生物样品分析前处理技术

生物样品分析前处理技术

生物样品的前处理涉及很多方面，但主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题。1.样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型。例如，血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出，当原型药物排泄在尿中时，可简单地用水稀释一定倍数后进行测定。2.根据被测定药物的结构、理化及药理性质、存在形式、浓度范围等，采取相应的前处理方法。例如，药物的酸碱性（pka）、溶解性质涉及到药物的提取手段；是否具有挥发性涉及到能否采用气相色谱法测定；药物的光谱特性及官能团性质涉及到分析仪器的选择、能否制成衍生物及应用特殊检测器的可能性。药物在样品中的浓度相差很大，浓度大的样品，对前处理要求可稍低；浓度越低则样品前处理要求越高。此外，药物在体内常产生许多代谢产物，其中一些代谢物仍具有药理活性，需要与原型药分别测定，因而也要了解药物的药理学性质和药物动力学特性。3.样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同。即纯化程度与所用测定方法的专属性、分离能力、检测系统对不纯样品污染的耐受程度等密切相关。一般说来，放射免疫测定法由于具有较高的灵敏度和选择性，因此当初步除去主要干扰物质之后即可直接测定微量样品；而对灵敏度和专属性较差的紫外分光光度法，分离要求就要相应高一些；至于常用的高效液相色谱法，为防止蛋白质等杂质沉积在色谱柱上，上柱前需对生物样品进行去蛋白，有时对被测组分进行提取、制备衍生物等前处理。

样品处理步骤与分析方法的选择

(一）去除蛋白质

在测定血样时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使结合型的药物均出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污），延长使用期限。去除蛋白法有以下几种。

1.加入与水相混溶的有机溶剂加入水溶性的有机溶剂；可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1：（1～3）时，就可以将90％以上的蛋白质除去。水溶性有机溶剂的种类不同时，析出的蛋白质形状亦不同；并且所得上清液的pH值也稍有差别，如用乙腈或甲醇时，上清液pH为8.5～9.5，用乙醇或丙酮时，上清液pH为9～10。操作时，将水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后离心分离，取上清液作为样品。通常分离血浆或血清用的离心机（3000r/min）不能将蛋白质沉淀完全，而采用超速离心机（10000r／min）离心1～2min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。离心时应用超速离心机专用的具塞塑料尖底管，可使析出的蛋白质牢固地粘在管底，便于上清液的吸取。

2.加入中性盐加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。操作时，如按血清与饱和硫酸铵的比例为1：2，混合，离心（10000r/min）1～2min，即可除去90％以上的蛋白质。所得上清液的pH为7.0～7.7这种利用盐析的方法与有机溶剂提取法并用时，药物的回收率高，因而常常被采用。

3.加入强酸当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀。常用的强酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5％偏磷酸等。含药物血清与强酸的比例为1：0.6混合，离心〈10000r／min）1～2min，就可以除去90％以上的蛋白质。取上清液作为样品。因加入了强酸，上清液呈酸性（pH0～4），在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。过量的三氯醋酸可经煮沸，分解为氯仿和二氧化碳而被除去；也有用乙醚提取过量三氯醋酸的方法。过量的高氯酸可用碳酸钾、

醋酸钾、氢氧化钠等中和，然后加乙醇使产生的高氯酸钾（钠）沉淀而被除去。偏磷酸及硫酸-钨酸可用同法除去。

4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等。离心分离后所得的上清液pH分别为

5.7～7.3和

6.5～

7.5。

5.酶解法在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。它不仅可使组织酶，并可使药物析出。枯草菌溶素是一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽的pH活圈（PH7.0～11.0）内使蛋白质的肽键降解，在50～60℃具有最大活力。酶解法操作简便。先将待测组织加Tris-缓冲液（pH 10·5）及酶，60℃培育1h，用玻璃棉过滤，得澄清滤液，即可供药物提取用。酶解法的优点是：可避兔某些药物在酸及高温下降解：对与蛋白质结合牢的药物（如保泰松、苯妥英纳），可显著改善回收率；可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象生成，当采用HPLC法检测时，无需再进行过多的净化操作。酶解法的主要问题是不适用于在碱性下易水解的药物。

