荧光报告载体

荧光报告载体是一种用于检测生物分子的工具，它通过荧光信号来标记目标分子，快速、高灵敏地检测出目标分子的存在和浓度。荧光报告载体主要由两个部分组成：报告基团和载体基团。

报告基团是负责发出荧光信号的组分，常见的报告基团有荧光素、荧光素衍生物、生物素、发光酶和量子点等。这些基团在受到激发光的刺激后，会发出荧光信号，从而实现对目标分子的检测。

载体基团则是负责将报告基团固定在某一特定位置上，并能保持其功能的组分。常见的载体基团有金属离子、磁性颗粒、生物体内分子和聚合物等。具体选择何种载体基团，需要根据实际的检测需求来决定。

荧光报告载体广泛应用于生物医学领域的分子诊断、病理学研究、生物分子检测等方面。例如，可以使用荧光报告载体检测细胞的蛋白质表达情况，以及肿瘤标志物的存在量；还可以使用荧光报告载体检测细菌或病毒的感染等。

荧光报告载体的设计与选择需要注意以下几个方面：1.信号强度：荧光信号的强度越大，检测结果的准确性就越高；2.稳定性：在生物体内，荧光报告载体需要具备较好的稳定性，以免荧光信

号的损失或偏差；3.特异性：荧光报告载体需要具有很高的特异性，以便准确地检测出目标分子。

总的来说，荧光报告载体不仅为现代生物科学的实验提供了重

要的技术手段，更极大地促进和推动了许多生物医学领域的研究

与应用。有理设计和选择合适的荧光报告载体，将为生物科学的

发展带来新的突破和进展。

双萤光素酶报告基因的应用,常见载体及案例简介

双萤光素酶报告基因的应用，常见载体及案例简介双萤光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase Reporter Assay）通常以萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)为报告基因，以海肾萤光素酶(Renilla luciferase)为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势，广泛用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。 Firefly luciferase（简称F-Luc）以萤光素(luciferin)为底物，在Mg2+、ATP和氧分子存在条件下，催化luciferin氧化成oxyluciferin，在此过程中发出最强波长在560nm 左右的生物萤光(bioluminescence)。F-Luc表达框的上游启动子区域插不同功能序列，可以通过转录起始条件造成其报告萤光的变化。在F-Luc的3’UTR区域插入待验证的靶序列，通过其翻译抑制或mRNA稳定性降低，可以反映是否存在靶向互作。 Renilla luciferase（简称R-Luc）以腔肠素（coelenterazine）为底物，在氧分子存在的条件下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide，此过程中发出最强波长在465nm 左右的生物萤光。R-Luc通常由固定组成型启动子驱动，在报告系统中作为校正input误差的内参信号。生物萤光产生反应式一、应用方向 1. 验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。 2. 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc 的3’UTR区域，检测萤光素活性。 3. 启动子结构分析。将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。 4. 启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性。

双荧光素酶报告基因检测原理

双荧光素酶报告基因检测原理荧光素酶（英文名称：Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyralis的萤火虫体内的荧光素酶。在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）。没有荧光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应（与肌肉收缩的情况相似）。双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率。理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由于它们测试化学,处理要求所固有的局限。相反 , 结合萤火虫 ( Photinus pyralis ) 和海洋腔肠 ( Renilla reniformis ) 双荧光素酶的系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。

双荧光素酶报告基因检测原理：将目的基因3’UTR区域或者lncRNA序列构建至载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。常用荧光素酶报告基因载体： 1、pRL-TK这个载体是由Promega开发的，pRL-TK是海肾荧光素酶报告载体，含有SV40增强子，质粒图谱如下所示：

