荧光知识

一、荧光与磷光的产生过程

每个分子中都具有一系列严格分立相隔的能级，称为电子能极，而每个电子能级中又包含有一系列的振动能级和转动能级。

在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发为激发态。激发态是很不稳定的，它将很快地释放出能量又重新跃迁回基态。分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。

分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外，还包含有电子的多重态，用M=2S+1表示，S为各电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1 。根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。若分子中所有电子都是自旋配对的，则S=0，M=1，该分子便处于单重态(或叫单重线)，用符号S表示。大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中，不发生自旋方向的变化，这时仍然是M=1，分子处于激发的单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这时分子中便具有两个自旋不配对的电子，即S=1，M=3，分子处于激发的三重态，用符号T表示。

但是S0→T1 禁阻跃迁，通过其他途径进入，进入的几率小；

处于分立轨道上的非成对电子，自旋平行要比自旋配对更稳定些(洪特规则)，因此在同一激发态中，三重态能级总是比单重态能级略低。

处于激发态的分子是很不稳定的，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁的形式去活化(去激发)释放出多余的能量而返回基态。

辐射跃迁主要涉及到荧光，延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁是指以热的形式释放多余的能量，包括振动弛豫、内转化、系间跨越及外转化等过程。图14.2表示分子激发和去活化的能量传递过程：

1．振动弛豫（Vibration relaxation，简写为VR）

当分子吸收光辐射(为图14.2中的λ1、λ2)后可能从基态的最低振动能级(V=0)跃迁到激发单重态S n(如图中S1、S2)的较高振动能级上。然后，在液相或压力足够高的气相中，分子间的碰撞几率很大，分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周围环境，而自身从激发态的高振动能级跃迁至该电子能级的低振动能级上，这个过程称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间为10－12s数量级。

2．内转化（Internal conversion，简写为IC）

当高电子能级中的低振动能级与低电子能级中的高振动能级发生重叠时，常发生电子从高电子能级以无辐射跃迁形式转移至低电子能级。如图14.2中，S2和T2中的低振动能级与S1和T1中的高振动能级重叠，电子可以通过振动能级的重叠从S2跃迁至S1，或从T2跃迁至T1。这个过程称为内部转移。内部转移的时间为10－11s～10－13s数量级。振动弛豫及内转化的速率比由高激发态直接发射光子的速率快得多，所以，分子吸收辐射能后不管激发到哪一个激发单重态，都能通过振动弛豫及内部转移而跃迁到最低(第一)激发单重态的最低振动能级。

4．系间跨跃（Intersystem Crossing，ISC）

系间跨跃是指不同多重态之间的无辐射跃迁过程，它涉及到受激发电子自旋状态的改变。如由第一激发单重态S1跃迁至第一激发三重态T1，使原来两个自旋配对的电子不再配对。这种跃迁是禁阻的(不符合光谱选律)，但如果两个能态的能层有较大重叠时，如图14.2中S1的最低振动能级与T1的较高振动能级重叠，就有可能通过自旋一轨道耦合等作用实现这一跃迁。系间跨跃的速度较慢，经历的时间较长。

6．外转化（External convertion，EC）

激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子相互碰撞，并发生能量转移的过程称为外部转移。外部转移能使荧光或磷光的强度减弱甚至消失，这种现象称为猝灭。

3．荧光发射（Fluorescence emission，FE）S1---S0

处于激发单重态的电子经振动弛豫及内部转移后到达第一激发单重态(S1)的最低振动能级(V=0)后，以辐射的形式跃迁回基态(S0)的各振动能级，这个过程为荧光发射，发射的荧光波长为。由于经过振动弛豫和内部转移的能量损失，因此荧光发射的能量比分子吸收的能量要小，荧光发射的波长比分子吸收的波长要长，这一现象被称为Stokes位移。而这个发光过程的速率常数较大，第一激发单重态最低振动能级的平均寿命约为10－9～10－4s，因此

荧光寿命也在这一数量级。

5．磷光发射（Phosphorescence emission，PE）T1→S0

之前说S0→T1 禁阻跃迁，通过其他途径进入，进入的几率小

S0 →激发到S2的振动能级→振动弛豫到S2的最低振动能级→内转化S1的振动能级→振动弛豫到S1的最低振动能级→系间跨越到T1的振动能级→振动弛豫到T1的最低振动能级