（二）缀合物的水解

尿中药物多数呈缀合状态。一些含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸甙缀合物；还有一些含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取。为了测定尿液中药物总量，无论是直接测定或萃取分离之前，都需要将缀合物中的药物释出。有些药物仅需较温和条件即可使药物游离，有些则需较剧烈的方法，常用酸水解或酶水解的方法。酸水解时，可加入适量的盐酸液。至于酸的用量和浓度、反应时间及温度等条件，随药物的不同而异，这些条件应通过实验来确定。对于遇酸及受热不稳定的药物，可以用酶水解法。常用葡萄糖醛酸甙酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸甙硫酸酯酶的混合酶。酶水解很少使被测药物或共存物发生降解。虽然酶水解的时间较常，以及由酶制剂带入的粘液蛋白可能导致乳化及色谱柱顶部阻塞的缺点，但仍被优先选用。

（三）分离、纯化与浓集

不管分析目的是什么，其选择性是相当重要的。这是因为内源性物质、代谢物或其它药物的干扰能影响分析结果。

对于大多数药物而言，生物样品的分析通常由两步组成：样品的前处理（分离、纯化、浓集）和对最终提取物的仪器分析。前处理是为了除去介质中含有的大量内源性物质等杂质，提取出低浓度的被测药物，同时浓集药物或代谢物的浓度，使其在所用分析技术的检测范围之内；分析的专属性也有部分取决于仪器分析这一步骤，但主要仍是样品的前处理。

提取法是应用最多的分离、纯化方法。提取的目的是为了从大量共存物中分离出所需要的微量组分----药物及其代谢物，并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集。提取法包括液-液提取法和液-固提取法。

1.液-液提取法（liquid-liquid extraction，LLE）

多数药物是亲脂性的，在适当的溶剂中的溶解度大于水相中的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后作为分析用样品。应用本法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH值等。对所选用的有机溶剂，要求对被测组分的溶解度大：沸点低，易于浓集、挥散；与水不相混溶以及无毒、化学稳定、不易乳化等。最常用的溶剂是乙醚和氯仿等。提取时所用的有机溶剂要适量。一般有机相与水相（体液样品）容积比为1：1或2：1。根据被测药物的性质及方法需要，可从实验中考察其用量与测定响应之间的关系，来确定有机溶剂的最佳用量。

PH的影响在溶剂提取中十分重要。水相的pH随药物的理化性质的不同而异，但生物

样品一般多在碱性下提取。这是因为多数药物是亲脂性的碱性物质，而生物样品中的内源性物质多是酸性的，一般不含脂溶性碱性物质，所以在碱性下用有机溶剂提取时内源性杂质不会被提取出来。曾有人将空白血清分别与pH2、pH7、及PH13的缓冲液混后用乙醚提取，提取液用RP-HPLC（UV-220nm检测）测定色谱图时（图），发现在碱性（pH13）下提取液的杂质峰最少，而在中性及酸性下杂质峰显著多而强。

当一些碱性药物在碱性pH不稳定时，则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取。而中性药物则在pH7附近提取（愚然它可在任一pH被提取）。提取时于水相（体液样品）中加入有机溶剂后，一般只提取一次。个别情况下（如杂质不易除去），则须将第二次提取分离出的含药有机相，再用一定pH的水溶液反提取（back extraction），然后再从水相将药物提取到有机相。

液-液提取法的优点在于它的选择性，这是依赖于有机溶剂的选择；药物能与多数内源性物质分离；而且在使用非专属性的光谱法分析时，这是一个很大的优点。例如，如果一个亲脂性药物的代谢程度很大，它的代谢物与母体化合物具有同样的发色团，这些代谢物将极大地干扰测试。但如果采用一亲脂性溶剂进行提取，该药物能被选择性地提取，而将相对极性大的代谢物留在生物体液中。如果是色谱法，则可利用亲水性溶剂提取药物和代谢物，从而达到分离并共同测定的目的。但是，液-液提取法并不是适用于所有化合物。例如，极性大的药物通常不能用该法提取，但使用离子对试剂，（ion pair reagent）的离子对提取法（impair extraction method），能够将液-液提取法的应用扩展到这类药物中。

