Quantity One使用详解

Quantity One 使用详解
1 - 内容简介
凝胶电泳是每个做分子生物学的同学天天都要打交道的基本技术。 电泳之后的信息处理与电泳本 身 同 样 重 要 。 目 前 有 大 量 软 件 可 以 用 于 分 析 电 泳结 果 ， 比 较 有 名 的 比 如 BandScan 、 BandLeader、Sigma Gel 等等。今天要向大家介绍的是来自 Bio-Rad 的 1D 凝胶定量软件 Quantity One（Bio-Rad 还有一个做 2D 凝胶分析的软件 PDQuest）。这个软件的最新版本 可以在 Bio-Rad 的主页免费下载。目前的最新版本是 4.52 版
2 - Quantity One 的定量方法
Quantity One 的分析功能顾名思义主要用来进行凝胶或者培养皿的荧光定量分析。 它的分析功 能或者说分析方式主要有 4 种：泳道/条带轨迹定量法；等高线直接定量法；菌落计数；分子量 测定 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------这三种方法中使用最为方便也是最为广泛的应该是等高线定量法（Volumn Contour）。它通 过半自动描绘电泳条带的等高线边缘来得到等高线区域内部面积， 再将该面积乘以区域内平均光 密度值得到条带内部总的信号量。 当然这种分析方法的弊病显而易见： 无法同等得排除不同泳道 的背景亮度；等高线的绘制处于“半自动”状态，即需要人为判断作为等高线标准的电泳条带的边 缘； 最致命的是在几个电泳条带距离十分接近的时候几乎无法绘制单一条带的轮廓 （常出现连续 的几个条带等高线相连而无法分离出单独条带的轮廓）。

三种方法中个人感觉最为科学和严谨的应该是泳道/条带轨迹定量法（Trace Tracking）。这种 方法使用起来步骤较为繁琐， 必须通过泳道识别---电泳条带识别两个连续的步骤才能进行定量。 然而这种方式的最大优点在于它可以完全抛弃人为主观因素进行全自动定量。他的定量方式为： 首先根据不同电泳条带的光密度值绘制光密度曲线， 然后计算光密度曲线下面积作为电泳条带的 定量根据。 大家可能会问他能不能排除泳道背景？答案是肯定的， 它能够最大程度的排除不同泳 道之间的背景差异， 让各个泳道上的不同电泳条带在一条几乎相同的起跑线上进行对比。 这个背 景排除功能是等高线法无法做到的（等高线法也有基本的背景排除办法，但是和泳道/条带轨迹 定量法的背景排除不是一个等级的。 等高线法只能排除同一泳道上的背景， 而不能均等的排除不 同泳道的背景）。另外泳道/条带轨迹定量法还可以结合 Gauss Model Bands 对紧密相连的电 泳条带进行分析，而这种条带也是等高线法无法分析的。我们此次重点学习这个方法。 第三个分析功能是菌落计数（Colony Counting）。这个功能其实很实用，可以分析蓝白筛选 的结果。但是很奇怪我的电脑居然无法运行这个功能， 因此无法向大家介绍了。 另外 Quantity One 还可以通过回归曲线测定分子量。
3 - Quantity One 的基本常用菜单操作
下面让我们了解一下 Quantity One 常用的基本菜单操作。 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------打开文件：由于 Quantity One 是 Bio-Rad 的硬件配套软件，因此 Quantity One 可以自动输 入来自 Bio-Rad 公司的凝胶分析仪的数据。具体支持哪些硬件大家可以在 “Edit-Preference-Imagers”里面设置。如果您的实验室没有采用 Bio-Rad 的硬件设施也没关 系。 您只要将电泳图片用 ACDSee 等程序转换为 TIF 图片格式就可以被 Quantity One 识别了。 注意 Quantity One 只支持 8 位和 16 位灰度的 TIF 文件。