激发态的电子经系间跨跃后到达激发三重态，经过迅速的振动弛豫而跃迁至第一激发三重态的最低振动能级，然后以辐射形式跃迁回基态的各振动能级，这个过程为磷光发射。磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻的，所以发光速度很慢。磷光的寿命为10－4～100s。因此，外光源照射停止后，磷光仍可持续一短时间。由于经过系间跨跃及T1中振动弛豫丢失了一部分能量，所以磷光波长比荧光波长要长，即

必须指出的是，T1还可能通过热激发而重新跃回S1即T1S1，然后再由S1经辐射跃迁回S0，即S1S0，发出荧光，这种荧光称为延迟荧光，其寿命与磷光相近，但波长比磷光短。

\二、分子产生荧光必须具备的条件

（1）具有合适的结构；

（2）具有一定的荧光量子产率。

荧光量子产率（ ）：

具有合适的结构；

在已知大量的有机化合物当中，仅有一小部分会发射强的荧光，这与有机化合物的结构密切相关。能发射强荧光的有机化合物通常具有以下的结构特征：

1. 具有电子跃迁类型的结构

实验表明，大多数能发荧光的化合物都是由或跃迁激发，然后经过振动弛豫等无辐射跃迁，再发生或跃迁而产生荧光。而其中吸收时跃迁的摩尔吸光系数比跃迁的大102～103倍，跃迁的寿命(10－7～10－9)比跃迁的寿命(10－5～10－7)短，因此荧光发射的速率常数K f值较大，荧光发射的效率高。因此，跃迁发射荧光的强度大。此外，在跃迁过程中，通过系间跨跃从单重态跃迁至三重态的速率常数K ISC也比较小，有利于荧光的发射。总之，跃迁的

类型是产生荧光的最主要跃迁类型。

2. 具有大的共轭π键结构

发生荧光(或磷光)的物质，其分子都含有共轭双键(π键)的结构体系，因为共轭体系含有容易被激发的非定域π电子。共轭体系越大，电子的离域性越大，越容易被激发，荧光强度往往也较强，且荧光光谱向长波移动。

同一共轭环数的芳族化合物，线性环结构者的荧光波长比非线性者要长，如蒽和菲，其共轭环数相同，前者为线性环结构，后者为“角”形结构，前者λem为400nm，后者λem 为350nm。

3. 具在刚性平面结构

实验发现，多数具有刚性平面结构的有机化合物分子都具有强烈的荧光，因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其他溶质分子之间的相互作用减少，即可减少能量外部转移的损失，有利于荧光的发射。酚酞与荧光黄(亦称荧光素)的结构十分相近(下图所示)，只是由于荧光黄分子中的氧桥使其具有刚性平面结构，因而在溶液中呈现强烈的荧光，而酚酞却没有荧光。又如芴与联二苯(下图所示)，由于芴中的亚甲基使分子的刚性平面增加，导致两者在荧光性质上的显著差别，前者荧光产率接近于1，后者仅为0.18。萘与维生素A 都具有5个共轭π键(下图所示)，而前者为平面结构，后者为非刚性结构，因而前者的荧光强度为后者的5倍。

4. 取代基的影响

取代基的性质(尤其是生色基团)对荧光体的荧光特性和强度均有强烈的影响。芳烃及杂环化合物的荧光激发光谱、发射光谱及荧光效率常随取代基的不同而异，由于目前对于激发态分子的性质了解还很不够，尚不能真正从机制上揭开其影响的秘密。其影响规律多出自实验总结和推测。表14.2列出了部分取代基对苯的荧光特性的影响情况。

取代基的影响主要有以下几个方面。

★ 给电子取代基使荧光加强

属于这类基团的有－NH 2，－NHR ，－NR 2，－OH ，－OR ，－CN 等。由于这些基团上的n 电子云几乎与芳环上的π电子轨道平行，因而实际上它们共享了共轭π电子，形成了p ～π共轭，扩大共轭体系。因此，这类化合物的荧光波长变长，荧光强度增大。

