一项其他研究报告了地松鼠使用UDCA预处理对体外胆囊收缩性的影响(13)。当喂食含富含UDCA1%的胆固醇饮食(10mg/kg)，发现cck引起体外胆囊张力的几率明显降低。有趣的是，鹅去氧胆酸被发现具有相反的效果，发现将胆盐添加到一个普通的(不是胆固醇浓缩)食物时没有效果。

类似的实验给几内亚猪喂牛磺胆酸盐浓缩(0.5%w/w)饮食五周显示对CCK10倍收缩阈值的增加，虽然在最高剂量测试CCK (0.1μm)的收缩反应与对照组没有不同(14)。牛磺胆酸盐喂动物时餐刺激释放CCK和胆囊壁CCK受体的数量都有所减少。本实验得出的结论是，在口服胆盐治疗时的收缩内在机制的敏感性不受损，但胆囊平滑肌细胞CCK下降，可能是由于在胆囊壁的CCK受体浓度降低。

胆结石在CCK受体发生过程中也提出了除了减少CCK受体密度、结构变化的可能性外还会引起的胆囊运动性损伤(25)。相反，本实验增加UDCA治疗胆结石患者的乙酰胆碱和CCK在改善胆囊收缩性体外反应。与先前的研究差异的几个因素都可以解释。

首先，上述分析都是使用健康动物研究，而本研究是在胆石患者身上进行的。第二，动物实验中胆盐摄入的量未知，因为他们被喂的是混合物。本研究病人接受固定剂量的UDCA 的日常治疗，是更亲水和更少的细胞毒性胆盐。第三，各种胆盐(UDCA，牛磺胆酸盐，CDCA) 体内和体外对胆囊收缩性有不同的影响(10-14)。第四，胆汁胆固醇分泌和胆固醇饱和度是可耐受口服胆盐摄入量，有胆盐种类依赖性，这可能对胆囊能动性有关键影响。关于这一点, 长期摄入CDCA或UDCA已确证可以减少胆汁胆固醇分泌而不是牛磺胆酸盐。此外，经UDCA 治疗从肠道开始总胆固醇吸收(膳食和胆道起源)明显减少(26)。

事实上我们发现，UDCA治疗患者的胆汁CSI低于对照组(表1)。此外，胆汁胆固醇改变胆囊收缩性，发现总体CSI和CCK诱导最大肌肉压力呈逆相关也支持了这种假说。Behar等人（16）发现体外胆固醇胆石患者对比胆红素结石患者的胆囊收缩性减弱，推测少量的胆固醇通过黏膜扩散可能会导致胆固醇在平滑肌细胞上更大的整合。这可能导致高胆固醇性膜硬化：如肌纤维膜。体外胆固醇富集从胆汁脂质载体转移到胆囊上皮细胞，而胆盐富集是一个先决条件,这些最近都已得到证实(27)。疏水性的胆盐决定胆固醇交换的有效性，但即使非常亲水种类如牛磺酸熊去氧胆酸也会通过胆固醇流入细胞。使用胆固醇性结石病动物进一步的证明受损的胆囊收缩性肌纤维膜位点(28)：地松鼠喂高胆固醇饮食显示体外受体激动剂反

应使胆囊收缩性降低，通过膜受体激活启动收缩(如CCK)或膜去极化(如80mMK+)诱导收缩反应，容易分散的肌纤维膜膜(如钡)各位点开始收缩提高胞质自由钙。这些实验表明，胆结石患者的平滑肌缺陷主要位于肌纤维膜而不通过在胞内信号转导途径或伸缩装置。

有了这些数据支持强有力我们可以的推测UDCA治疗可以改善胆汁胆固醇分泌降低胆囊收缩性使之饱和(即CSI)的假设。在UDCA治疗患者发现胆囊炎症评分的较低(表1)。UDCA 也能减少胆囊炎症吗? Klinkspoor 等人(30)研究显示只有通过疏水胆盐胆囊才能加速粘蛋白分泌到体外。一个体内研究表明，与疏水性高胆盐结合胆固醇过饱和会增加通过胆囊壁分泌免疫球蛋白G和粘蛋白(31)。我们的研究发现胆汁蛋白浓度与CSI呈正相关,但不与疏水性胆盐相关(32)。在目前的研究中发现胆囊炎症分数和胆汁胆固醇浓度之间的只有一个正相关性被证实。这些发现表明，胆汁胆固醇饱和而疏水性非胆盐能影响胆囊发炎。

从我们的数据不能得出UDCA对胆囊炎症的发挥其有益效果的机制。然而，由于降低胆固醇饱和度从而减少胆囊胆固醇吸收及UDCA浓缩本身就是一个有吸引力的假说。因为没有发现炎症分数和体外活性参数之间的明确的关系，主要两组之间胆囊炎症的不同程度的影响也无法评定。因为我们没有发现体外胆囊收缩信号的降低，UDCA一定有机制推动体内胆囊体积的增加。已证实胆盐能产生负反馈调节释放CCK和收缩胆囊(6、7、33、34)。然而,无论是我们的研究发现还是其他证据都提示使用UDCA长期治疗能造成CCK的释放减弱(1、8)。

尽管几篇报道显示疏水胆盐对体外胆囊收缩性的直接抑制效应(9-12)，UDCA的影响是有争议的。UDCA作用于豚鼠胆囊显示出降低肌肉压力和降低肌球蛋白轻链磷酸化的剂量依赖性(11)。其他研究也使用豚鼠胆囊，发现对胆囊收缩性的直接损伤取决于疏水性的胆盐种类(12)。只有在非常高剂量(0.5mM)时UDCA能抑制胆囊收缩性，而治疗前UDCA可以抑制脱氧胆酸预防胆囊收缩。我们自己的组织在人类胆囊平滑肌制剂上也发现了类似的结果(10)。先前的胆盐绑定树脂消胆胺的研究显示胆囊体积与胆盐池的大小有关(34、35)。在胆盐疗法中胆囊体积增大可能是由于胆盐池增加导致总胆脂质质量的增加(36-38)。

总之，本研究表明，使用UDCA治疗可能都经由降低胆道CSI增加体外胆囊收缩性，减少发。UDCA治疗期间观察胆囊体积的增加并不源于胆囊肌收缩强度的降低。

致谢