Quantity One 似乎有一个小 bug，就是在按“Open”之后并没有立刻弹出资源管理器让你选择 目标文件的位置。其实你只要将鼠标在屏幕右下方点击一下，资源管理器就会乖乖弹出来了.
Quantity One 只能分析白色背景+黑色条带的电泳图。而我们正常情况下得到的一般都是黑色 背景+白色条带的电泳图。我们可以在“Image-Invert data 中将图片色彩进行反转，然后便可 以用 Quantity One 进行分析了.
文字注释：Quantity One 提供基本的文字注释功能。您可以在您的电泳图片上记录您的分析结 果比如电泳条带的分子量、光密度值、物质的量等等。这个功能可以通过“Edit-Text Overlay Tools”来实现。在弹出的浮动工具栏中选择“ABC”或者“”就可以进行文字输入和画标记线的操 作。
光密度工具：在“View-Plot Density”的下级菜单中大家会见到几个和电泳条带光密度值相关的 显示选项。 大家可以分别选择不同的选项感受一下它们之间的差别。 选择方法是点击相应的下级 菜单比如“Plot Cross Section”， 然后将变成带一个蓝色感叹号的鼠标移到您想知道光密度的位 置， 点击一下就会显示该处的光密度相关信息。 在下面这幅图片中我们可以看见两条黄线交叉处 的电泳条带的相关信息。 上方的一串曲线是不同泳道之间在同一水平线上的光密度比值曲线； 左 边是黄线交叉处所在泳道的几个电泳条带的光密度分布情况。

3D Viewer：在“View-3D Viewer”菜单中大家会看到一个有趣的功能叫做 3D Viewer。这个 玩意按照 Bio-Rad 的说法可以辅助辨别几条紧密相连在一起的电泳条带的分布情况。大家只要 选择了这个命令后鼠标就会一个“+”型，然后将+型移动到您感兴趣的位置，拖动鼠标画出一个 正方形区域，然后用鼠标双击，Quantity One 就会将这块区域按照 gauss 分布规律渲染成一 个三维模型，颇有意思。但个人感觉这个功能噱头多于实用。

4 - Quantity One 的基本背景排除功能
最开始的时候我们就说过 Quantity One 的等高线定量模式也有一种比较基本的背景排除方法。 这个方法同样也适用于泳道/条带定量模式。现在我们就来学习这个方法。基本背景排除的功能 位于“Image-Substract backgroud...”和“Image-Filter Wizard...”这两个菜单。 --------------------------------------------------------------------------------------------Image-Filter Wizard： 这个功能是对原始图片做一些初步的加工， 主要是除去一些图片上的“斑 点”。这些斑点主要有两种类型：一种是深色的“胡椒面”型和浅色的“食盐”型，两种斑点都可以 毫不犹豫地去除。从“Image-Filter Wizard...”菜单调出向导菜单后选择“pepper”和“salt”， 下面两个选项可以按照程序默认的选项，然后“OK”就可以完成这第一步的降噪过程。

Image-Substract backgroud：这个功能是真正对图片背景进行清理的工具（区别于 “Image-Filter Wizard...”的降噪模式）。只是这种清理是一种“全局”型的清理，即它以相同的 参数对每条泳道进行背景清理。然而在清理方式上它还是可以分成两种不同的方式： Backgroud Box：一种是以一个局部小面积为标准背景，将整张电泳图片上所有比该区域光密 度值低的区域全部漂白。这种发式称为“Backgroud Box”。操作时用鼠标选中对话框下部左侧 的“Backgroud Box”按钮，然后用鼠标在电泳图片上选择一块色彩接近于背景色，色泽比较均 匀的区域， 用鼠标拖动画出一个正方形。 释放鼠标后程序就会立即对电泳图片进行降低背景的处 理；

Backgroud Stripe：相对于“Backgroud Box”来说是一种更加智能化的处理方式。它特别适 用于梯度凝胶，即凝胶浓度由上至下依次变化。由于梯度胶的光密度值在一定距离内不断变化， 因此如果采用“Backgroud Box”的方法除背景就会发生偏差。Quantity One 此时提供一种随 着凝胶浓度变化而变化的除背景方式就是“Backgroud Stripe”。和“Backgroud Box”类似， 选择右下角的“Backgroud Stripe”按钮，然后用鼠标沿着电泳泳道拖放形成一个狭长的剪影带 （Stripe），这个剪影带内部的光密度值顺着泳道逐渐升高或降低。Quantity One 根据这个 Stripe 可以动态的对整张图片的背景进行剪影。 比如泳道起始处光密度低， 那么 Quantity One 在此处的剪影值也降低；随着 Stripe 向前延伸，光密度值逐渐升高，Quantity One 也同样不 断加大剪影的强度。这样一来就可以排除由于梯度胶带来的背景不一致的影响因素。