★ 吸电子基团使荧光减弱而磷光增强

属于这类基团的有如羰基(－COOH ，－CHO ，)，硝基(－NO 2)及重氮基等。他们

也有n 电子，但n 电子云与芳环上的π电子云不共平面。这类基团都会发生

跃迁，属于禁阻跃迁，所以摩尔吸光系数小，荧光发射也弱，而

的系间跨跃较为强烈，

同样使荧光减弱，相应磷光增强。

★ 取代基位置的影响 取代基位置对芳烃荧光的影响通常为：邻位，对位取代者增强荧光，间位取代者抑制荧光(－CN 取代基例外)。取代基的空间阻碍对荧光也有明显的影响。如下面化合物萘环上的8位引入－SO 3－

基时，由于空间阻碍使－NR 2与萘之间的键扭转而减弱了平面构型，影响了p

～π

共轭，导致荧光的减弱。同样，1,2－二苯乙烯的反式异构体是强荧光物质，而顺式异构体不发射荧光。

具有一定的荧光量子产率

荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转化过程速度快，不出现荧光发射； 四、影响荧光强度的环境因素

影响荧光强度的因素除了荧光物质的本身结构及其浓度以外，环境也是一个很重要的因素，主要是溶剂、温度、介质酸度、氢键的形成及其它的因素。

1. 溶剂的影响

同一种荧光体在不同的溶剂中，其荧光光谱和荧光强度都可能会有显著的差别，尤其是那些在芳环上含有极性取代基的荧光体，它们更容易受到溶剂的影响。溶剂的影响一般分为一般的溶剂效应和特殊的溶剂效应。

● 一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。这种影响是普遍存在的。一般情况下，折射率加大，将使荧光光谱的Stokes 位移减小，而介电常数加大，将使Stokes 位移加大，且荧光效率提高。

●

特殊溶剂效应指的是荧光体与溶剂分子的特殊化学作用，如溶剂的极性、氢键。特

吸收的光量子数

发射的光量子数=ϕ

殊溶剂效应对荧光光谱及强度的影响往往大于一般溶剂效应。

对于荧光发射的主要电子跃迁类型跃迁来说，电子激发态比基态具有更大的极性，所以随着溶剂极性的增大，对激发态比对基态产生更大的稳定作用，因此降低了

跃迁的能量，荧光光谱发生红移，而且荧光增强。

荧光物质与溶剂分子或其他溶质分子所形成的分子间氢键可能有两种情况：一种是在激发之前荧光体的基态所形成的氢键，这种情况一般使摩尔吸光系数ε增大，即吸收增强，因此荧光强度增大。同时也可能发生分子极性及共轭程度的变化，因此吸收光谱(荧光激发光谱)及荧光发射光谱都可能发生变化。另一种情况是激发之后荧光体的激发态所形成的氢键，所以吸收光谱(激发光谱)不受影响，而荧光发射光谱会发生变化。

2. 温度的影响

温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。通常，随着温度的增高，荧光物质溶液的荧光量子产率及荧光强度将降低，图14.7为不同温度下邻菲啰啉的荧光光谱。

图14.7 不同温度下邻菲啰啉的

荧光光谱（在邻二苯中）

当溶液不存在猝灭剂时，荧光的量子产率与去激化的辐射跃迁过程及非辐射跃迁过程的相对速率有关。一般认为辐射过程速率不随温度变化，因此，荧光量子产率的变化反映了非辐射跃迁过程速率的变化。随着溶液温度的升高，介质粘度降低，分子运动速率也变大，从而使荧光分子与溶剂分子或其它分子的碰撞几率增加，外部能量转移速率变大。因此，荧光量子产率降低。溶液温度上升而使荧光强度降低的另一个主要原因是分子的内部能量转化作用。多原子分子的基态和激发态的位能曲线可能相交或相切于一点，如图14.8所示。

图14.8 内部能量转化的位能曲线

当激发态分子接受到额外热能而沿激发位能曲线AC移动至交点C时，有可能转换至基态的位能曲线NC，使激发能转化为基态的振动能，随后通过振动弛豫而丧失振动能量。3．介质酸度的影响

带有酸性基团或碱性基团的大多数芳香族化合物，其荧光特性都与溶液的酸度(pH)有关。这是因为在不同酸度介质条件下，荧光体的存在型体不同，不同的型体(分子与其离子)在电子构型上有所不同，而且基态和激发态所表现出来的酸、碱性也有所差别。因此不同酸度下，荧光光谱和荧光强度都可能发生变化。所以在荧光分析中一般都要较严格地控制溶液的pH值。下列为两个实例：