荧光蛋白报告载体

荧光蛋白报告载体荧光蛋白（Fluorescent Protein，FP）是一类具有自身天然荧光特性的蛋白质，能够在特定条件下发出可见光。由于其独特的特性，荧光蛋白被广泛应用于生物学研究、医学诊断和生物工程等领域。而荧光蛋白报告载体则是指将荧光蛋白基因与其他基因融合，使得该基因在表达时能够产生可见荧光信号，从而实现基因表达的可视化和定量化。下面将介绍荧光蛋白报告载体的构建和应用过程。 1.荧光蛋白的选择荧光蛋白有多种类型可供选择，如绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（RFP）等。在选择荧光蛋白时，需考虑其荧光强度、稳定性、激发波长和发射波长等因素，并根据实验需要进行合适的选择。 2.载体的构建将荧光蛋白基因与目标基因进行融合，需要使用合适的载体来实现。常用的载体包括质粒、病毒载体等。质粒载体是最常用的载体之一，可以通过分子克隆技术将荧光蛋白基因与目标基因连接起来，形成报告载体。 3.载体的转染将构建好的荧光蛋白报告载体导入到目标细胞内，实现基因的转染。转染方法有多种，如瞬时转染、稳定转染等。根据实验需要和细胞类型的不同，选择合适的转染方法。 4.荧光成像与分析转染后的细胞可以通过荧光显微镜观察到荧光信号。根据荧光蛋白的特性，可以通过激发荧光信号，观察细胞内目标基因的表达情况。同时，可以利用图像分析软件对荧光图像进行处理和分析，实现基因表达的定量化和定位。 5.应用领域荧光蛋白报告载体在生物学研究、医学诊断和生物工程等领域有广泛的应用。在生物学研究中，荧光蛋白报告载体可以用于研究基因的表达和调控机制，观察细胞的生理和病理过程，探究蛋白质的定位和交互作用等。在医学诊断中，荧光蛋白报告载体可以用于检测病原体的存在和活性，实现早期诊断和治疗。在生物工程中，荧光蛋白报告载体可以用于基因工程的监测和优化，提高基因表达的效率和产量。总结：荧光蛋白报告载体通过将荧光蛋白基因与目标基因融合，实现了基因表达的可视化和定量化。其构建步骤包括荧光蛋白的选择、载体的构建、载体的转染和荧光成像与分析。荧光蛋白报告载体在生物学研究、医学诊断和生物工程等领域具有广泛的应用前景，为相关领域的研究和应用提供了有力的工具和方法。

双荧光素酶基因法载体构建

双荧光素酶基因法载体构建双荧光素酶基因法是一种常用的基因标记技术，可以在细胞或物种中标记特定基因，方便研究基因的表达和功能。该技术将荧光素酶基因和荧光素酶底物相结合，并通过酶学反应产生强烈的荧光信号，从而实现基因标记和检测。本文将介绍双荧光素酶基因法载体的构建方法。 1、材料双荧光素酶基因报告载体（pGL4.31）双荧光素酶基因调控元件载体（pGL4.32）限制酶EcoRI和XhoI T4连接酶琼脂糖 PCR扩增产物模板 PCR引物大肠杆菌DH5α感受态细胞 2、方法 1) 双荧光素酶基因报告载体（pGL4.31）的构建 a、制备pGL4.31载体的线性质粒选取pGL4.31载体，使用限制酶EcoRI和XhoI对其进行酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化出所需大小的线性DNA片段。 b、连接荧光素酶基因将线性质粒与荧光素酶基因进行T4连接酶酶切和连接，构建成双荧光素酶基因报告载体。 a、PCR扩增产物的准备选择所需的基因调控元件序列作为PCR扩增产物的模板，设计一对前后引物，在PCR 反应条件下扩增所需大小的DNA片段。 a、验证载体的构建

将构建好的双荧光素酶基因报告载体和基因调控元件载体进行测序验证，确定所构建载体序列的准确性。将所构建好的载体转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行筛选和扩增。通过测序验证构建的载体与所需载体相符，符合要求的荧光素酶基因法载体已构建成功。二、结论通过双荧光素酶基因法载体的构建，成功将荧光素酶基因和基因调控元件结合构建成标记组合载体，为后续研究基因表达和功能提供了多种方法和途径，有助于深入探究生物学领域的多项研究内容。