液-液提取法的缺点在于乳化现象的产生。乳化作用能引起药物的损失，从而导致较低的回收率。，通常采用较大体积的提取用溶剂或温和的混合方法能克服乳化现象。如果采用相对于样品体积较大体积的溶剂进行提取，在后续步骤中，需将被测组分浓集。

２.液-固提取法（liquid-solid extration，LES）

液－固提取法是近十几年来在纯化生物样品时被广泛采用的方法。也可以认为是规模缩小的柱色谱法。这种方法是应用液相色谱法原理处理样品。将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱，以溶剂淋洗后，将生物样品通过，使其药物或杂质保留在担体上，用适当溶剂洗去杂质，再用适当溶剂将药物洗脱下来。

与LLE相比较，LES具有如下优点：LES较少引入杂质；消除了LIE的主要缺陷――乳化现象；提取效率高；可用少量生物样品进行分析（如50~100ul的血浆样品）；柱为可弃型，废弃物易从实验室移走；再最后洗脱中多采用以水为主的溶剂系统，大大增加了安全型；最大的优点为处理样品速度快、并在室温下操作，尤其适用于处理挥发性及对热不稳定药物。

常用于填充柱的担体大致分为两类：第一类为亲水性的硅藻土等，它可以捕集全部样品，即样品全部吸附在担体颗粒表面，形成一薄层，然后采用一种与水不相混溶的有机溶剂倾入柱中，即可分离药物。第二类常用疏水性的活性炭、聚苯乙烯或Ｃ18化学键硅胶等，它们可从样品中吸附亲脂性药物，然后用有机溶剂分离药物。如填充离子交换树脂，可用于高极性、能电离药物的分离。

在过去的十多年中，HPLC法色谱柱填充物的种类与数目迅速扩大，这给生物样品的液－固提取前处理法的发展带来了契机，各生产厂家制备出各种微型柱已在广泛地用作固体提取剂。其中有的供手工操作，也有供自动化设备的。

（１）液－固提取法的手工操作法：从市场上可得到含不同吸附剂的微型柱。如由美国Analytichem International公司生产的Bond Elut和由美国Waters公司生产的Sep-pak微型柱等，目前应用最广泛。

将样品溶解在适当的溶剂中，加到微型柱上端，在下端通过负压使溶剂流动，商品生产者已生产出“真空集合管”“自动离心式样品萃取器”等，能同时分析操作8～10个微型柱。也可以通过在微型柱的上端利用注射器达到正压或用离心的方法使溶剂流动。洗脱出的分析

样品在每一微型柱的正下方用试管收集。

微型柱使用的一般步骤：１：用有机溶剂如甲醇，预先湿润微型柱，使增加填料与待测物相互作用的表面积，并可除去可能干扰分析的填料残留物。２：用色谱纯的水或合适的溶剂冲洗，除去过多的甲醇，并为样品提供表面积。３：进样，通过微型柱废液弃去。４：用水或合适溶剂洗柱，选择性地除去将会干扰后面色谱分析的内源性杂质步骤用合适的溶剂洗脱样品，收集，洗脱液用于后面的分析测定或进一步研究。

Bond Elut微型柱采用各种极性、非极性硅胶键合填料，Sep－pak系列有C18硅胶、硅酸镁、氧化铝等四种填料。

（２）自动化液固提取法：

1983年出现了半自动样品制备系统（advanced automated sample processer,AASP，高级自动化样品处理机，Varian公司），使液－固提取法更加简便、快速。这种半自动样品制备系统能使被分析物从固定相洗脱。其制备方法包括：样品经过10个固定填充微柱的离线萃取后，填充微柱被转移到自动进样器作为预柱，其流动相可将被分析物洗脱至分析柱。此法分析物损失小且分析快速。但样品的制备和分析仍然是两个分开的过程。