5 - Quantity One 的电泳泳道分析功能---创建泳道
前面说过 Quantity One 之所以强大是因为它具有的泳道/条带轨迹定量法。现在我们就来学习 一下如何在电泳图片上创建泳道（Lane）以及如何进行针对不同泳道的背景排除。 ---------------------------------------------------------------------------------------------------创建泳道： 首先打开我们要分析的电泳图片 （以蛋白质电泳为例） 。 然后选择“Lane-Auto Frame

lanes”。这时如果您的电泳图片比较标准的话， Quantity One 就会自动识别出每条电泳泳道的 位置，而且将各个泳道的路径用一条红线标画出来； 如果您对软件自动标记的泳道不甚满意，您可以通过“Lane-Edit Frame”下级各个子菜单提供 的功能对泳道框架位置、大小等进行调节。调节方法就是通过鼠标的拖放来实现，大家可以自己 体验一下； 如果您只需要分析其中几个泳道的数据而不想其他泳道的标记干扰您的视线，您可以通过 “Lane-Single Lane-Remove Lane”删除您不需要的泳道的标记。 不是所有的电泳图片的泳道都能够被 Quantity One 自动识别。在不能自动识别的情况下， Quantity One 就会弹出对话框告诉您它不能识别泳道。这时大家就需要手工绘制电泳泳道。方 法和上面一样，同过“Lane-Single Lane-Creat Lane”来实现。只要用鼠标在您的电泳图片上 顺着待标记的泳道的中轴线拖放就可以绘制出该泳道的标记红线.
6 - Quantity One 的电泳泳道分析功能---排除背景

前面说过 Quantity One 之所以强大是因为它具有的泳道/条带轨迹定量法。现在我们就来学习 一下如何在电泳图片上创建泳道（Lane）以及如何进行针对不同泳道的背景排除。 ------------------------------------------------------------------------------------------排除背景：首先请大家注意，这个排除背景和前面我们在“Image”菜单中使用的“Substruct Backgroud”有所不同。 后者排除背景的对象是整个电泳图片而非将各个电泳泳道的背景分别进 行排除。 现在我们要学习的这个命令可以帮助我们分别排除各个泳道 （也可以将全部泳道用相同 标准进行排除） 的不同的光密度背景。 这个功能对我们以后的分析影响甚大， 大家一定好好学习。 首先我们要将我们的电泳图片进行前面谈到的泳道识别， 不管是自动方式还是手工识别。 然后选 择“Lane-Lane Backgroud...”命令。选择该命令后，鼠标即变成一个绿色的“+”，将鼠标移到 您打算进行背景排除的泳道（比如下图中的第 4 泳道），点击左键一下，立刻就会弹出如下图 所示的对话框。

其中“Optical Density”显示得是该泳道光密度值的分布情况。大家会注意到这个分布曲线并不 是紧贴着纵轴， 而是位于纵轴上方分布。 造成这个“悬空现象”的原因就是该泳道自身存在着一定 的光密度“背景”。这个背景的存在导致该泳道上各个电泳条带之间不能处于同一水平进行对比； 如果考虑到相邻的其他泳道更是因为不同背景的存在而无法对比不同泳道上的不同电泳条带。 如 何去除这个背景呢？我们继续看右边的“Lane Backgroud Substruction”对话框。这个对话框 的上方“All Lanes”表示可以对所有泳道进行一次性处理；下方的“Selected Lane”表示仅针对 此次选中的这个泳道进行处理（我们选中的是第 4 泳道）。我们用鼠标选择“Selected Lane” 的“Lane On”选项。然后在下面的“Rolling Disk Size”里填上“5”，再按“回车”键。好！大家再 来看看现在“Optical Density”中出现了一条紧紧沿着光密度曲线分布的酱色曲线。这条曲线将 泳道的背景与电泳条带的光密度分布十分精确的划分开来。
大家可能会好奇这里的“Rolling Disk Size”指得是什么意思？我们可以将 Quantity One 提供 的去除背景功能想象成是一个滚动的小球。 如果这个小球的半径越小， 那么它沿着光密度曲线滚

动时滚过的路径就越发精细，具体反映在酱色曲线的轨迹越发靠近黑色光密度分布曲线的基线。 因此从理论上来说“Rolling Disk Size”的取值越小，它的去除背景效果越好。大家可以试着选 择一个较大的值比如 80，再来看看此时酱色曲线的轨迹。当然也不能取太小的值。因为如果取 值太小，大家可以想象这个十分微小的球就会滚入光密度曲线内部，造成有效阳性信号的损失。 个人感觉 5~20 是一个比较好的取值范围.
OK！我们再在“Lane Backgroud Substruction”对话框的最下方钩选“Show Lane Trace with Backgroud Substructed”，再来看看是不是泳道上所有的背景都被消除了？各个电泳条 带是不是完全结合到纵轴上在同一水平进行比较了？