报告载体及报告基因总结

报告基因载体 (1)报告基因载体的特点：除了具有表达蛋白质所需要的结构外，理想的报告基因载体本身无调节结合位点或序列，而具有有意插入的调节结合位点，尽管可以从报告基因载体除去已知的结合位点，减少报告基因上游的转录，但从几千kb的DNA中去除所有潜在的调控序列是不可能的。因此在使用报告基因载体时，应使用合适的对照载体。报告基因质粒载体一般在大肠杆菌中繁殖，因此包括一个DNA复制起始点(ori)和基因筛选标记，通常为氨苄西林抗性基因(Ampr)。另外还具有丝状噬菌体复制起始点(flori)，可使载体形成单链DNA，便于基因突变和测序。 (2)报告基因和侧翼区：报告基因编码区和侧翼区常被改变。例如，去除SEAP（分泌型碱性磷酸酶）羧基末端24个氨基酸，使SEAP能直接分泌到细胞外，因此测定SEAP活性不必裂解细胞。去除荧光素酶的过氧化物酶体靶向序列，使荧光素酶转运到细胞质而非过氧化物酶体中。为了使报告基因表达最大化，核糖体最佳结合序列(GCCGCCCCATG)被置于报告基因的5’端。此序列能增加翻译效率，产生NcoI酶切位点，可使外源基因N末端与报告基因融合。 (3)多克隆位点：许多报告基因含有2个以上克隆位点(MCS)，一个位于报告基因上游，用于插入假定的克隆启动子或增强子／启动子区；另一个位于其他位置，用于插入克隆调控元件，例如插入可远距离发挥作用的增强子。另外，还有用于插入基因筛选标记的克隆位点，用于筛选稳定表达报告基因的宿主细胞。MGS具有几个单酶切位点，用限制性内切酶催化可产生黏性末端。DNA片段可插到此位点。MCS还包括一个或两个MCS末端，此末端序列可由限制性内切酶催化断裂形成3’悬垂末端，可用核酸外切酶Ⅲ进行嵌套缺失分析。 (4)多聚腺苷酸信号：多聚腺苷酸(polyA)可增强哺乳细胞mRNA稳定性和mRNA的翻译。polyA序列紧随报告基因之后，可指导RNA转录物3’端添加200～250个腺苷酸残基。在转录单位5’端插入polyA信号能降低源于载体的隐匿启动子序列基因表达水平，去除背景表达，增加报告基因系统的灵敏性。在报告基因转录单位上游3个阅读框中均插入终止密码子，可进一步降低源于载体的假转录背景。常见的报告基因报告基因必须具备的特点：①由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别；②细胞内其他基因产物不会于扰报告基因产物的检测；③报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高，而且重现性好。到目前为止，报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连，先让质粒在大肠杆菌中进行增殖，再提取质粒，转染人感兴趣的真核细胞中。与此同时，还要将有真核启动子和增强子的另一种报告基因质粒共转染同一细胞，作为转染率的内对照。 (1)氯霉素乙酰基转移酶(CAT) 该报告基因来源于大肠杆菌转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。

双荧光素酶报告系统

双荧光素酶报告系统双荧光素酶报告系统（dual luciferase reporter assay system）是一种常用的生物学实验技术，用于研究基因调控、信号转导通路、蛋白质相互作用等生物学过程。该技术利用荧光素酶和甲基荧光素酶作为报告基因，通过测定其荧光素酶活性来分析靶基因的表达水平和调控机制。本文将介绍双荧光素酶报告系统的原理、操作步骤和应用范围，希望能够为相关研究人员提供一定的参考和帮助。双荧光素酶报告系统的原理。双荧光素酶报告系统利用两种不同的荧光素酶，荧光素酶（firefly luciferase）和甲基荧光素酶（Renilla luciferase）。荧光素酶作为感光酶，能够将底物荧光素转化为可见光，而甲基荧光素酶则能将底物甲基荧光素转化为可见光。通过测定这两种荧光素酶的活性，可以分别得到两个不同的荧光信号，从而实现对靶基因表达水平和调控机制的研究。双荧光素酶报告系统的操作步骤。 1. 转染，将感兴趣的靶基因启动子区域克隆到双荧光素酶报告载体中，然后将该载体与甲基荧光素酶报告载体一起转染至目标细胞中。 2. 荧光素酶活性测定，在转染后一定时间，使用相应的底物分别对荧光素酶和甲基荧光素酶进行反应，然后测定其荧光素酶活性。 3. 数据分析，根据荧光素酶和甲基荧光素酶的活性测定结果，计算其相对荧光单位（RLU值），并进行比较分析，得出靶基因的表达水平和调控机制。双荧光素酶报告系统的应用范围。双荧光素酶报告系统在生物学研究中具有广泛的应用范围，主要包括以下几个方面：