AASP经过两条途径进行了进一步的自动化：一种是采用机器手，另一种是采用带有探头的自动进样器。机器手主要使人工的样品必理过程自动化。因为AASP的填充微柱必须被人工转移到也谱系统，故此法仍是离钱分析。第二种方法是自动进样器与AASＰ阀门的清洗接头处连接，从而实现了被分析物被自动洗脱到分析柱前、固相活化样品添加和填充微柱清洗的在线联用。

3.被测组分的浓集样品在提取过程中，虽然被测组分得到了纯化，但因微量的组分分布在较大体积（数毫升）的提取溶剂中，提取液往往还不能直接进行分析。一些分析方法如GC法和HPLC法等都受到进样量的限制，若将提取液直接注入仪器，被测组分量可能达不到检测灵敏度，因此，常需要使组分浓集后再进行测定。

浓集的方法主要有两种：一种方法是在末次提取时加入的提取液尽量少，使被测组分提取到小体积溶剂中，然后直接吸出适量供测定。另一种方法是挥去溶剂时应避免直接加热，防止被测组分破坏或挥失。挥去提取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干；对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物，可采用减压法挥去溶剂。溶剂蒸发所用的试管，底部应为尖锥型，这样可使最后数毫升溶剂集中在管尖，便于量取。

近年来，许多学者在研究工作中利用了柱切换技术，生物样品不用溶剂而直接进行分析。这时HPLC仪用来进行样品的制备（前处理）和分析，其色谱系统由一个预柱和一个分析柱组成。采用柱切换技术，在样品进入分析柱进行分离分析之前，将样品在预柱土进行痕量富集。样品进入预柱，预柱保留被测组分，而将杂质冲入废池，进一步冲洗预柱使样品更洁净，被测组分被反冲出预柱进入分析柱，用ＵＶ法、荧光法或电化学法进行最终定量。整个过程是自动化进行的，从开始进样直到数据、报告都由微处理器控制

这是一种连接柱的应用技术。即将液－固提取微型柱作为预柱与HPLC仪连接，增加一个泵，先将样品流经预柱，使起到纯化与富集作用，再经分析柱，能提高分析的灵敏度。采用此系列，预柱可被多次利用（如每次100ul血浆可注射150次）

（四）化学衍生化

分离前将药物进行化学衍生化的目的是：（１）使药物变成具有能被分离的性质；（２）提高检测灵敏度；（３）增强药物的稳定性；（４）提高对光学异构体分离的能力等。

药物分子中含有活泼Ｈ者均可被化学衍生化，如含有－COOH、－OH、NH２、－NH－、－SH等官能团的药物都可被衍生化。

化学衍生化对GC和HPLC尤为重要。

１.ＧＣ中化学衍生化法：药物的化学衍生化前处理对GC十分必要，衍生化可使药物分子中的极性基团，如羟基、氨基、羧基等变成无极性的、易于挥发的药物，从而使ＧＣ的温度不必很高即可适合GC的分析要求。主要的衍生化反应有烷基化（alkylations）、酰化（acrylations）、硅烷化（silylations）等。其中已硅烷化用得最广泛。常用的烷基化试剂有碘甲烷（CH1）、叠氮甲烷（CHN2）、氢氧化三甲基苯胺（TMAH）等；常用得酰化试剂有：乙酸酐、丙酸酐等；硅烷化试剂有：三甲基氯硅烷（TMCS）、双－三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、双－三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（IMTS）等。具有光学异构体的药物，由于R（-）与S（＋）构型不同，使之具有不同的药效和药动学特性，因此，异构体的分离也是十分重要的。分离光学异构体的方法之一，就是采用不对称试剂，使其生成非对映异构体衍生物，然后用GC法或HPLC法进行分析测定。常用的称试剂有：（Ｓ）－Ｎ－三氟乙酰脯胺酰氯、（Ｓ）－Ｎ－五氟乙酰脯胺酰氯等。