利用金属离子与有机试剂反应生成螯合物而进行荧光测定时，也受到溶液pH的影响。一方面pH会影响螯合物的生成和稳定性，另一方面还可能影响螯合物的组成，因而影响它们的荧光特性。例如，Ga3+与2，2’-二羟基偶氮苯在pH3-4溶液中生成1：1的配合物，它能发射荧光；而在pH6-7溶液中则生成1：2的配合物，它不发射荧光。

4. 其他方面影响

表面活性剂的存在对荧光光谱及强度都会产生影响。荧光体在由表面活性剂形成胶束的微环境中，不仅可以减少非辐射去激化过程和猝灭过程的速率，提高荧光量子产率，而且由于表面活性剂参与组成配合物而增大分子的有效吸光截面积，导致摩尔吸光系数的增大。因此，在胶束溶液中，荧光强度增强，测定的灵敏度提高。多元配合物的形成通常也可以增强荧光强度，提高荧光测定的灵敏度。

五、荧光的猝灭

荧光的猝灭(熄灭)一词，从广义上说，指的是任何可使某给定荧光物质的荧光强度降低的作用，或者任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用。从狭义上说，指的是荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子之间的相互作用，导致荧光强度降低的现象。与荧光物质发生相互作用而使荧光强度降低的物质，称为猝灭剂。荧光猝灭的形式很多，机理也比较复杂。主要有如下几种类型：

1. 碰撞猝灭

碰撞猝灭是荧光猝灭的主要类型之一。它指的是处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子Q 相碰撞，使释放热量给环境，以无辐射的形式跃迁回基态，产生猝灭作用，这种猝灭也称动态猝灭。这一过程可以表示如下：

根据荧光量子产率的定义，在无Q 时的量子产率φ0及Q

存在时的量子产率φq 分别为:

则无Q 时的荧光强度(I f )0及Q 存在时的荧光强度(I f )q 之比为:

式中，K 称为猝灭速率常数，，可以推得，K 与热力学温度T 成正比，与溶液的粘度成反比。可见，碰撞猝灭效应随温度的升高而增强，而随粘度的增大而降低。

2. 生成化合物的猝灭

生成化合物的猝灭也称为静态猝灭，它指的是基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光

的化合物，导致荧光的猝灭，可用下式表示：

从上式也容易推导出荧光强度与猝灭剂平衡浓度之间的关系：

式中(I f)0及(I f)q分别为加入猝灭剂Q之前及之后的荧光强度，C M为荧光物质的总浓度。上式与动态猝灭的关系式一样，只是常数K的意义不同。利用上面的关系式可以用于荧光猝灭法的定量分析。

3. 能量转移猝灭

当猝灭剂吸收光谱与荧光体的荧光光谱有重叠时，处于激发单重态的荧光体激发分子的能量就可能转移到猝灭剂分子上，或者猝灭剂吸收了荧光体发射的荧光，使荧光猝灭，而猝灭剂被激发，这种猝灭俗称“内滤作用”。可用下式表示：

4. 氧的猝灭

O2可以说是荧光和磷光的最普遍存在的猝灭剂。对于溶液磷光来说，氧的猝灭作用是十分有效的，通常观察不到溶液的室温磷光现象。而对于溶液荧光来说，不同的荧光物质或同一荧光物质在不同的溶剂中，对氧的猝灭作用的敏感性有所不同。氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，还没有一个完整的确定说法，可能包含着多种机理。有的认为可能是由于三重态的氧分子和激发单重态的荧光分子相互作用形成激发单重态的氧分子和激发三重态的荧光分子所引起的，如下式表示：

也有的认为氧和其它顺磁性的物质一样，它们之所以会使荧光猝灭，是由于它们能够促进激发单重态的荧光分子的系间跨跃()以及提高荧光物质基态分子的系间吸收跃迁()的几率；还有的认为荧光猝灭是由于荧光物质受到氧化的缘故。

6. 荧光物质的自猝灭

当荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低，荧光强度与浓度不成线性关系，称为荧光物质的自猝灭。

荧光物质的自吸收，当荧光物质的吸收光谱与荧光发射光谱重叠时，会发生自吸收现象，处于S1激发态的分子发射的荧光被处于基态的分子所吸收，使荧光强度降低。