1. 研究基因调控，通过分析靶基因启动子区域的活性，揭示基因的调控机制，如转录因子的结合和调控效应等。 2. 分析信号转导通路，通过构建信号转导通路相关的双荧光素酶报告系统，研究信号分子的调控作用和相互关系。 3. 探究蛋白质相互作用，利用双荧光素酶报告系统分析蛋白质相互作用的影响因素和调控机制。 4. 高通量筛选，应用双荧光素酶报告系统进行药物筛选和基因组学研究，实现大规模的功能分析和筛选。总结。双荧光素酶报告系统作为一种重要的生物学实验技术，在基因调控、信号转导通路、蛋白质相互作用等领域具有重要的应用价值。通过本文的介绍，相信读者对双荧光素酶报告系统的原理、操作步骤和应用范围有了更深入的了解，希望能够为相关研究人员的实验工作提供一定的帮助和指导。

HMGA23'-UTR双荧光素酶报告载体构建及与miR-33b-5p的靶向验证

HMGA23'-UTR双荧光素酶报告载体构建及与miR-33b-5p 的靶向验证 HMGA23'-UTR双荧光素酶报告载体构建及与miR-33b-5p 的靶向验证细胞内的基因表达调控是生命活动的重要组成部分。许多研究发现，小RNA分子，特别是microRNA(miRNA)，在这个过程中发挥着关键的作用。miRNA是一类具有约22个核苷酸的非编码RNA，通过结合到靶基因的3'非翻译区(3'-UTR)上，从而下调靶基因的表达。miRNA的研究对于理解基因调控网络以及疾病发生机制具有重要意义。 miR-33b-5p是一种与脂质代谢紧密相关的miRNA。已有的研究表明，miR-33b-5p在胆固醇合成和脂蛋白代谢等方面发挥作用。然而，miR-33b-5p的详细调控机制以及与其他基因的相互作用尚不清楚。本研究旨在构建一个报告载体，用于评估miR-33b-5p对特定基因的调控作用，并验证其靶向效应。首先，我们选取了HMGA2基因作为靶基因。HMGA2是一种常见的转录调节因子，与肿瘤发生和发展密切相关。我们通过测序和数据挖掘的方法发现，HMGA2的3'-UTR区域存在潜在的miR-33b-5p结合位点。基于这一发现，我们设计了一个含有HMGA23'-UTR的报告载体。在构建载体的过程中，我们首先合成了HMGA23'-UTR的DNA序列，并进行了测序验证。接下来，我们将该序列插入到pGL3-Basic载体中，在此过程中使用限制性内切酶进行酶切和连接，并通过测序确保插入序列的正确性。最终，我们成功构建了报告载体HMGA23'-UTR-pGL3，并通过限制性酶切鉴定。为了验证miR-33b-5p对HMGA2的靶向调控功能，我们进

荧光素酶报告质粒

荧光素酶报告质粒荧光素酶报告质粒是一种广泛应用于分子生物学、遗传学等领域的重要工具。它以荧光素酶为标志物，可以用于检测目标基因的转录、翻译等生物学过程。在研究中，荧光素酶报告质粒具有极高的灵敏度和特异性，可以被广泛应用于基因表达定量化和基因调控机制的研究。荧光素酶报告质粒的构建荧光素酶报告质粒是由一个驱动基因启动子、一个荧光素酶编码基因和一个筛选标记基因（如抗生素抗性基因）组成的。其中，驱动基因启动子在荧光素酶基因上游控制荧光素酶的转录，荧光素酶基因编码荧光素酶蛋白质，筛选标记基因则用于筛选带有荧光素酶报告质粒的细胞。构建荧光素酶报告质粒的过程一般包括多个步骤：选择适合的荧光素酶基因、选择适当的驱动基因启动子、将荧光素酶基因和启动子克隆入质粒载体、进行质粒的提纯和转染等。这些步骤的选择和操作在构建荧光素酶报告质粒的时候都需要谨慎而仔细。