２.ＨＰＬＣ中化学衍生化法当采用HPLC法时，其衍生化的目的是为了提高药物的检测灵敏度。一些在紫外、可见光区没有吸收或者摩尔吸收系数小的药物，可以使其与衍生成对可见－紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等具有高灵敏度的衍生物。化学衍生化包括柱前衍生化和柱后衍生化两种方法。由于柱前衍生化法是在分离前使药物与衍生化试剂反应，故与药物具有相同官能团的杂质也会同样生成衍生，这样就有可能妨碍药物的检测。同时，如果杂质含量多时，药物与衍生化试剂的反应率降低，因此，应尽可能将药物进行精制后再衍生化。柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的，所以可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物，从而提高了选择性。ＨＰＬＣ常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。

在测定生物样品中药物及其代谢物时，样品的前处理是十分重要的。除了少数情况，将体液经简单处理后进行直接测定外，一般要在测定之前进行样品的前处理，即进行分离、纯化、浓集，必要时还需对待测组分进行化学衍生化，从而为测定创造良好的条件。生物样品进行前处理的目的在于：①药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体外。在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物之外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙（gl uronides）、硫酸酯（sulphates）缀合物等多种形式存在，需要分离后测定药物及代谢物；②生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物，也含有Na＋、K＋、X-等无机化合物］。其中影响最大的是蛋白质，若用HPLC法测定药物浓度时，蛋白质会沉积在色谱柱上发生堵塞，严重影响分离效果。因此，为了保护仪器，提高测定的灵敏度，必须进行除蛋白等前处理。

常用样品的种类、采集和贮藏

生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比较容易得到的血液（血浆、血清、金血）、尿液、唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脊髓液、精液等。下面仅介绍常用的血样、尿样及唾液。

（一）血样

血浆（plasma）和血清（serum）是最常用的生物样品。测定血中药物浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。

供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药物在血液中分布均匀后取样。动物实验时，可直接从动脉或心脏取血。对于病人，通常采取静脉血，有时根据血药浓度和分析方法灵敏度，也可用毛细管采血。由采集的血液制取血浆或血清。

血浆的制备将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝萦、草酸盐、拘橡酸盐、EDTA、氟化钠等）的试管中，混合后，以2500～3000rpm离心5min使与血细胞分离，分取上清液即为血浆。

血清的制备将采取的血样在室温下至少放置30min到1h，待凝结出血饼后，用细竹捧或玻璃棒轻轻地剥去血饼，然后以2000～3000rpm离心分离5～10min，分取上清液．即为血清。

血浆比血清分离快，而且制取的量多，其量约为全血的一半。但由于所用抗凝剂的种类不同，用血浆测定药物浓度有时不一致；血清的获取量小，但血清成分更接近于组织液的化学成分，测定血清中有关物质的含量，比全血更能反映机体的具体情况；同时，药物与纤维蛋白几乎不结合，因此，血浆及血清中的药物浓度测定值通常是相同的。基于上述原因，现在国外多采用“专用血清”来测定药物的浓度。

对大多数药物来说，血浆浓度与红细胞中的浓度成正比，所以测定全血也不能提供更多的数据，而全血的净化较血浆和血清更为麻烦，尤其是溶血后，血色素会给测定带来干扰。但在个别情况下也有采用全血测定药物浓度的。例如氯噻酮可与红细胞结合，其动力学行为与在血浆中不同，在血细胞的药物浓度比血浆药物浓度大50～100倍；又如一些三环降压药物，对个别患者来说，在血浆和红细胞的分配比率不是一个常数，因此宜采用全血进行测定。

全血（Whole blood）也应加入抗凝剂混合，防止凝血后影响测定。血样的采取量受到一定限制，特别是间隔比较短的多次取样，患者不易配合。过去一般取1～2ml。随着高灵敏度测定方法的建立，取量可减少到1ml以下。采取静脉血时，目前通行的方法是用注射器直接从静脉抽取，然后置试管中：采取毛细管取血时，应用毛细管或特殊的微量采血管采取。采取血样时，应由从事医疗工作的医生、护士或者临床检查技师实施，药剂师等不能进行采血工作。

血样的采血时间间隔应随测定目的的不同而异。例如：进行药物动力学参数的测定时，需给出药物在体内的药物浓度．时间曲线。应根据动力学曲线模型〈单室还是双室）、给药方式来确定取样间隔和次数，主要应在曲线首尾及峰值附近或浓度变化较大处取祥。采样次数示意图见