我们对于其他泳道也可以依葫芦画瓢进行类似的背景排除工作。 如果大家觉得可以使用同样的标 准， 即相同的“Rolling Disk Size”进行排除， 那么我们可以在“Lane Backgroud Substruction” 对话框中选择上方的“All Lanes On(same level)”选项。然后在“Rolling Disk Size”中填上一 个合适的值，点击“Done”按钮确认就可以了。此时该电泳图片上所有的泳道都以相同的标准进 行了背景去除。不信你可以自己将鼠标点击其他泳道（比如第 8 道或第 1 道），你会发现所有 泳道的背景均已去除。

7 - Quantity One 的电泳泳道分析功能---对比泳道
刚才我们已经对电泳图片上的泳道进行了识别和背景去除。现在我们可以利用 Quantity One 提供的泳道对比功能对同一张凝胶照片上的不同泳道进行对比， 看看每条泳道上电泳条带的分布 情况。 ------------------------------------------------------------------------------------------泳道对比：首先将打开的电泳照片进行前面谈到的泳道识别和去除背景步骤。然后选择 “Lane-Compare Lanes”命令，鼠标变成“蓝色感叹号”之后将鼠标移动到您希望进行对比的泳 道上（比如下图的第 3 泳道），左键点击，Quantity One 就会立刻探出一张黑色背景的 “Compare Lanes”对话框。在这个对话框中红色的曲线代表您选择的泳道的光密度分布曲线。 曲线的波峰部分表示位于泳道上的不同电泳条带； 波峰的高低象征电泳条带光密度值的大小； 波 峰的宽窄象征电泳条带的宽度；波峰由左至右表示各个电泳条带顺着泳道由后向前的分布。
大家请注意这个红色曲线。 它不仅仅提供给我们关于泳道上光密度的分布情况， 更重要的是在下

一步我们对电泳条带进行定量的时候，我们将以每个波峰的曲线下面积作为定量的标准.
我们还可以用鼠标点击其他我们感兴趣的泳道（比如下图中第 6、9、14 泳道），这时再转到 “Compare Lanes”对话框我们会发现 Quantity One 已经帮我们用不同颜色在同一张图片上绘 制出了这 4 条泳道的对比图。是不是非常 PP？

8 - Quantity One 的电泳条带分析功能---创建条带
前面我们已经识别和分析了电泳图片的泳道， 下面我们开始研究电泳条带的问题。 首先在这里明 确两个名词翻译：“Lane”指电泳泳道；“Band”指电泳条带。在下文中一律使用这两个英文名词 来表示这两个意思。 ------------------------------------------------------------------------------------------电泳条带的识别：和前面研究 Lane 一样，首先我们要对 Lane 上的 Band 进行识别。识别方式 同样分为自动识别和人工识别。自动识别的时候选择“Band-Detect Bands...”命令。这时 Quantity One 会自动弹出一个“Detect Bands”的对话框（如下图）。 第一次用 Quantity One 的朋友可能会发现您的 Bands 识别以后仅仅是画出了一条红色的粗 线，而在上面的演示图片中却是上下括号的形式。其实大家可以在“Band-Band Attributes”选 项中设置 Bands 的显示形式。在下方的“Style”选项卡中选择“Brackets”就会将原来的粗线改 为括号形式了.