荧光素酶报告质粒的应用荧光素酶报告质粒的应用领域非常广泛。它被广泛应用于分子生物学、遗传学、生物化学等领域的研究。常见的应用包括荧光素酶基因表达定量化和基因调控机制的研究。这些应用不仅可以深入了解基因的结构和功能，还有助于探究基因在生物学过程中的作用。荧光素酶报告质粒的优点和限制荧光素酶报告质粒具有灵敏度高、特异性强、操作简单等优点。同时，荧光素酶报告质粒还可以用于非常灵敏的定量分析和高通量筛选。然而，荧光素酶报告质粒也有其一定的限制。例如，由于荧光素酶生命周期较短，荧光素酶报告质粒只能用于定性或相对定量测定；另外，选择适当的驱动基因启动子也是很关键的，否则将会导致结果的误差。结语

人源DNMT1基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及其活性检测

人源DNMT1基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及其活性检测黄滔;曹玉祥;张志坚;周兴路;魏慧君;吴志浩【摘要】目的:利用PCR扩增人源DNA甲基转移酶1 (DNMT1) 基因启动子, 构建其荧光素酶报告基因载体并对其活性进行检测. 方法:运用PCR技术以人非小细胞肺癌细胞A549基因组DNA为模版扩增出目的片段, 将PCR产物用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上, 然后进行转化、菌落PCR及测序验证等. 将构建成功的pGL3-proDNMT1luc重组质粒和内参质粒pRL-CMV-luc共转入H1299细胞中检测DNMT1启动子活性.结果:成功扩增出长度为1634 bp的目的片段, 并成功构建出DNMT1启动子荧光素酶报告基因载体, 启动子具有活性. 结论: DNMT1启动子的成功克隆为进一步研究其分子调控机制和生物学意义奠定了基础.%Objective: To construct and determine the activity of luciferase reporter vector of human DNMT1 gene promoter. Methods: The tt fragment was amplified with PCR by using genomic DNA of human non-small cell lung cancer cell line A549 as template. The PCR products were digested by Kpn I and Xho I double enzymes and ligated to luciferase reporter vector pGL3-Basic, and then transformed into E coli to construct pGL3-proDNMT1-luc reporter vector that was verified by sequencing. The recombinant plasmid pGL3-proDNMT1-luc reporter vector and plasmid pRL-CMV-luc were transferred to H1299 cell and the DNMT1 promoter activity was determined by double luciferase reporter gene detection system. Results: The target fragment with length of 1634bp was amplified, and the luciferase reporter gene vector of pGL3-

双荧光素报告基因载体

双荧光素报告基因载体：构建与应用引言双荧光素报告基因载体在生物学和医学研究中具有广泛的应用。它能够帮助研究人员观察和分析特定基因在细胞中的表达情况。本文将介绍双荧光素报告基因载体的构建和应用过程。构建双荧光素报告基因载体的步骤第一步：选择荧光素基因和载体在构建双荧光素报告基因载体之前，我们需要选择合适的荧光素基因和载体。常用的荧光素基因有荧光素酶（Luciferase）和绿色荧光蛋白（GFP）。载体选择上可以使用质粒或病毒载体。第二步：设计引物和限制酶切位点在构建双荧光素报告基因载体时，需要设计引物和限制酶切位点。引物用于扩增荧光素基因，限制酶切位点用于将基因插入载体。第三步：扩增和纯化荧光素基因使用设计好的引物扩增荧光素基因。扩增完成后，通过凝胶电泳检测目标片段的大小并纯化出目标片段。第四步：切割载体和插入基因将载体与限制酶进行切割。切割后，将扩增和纯化好的荧光素基因与载体连接，形成重组载体。第五步：转化宿主细胞并筛选将重组载体转化到宿主细胞中，常用的宿主细胞有大肠杆菌。转化完成后，通过筛选对重组载体敏感的宿主细胞，如通过抗生素抗性筛选。第六步：验证重组载体通过PCR扩增和测序等方法对重组载体进行验证。确保荧光素基因已经正确插入载体。