如进行治疗药物浓度监测（therapeutic drug monitoring，TDM）时，则应在血中药物浓度达到稳态后才有意义。但每种药物的半衰期不同，因此达到稳态的时间也不间，取样时间也随之不同。药物进入体内后，大多数很快与血浆中的蛋白质（白蛋白、球蛋白）结合成结合型，并与未结合的游离型药物处于平衡状态而存在。结合型药物（bound型）不能通过血管壁，而游离型药物（free型）能够到达药物作用部位，因此可以说药物疗效与游离型药物

浓度有着比较密切的关系，当然最理想的是测定游离型药物。由于测定游离型药物必须经过“超速离心”或“超滤法”等复杂的分离操作，又因药物的蛋白结合率没有很大的个体差异，通常血药总浓度（结合型与游离的总和）可以有效表示游离药物的浓度，因此，大多数的检验室不测定游离型药物，而是测定药物的总浓度。

但某些疾病可改变药物与血浆蛋白的结合率，如肝硬化病人奎尼丁的游离型药物分数几乎增加三倍；肾病时，苯妥英、水杨酸、安妥明等的血浆蛋白结合卒明显下降。有些药物血浆蛋白结合率存在着很大的个体差异，如奎尼丁的血浆蛋白结合率的范围为50％～90％，不同个体问游离药物浓度差达10倍。也就是说在肝硬化、肾功能不全、肾病变、低营养等状态下，血中白蛋白浓度显著减少，药物的蛋白结合率下降，游离型药物浓度上升，此时应测定游离型药物浓度。

采取血样后，应及时分离血浆或血清，并最好立即进行分析。如不能立即测定时，应妥善储存。血浆或血清样品不经蒸发、浓缩，必须置硬质玻璃试管中完全密塞后保存。短期保存时置冰箱（4℃）中，长期保存时要在冷冻橱（库）（－20℃）中冷冻保存。

要注意采血后及时分离出血浆或血清再进行储存。若不预先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时引起细胞溶解从而妨碍血浆或血清的分离或因溶血影响药物浓度变化。

（二）唾液

唾液由腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔粘膜内许多散在的小腺体分泌液混合组成的，平时所说的唾液就是指此混合液。一般成人每天分泌1～1.5ml，但个体差异大，即使是同－个人每日之内、每日之间也有变动；各腺体分泌的唾液组成也会有很大差别。对口腔粘膜给予机械的或化学的剌激时，会影响各唾液腺的分泌；视觉、听觉、嗅觉等剌激所产生的条件反射以及思维、情绪也会影响唾液腺的分泌；随年龄不同，唾液的分泌量也不同：小儿的唾液分泌量多，老年人的分泌量减少。

唾液的相对密度为1.003～1.008；pH值在6.2～7.6之间变动，分泌量增加时趋向碱性而接近血液的pH值；通常得到的唾液含有粘蛋白，其粘度是水的1.9倍。

唾液的采集应尽可能在剌激少的安静状态下进行。一般在漱口后15min收集。分泌量多的，可以将自然贮存于口腔内的唾液吐入试管中，1min内约可取1ml的唾液。必要时也可转动舌尖，以促进唾液的分泌。采集的时间至少要10min。采集后立即测量其除去泡沫部分的体积。放置后分为泡沫部分、透明部分及灰乳白色沉淀部分三层。分层后，以3000rpm 离心分离10min，取上清液作为药物浓度测定的样品。也可以采用物理的（如嚼石蜡块、橡胶、海绵）或化学的（如酒石酸）等方法剌激，使在短时间内得到大量的唾液。但另一方面，这样做往往使唾液中的药物浓度受到影响。特殊需要时，可以采集腮腺、颌下腺及舌下腺分泌的单一唾液。这种单一唾液的采集必须采用特殊的唾液采集器来收集。~6["b\ }iY\