在上面的对话框中，我们可以指定识别的参数。 如果要自动识别所有 Lanes 上的 Bands 就钩选 Lands 后面的“All”选项；如果仅仅想自动识别 某一条 Lane 上的 Bands 就钩选“One”，然后在后面的输入框中填上您想识别的泳道号码； 如果仅仅想识别泳道上部分光密度值最强的 Bands，可以在“Bands”后面的选项中选择 “Limit”，然后填上相应的数目（比如 10）。Quantity One 就会仅识别该泳道上光密度最大的 10 条 Bands； 如果您发现自动识别的 Bands 宽度太窄，圈定 Band 的红色括号内范围小于黑色的光密度影。 此时可以使用“Lane Width”命令来调整 Bands 识别的宽度。用鼠标点击“Lane Width”后面的 向上箭头就会发现红色括号逐渐变宽，最后要求其范围略为宽过其包绕的 Band 影迹；
如果您发现自动识别功能没有识别您想要的 Band 或者误识别了您不想要的 Band， 您还可以使 用上面的工具栏进行调解。将您的鼠标指向每个图标，Quantity One 就会知道弹出一个黄色的 提示信息告诉您这个按钮的功能。在此不再继续阐述了。 9 - Quantity One 的电泳条带分析功能---高斯建模与结果分析 现在我们已经完成了泳道识别、背景去除、条带识别的任务。接下来我们要对 Bands 进行一些 处理，然后就可以进行最终的结果分析了。 -------------------------------------------------------------------------------高斯建模：大家学过统计学知识后都知道高斯（Gauss）分布是个什么意思，在此我就不多作 解释了。 Quantity One 认为一个理想状态的 Band 内部的光密度分布应该也服从高斯曲线的特 征，正如前面向大家展示的 3D Viewer 中的图片那样。在我们日常的电泳泳道中经常出现几个 相隔很近的 Bands（即分子量很接近的几个蛋白或者核酸）在泳道的某个区域成串出现。此时 我们很难通过会自等高线的办法精确的描绘出每条 Band 独立的轮廓。这个时候我们就需要对 这些拥挤在一起的 Bands 进行高斯建模处理。Quantity One 能够依据高斯曲线的特征，配合 有效的背景去除，将各条紧靠在一起、边界相互融合的 Bands 描绘成具有独立光密度分布的相 互重叠的曲线。如下图所示，原来相互融合的 22、23 两条 Bands 经过高斯建模之后变成了两 个具有独立分布曲线，相互重叠的 Bands。
高斯建模必须建立在有效的泳道背景去除之后。 背景去除的方法可以参见我们前面的方法， 即通 过“Lane-Lane Backgrouds”的方式进行去除背景。去除背景的时候最好选择 Rolling Disk Size 小一些的方案。这样背景去除后的光密度分布曲线和高斯建模后的光密度分布曲线才能比 较好的吻合。 另外高斯建模并不是一个必须的步骤。 它仅仅在出现多条 Bands 紧密排列在一起， 以至于无法分辨它们之间的间隔的时候才最有效。如果 Bands 在泳道上松散的分布则可以不使 用高斯建模.

那么如何进行高斯建模呢？很简单！只要执行“Band-Gauss Model Bands...”命令就可以，执 行后 Quantity One 回弹出一个对话框问您要对那条泳道进行高斯建模。请钩选“One”，然后 再输入需要建模的泳道代码就可以了（比如下图中的第 2 泳道）；如果选择了“All”则对所有泳 道进行高斯建模，当然建模这么多泳道会费一点时间了。
-------------------------------------------------------------------------------观察结果：执行完高斯建模以后使用“Band-Band Information”命令来观察结果。方法是将变 成蓝色惊叹号的鼠标移到刚才已经识别的 Band 的部位，一个详细的“Band Information”信息 框就会立刻弹出来（见下图）。在这幅图中我们必须注意的是“Trace”和/或“Gauss Model Trace”，因为我们刚才辛苦了半天就是为了得到这个数据。这个数据表示的就是 Band 光密度 分布曲线下面积，也就是 Quantity One 用来表达 Band 内分子总量的方式。在这个信息框中 还有一些重要信息比如“Mol Wt”（分子量）；“Quantity/Units”等现在还是空白，咱们下以后 的分析步骤中将逐渐填满它们。

Quantity One 有一点让人感到很不明白。它的“Trace”和“Gauss Model Trace”都是表示曲线 下面积的，可是使用的单位是 OD*mm；而在另外的等高线定量方法中，同样是表示某个区域 面积的单位却是 OD*mm2.
下面让我们回过头来看看高斯建模之后电泳图片的分析结果到底发生了什么变化。 首先是一张没 有进行高斯建模的图片，大家可以看到在这张图片中的白框部分，第 2 泳道的第 6 个 band 的 光密度曲线黄色部分并不呈高斯对称（少了一部分不是？）。这是因为它一部分和邻近的 Band 相互融合在一起了。

现在再来对比一下经过高斯建模后的电泳图片分析结果。还是在相同位置，这时代表第 2 泳道 第 6 个 Band 的黄色光密度曲线是不是呈完整的高斯对称了？而且后面的“Gauss Model Trace”也不再是“N.A”，而变成了“0.717 OD”，对比上面的“Trace”=0.693 OD，大家想想为 什么要大一些呢？