双荧光素报告基因载体的应用荧光素酶活性检测双荧光素报告基因载体可以用于荧光素酶活性检测。将重组载体转染到感兴趣的细胞中，然后加入荧光素底物。荧光素酶基因的表达量与荧光素底物的降解速率成正比。通过测量产生的荧光信号强度，可以获得基因的表达水平。基因表达调控研究双荧光素报告基因载体还可以用于基因表达调控的研究。通过插入启动子区域，可以观察特定条件下基因的表达变化。比如，研究某种药物对基因表达的影响。细胞信号通路研究使用双荧光素报告基因载体可以研究细胞信号通路。通过将感兴趣的基因与荧光素酶基因连接，可以观察特定信号通路的活性。这有助于理解细胞信号传递过程以及相关疾病的发生机制。结论双荧光素报告基因载体是一种重要的实验工具，在生物学研究中发挥着重要作用。通过构建和应用双荧光素报告基因载体，可以更好地理解基因的表达调控机制以及细胞功能的变化。随着技术的进步，双荧光素报告基因载体的应用还将不断扩展。

荧光素酶报告实验

荧光素酶报告实验 1 扩增目的片段扩增包含靶基因与miRNA互补位点的3’UTR序列以及mutant序列，上下游引物5’端各含有不同的酶切位点和保护碱基（如Pme I，Spe I）；电泳检测目的条带，看大小是否正确，然后用试剂盒纯化PCR产物备用。主要采用了2 种方法进行序列突变及扩增，如下图所示：第一种方法：第二种方法： 1.2 取1-2 μg纯化的目的片段或pMIR-REPORT载体，按酶切反应体系配制混合液进行酶切（加0.01% BSA），酶切3h后，80℃灭活5 min，冰上降温。酶切产物进行胶回收。

酶切体系连接体系Component V olume (μl) Component V olume (μl) H2O 16-x H2O 8-m-n Vector or DNA x Vector m NEB Buffer I或IV 2 DNA n Spe I 1 10×T4 Ligase Buffer 1 Pme I 1 T4 DNA Ligase 1 Total voloume 20 Total voloume 10 1.3 配制连接反应混合液（DNA和Plasmid的molar ratio为3:1到6:1），16℃连接过夜或室温连接10 min。连接完毕后，将连接产物转化入感受态大肠杆菌（热激法）。Amp（100 μg/ml）抗性培养板筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定目的片段，送3个样本测序，提取质粒酶切鉴定等。并扩繁阳性克隆。重组Luc-3’UTR 质粒主要元件和组成如下图所示（重组Luc-3’UTR-Mut 原理相同）： pLuc-MET 3'UTR 荧光素酶报告基因载体的构建 4.接种对数生长期的HEK293细胞（10% FBS+90% DMEM培养）于96孔板，3×103个/孔，每个实验组设置6个复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养24h； 5.根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，配制转染液，转染HEK293细胞； A 液B液 pLuc-3’UTR 0.1 μg Lipofectamine 2000 0.5 μl pRL-SV40 0.05 μg OPTI-MEM 25 μl Mimic/NC 100 nM终浓度 OPTI-MEM 25 μl 6 转染48 h后，吸除96孔板中的培养液，用ddH2O稀释Passive Lysis Buffer至1×浓度，在96孔板中加入1×Passive Lysis Buffer，20 μl/孔，用移液枪反复吸打裂解细胞； 7 在白色不透明的96孔板中加入100 μl/孔的Luciferase Assay Substrate； 8 从每孔裂解好的细胞悬液中吸出11.5 μl加入Luciferase Assay Substrate中混匀； 9 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据； 10 用Stop & Glo® Buffer稀释Stop & Glo® Substrate至1×使用浓度； 11 在第7步完成后，加入Stop & Glo® Substrate 100 μl/孔，混匀； 12 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据，两次测得数据的比值代表各孔样本的相对荧光强度。