唾液中含有粘蛋白，唾液的粘度由粘蛋白的含量多少而定。粘蛋白是在唾液分泌后，受唾液中酶催化而生成的。为阻止粘蛋白的生成，应将唾液在4℃以下保存。如果分析时没有影响，则可用碱处理唾液，使粘蛋白溶解而降低粘度。唾液在保存过程中，会放出二氧化碳而使pH值升高，因此，需要测定唾液的pH值时，应在取样的当时为好。冷藏保存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液充分搅匀后再用，不然测定结果会产生误差。

用唾液作为样品测定药物浓度有几个优点：与采取血样不同，患者自己可以不受时间和地点的限制，很容易地反复采集；采集时无痛苦无危险；有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。但另一方面，由于唾液是由腮腺、颌下腺及舌下腺等各腺体分泌的组成不同的混合液体，其组成也会发生经时变动；因此，唾液中的药物浓度与血浆中的游离型药物浓度相比就容易变动；而且唾液中药物浓度与血浆中药物浓度的比值〈S／P）只有少数药物是恒定值；有些与蛋白结合率较高的药物，药物在唾液中的浓度比血浆浓度低得多，需要高灵敏度的分析方法才能检测；对有些患者（如癫痫、昏迷）不能采集唾液样品。最后应

该指出的是：目前所指的血浆或血清浓度的治疗范围，都是指血浆或血清中的总浓度（游离型和结合型），因此，只有知道唾液中药物浓度与血浆中药物浓度有－定的比值时，唾液中药物浓度的监测才有意义，并且应该先求出具体患者的比值（S/P）。

（三）尿液

采用尿样测定药物浓度的目的与血液、唾液样品不同。尿药测定主要用于药物剂量回收研究、尿清除率、生物利用度的研究，并可推断患者是否违反医嘱用药，同时根据药物剂量回收研究可以预测药物的代谢过程及测定药物的代谢类型（代谢速率，MR）等。

体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物（conjugete）等形式排出。尿液中药物浓度较高，收集量可以很大，收集也方便。但尿液浓度通常变化很大。尿液主要成分是水、含氮化合物（其中大部分是尿素）及盐类。

健康人排出的尿液是淡黄色或黄褐色的，成人一日排尿量为1~5L，尿液相对密度1.015~1.020，pH值在4.8~8.0之间。放置后会析出盐类，并有细菌繁殖、固体成分的崩解，因而使尿液变混浊。由于这些原因，必须加入防腐剂保存。采集的尿是自然排尿。尿包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。测定尿中药物浓度时应采用时间尿，时间尿以外的尿不可能推断全尿中药物的排泄浓度和药物总量。因此，测定尿中药物的总量时，将一定时间内（如8h、12h或24h等）排泄的尿液全部储在起来，并记录其体积，取其一部分测定药物浓度，然后乘以尿量求得排泄总量。如采集24h的尿液时，一般在上午8点让患者排尿并弃去不要，之后排出的尿液全部储存于干净的容器，中，直到次日上午8点再让患者排尿，并加入容器中。将此容器中盛的尿液做为检液。采集24h尿液时，常用2L容量的带盖的广口玻璃瓶，其体和可能会有士100ml的误差，因此，需再用量筒准确地测量储尿量。采集一定时间内的时间尿液时，常用涂蜡的一次性纸杯或用玻璃杯，并用量筒准确量好体积放入储尿瓶，并做好记录。

尿液中药物浓度的改变不能直接反映血药浓度，即P与血药浓度相关性差；受二试者的肾功能正常与否直接影响药物排泄，因而肾功能不良者不宜采用尿样；婴儿的排尿时间难于掌握；尿液不易采集完全并不易保存。这些是尿样的缺点。

采集的尿样应立即测定。若收集24h的尿液不能立即测定时，应加入防腐剂置冰箱中保存。常用防腐剂有：甲苯、二甲苯、氯仿、麝香草酚以及醋酸、浓盐酸等。利用甲苯等可以在尿液的表面形成薄膜，醋酸等可以改变尿液的酸碱性来抑制细菌的生长。保存时间为24～36h，可置冰箱（4℃）中，长时间保存时，应冰冻（－20℃）。