荧光报告基因质粒

荧光报告基因质粒简介荧光报告基因质粒是一种常用的实验工具，用于研究基因的表达和调控。它能够通过荧光信号的强弱来反映基因的表达水平，从而帮助科学家更好地理解生物体内基因的功能和调控机制。本文将介绍荧光报告基因质粒的构建和应用方法。构建荧光报告基因质粒的步骤步骤1：选择荧光报告基因在构建荧光报告基因质粒之前，首先需要选择一个合适的荧光报告基因。常用的荧光报告基因包括绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）等。步骤2：设计引物设计引物是构建荧光报告基因质粒的关键步骤。引物应包含目标荧光报告基因的启动子区域和终止子区域，以确保基因能够被正确地转录和翻译。步骤3：扩增荧光报告基因利用引物进行PCR扩增荧光报告基因。在PCR反应中，需要添加荧光报告基因的DNA模板、引物、dNTPs和聚合酶等反应物，按照标准的PCR程序进行扩增。步骤4：构建质粒载体选择一个合适的质粒载体，如pUC19等，将PCR扩增得到的荧光报告基因插入质粒中。插入方法可以采用限制性内切酶切割和连接、TA克隆等常用的分子生物学技术。步骤5：转化宿主细胞将构建好的荧光报告基因质粒转化到宿主细胞中。常用的宿主细胞包括大肠杆菌（E. coli）、酵母等。转化方法可以采用热激转化、电转化等。步骤6：筛选阳性克隆在转化后，需要进行阳性克隆的筛选。通过培养在含有相应抗生素的培养基上，只有带有正确构建的荧光报告基因质粒的细胞才能够生长并形成克隆。

荧光报告基因质粒的应用应用1：研究基因表达荧光报告基因质粒可用于研究基因在不同组织、不同发育阶段以及不同环境条件下的表达水平。通过观察荧光信号的强弱，可以了解基因在不同条件下的表达模式和水平，从而揭示基因的功能和调控机制。应用2：筛选启动子和调控元件荧光报告基因质粒还可用于筛选启动子和调控元件。通过将不同启动子和调控元件与荧光报告基因组合，可以评估它们对基因表达的影响。这有助于鉴定和研究新的基因调控元件，进一步理解基因的调控网络。应用3：荧光成像构建荧光报告基因质粒后，可以利用荧光成像技术观察携带该基因的生物体内荧光信号的分布和强度。通过荧光成像，科学家可以实时监测基因的表达动态，进一步了解基因在不同组织和细胞中的功能和调控。结论荧光报告基因质粒是一种重要的实验工具，广泛应用于研究基因的表达和调控。通过构建荧光报告基因质粒，科学家可以实时监测基因的表达水平，并深入研究基因的功能和调控机制。希望本文对荧光报告基因质粒的构建和应用提供了一定的指导和帮助。

α平滑肌肌动蛋白红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达

α平滑肌肌动蛋白红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达蔡琳;宋卉;阮志燕【摘要】目的构建α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内α-SMA的基因表达调控提供重要工具.方法克隆并构建含α-SMA启动子区的红色荧光报告质粒pDsRed-SMAp;用脂质体瞬时转染上皮细胞A549,观察α-SMA启动子对转化生长因子(TGF-β1)刺激的反应.结果酶切和DNA 测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是pDsRed-SMAp重组载体；该表达载体在上皮细胞静息状态下表达水平很低,经TGF-β1刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.结论成功构建了α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告质粒pDsRed-SMAp,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于α-SMA基因表达调控机制的研究.%Objective To construct a red fluorescent protein reporter gene which driven by α-s mooth muscle acin (α-SMA) gene promoter,in order to provide important tools for study of α-SMA gene expression regulation in cells.Methods The red fluorescent protein reporter gene plasmid pDsRed-SMAp contained mouseα-SMA gene promoter was constructed by gene recombination technique.The plasmid was transiently transfected into A549 cells to observe their response to TGF-β1 stimulation.Results The pDsRed-SMAp plasmid was constructed correctly as verified by double enzyme digestion and sequence analysis.The plasmid was lowly expressed in resting A549 cells,but the expression level increased obviously after stimulation by TGF-β1.Conclusion A red fluorescent protein reporter gene plasmid driven by α-SMA gene