蛋白纯化步骤

引言：

蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其结构和功能对于维持生命活动至关重要。为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们需要将蛋白质从复杂的混合物中纯化出来。蛋白纯化是一项复杂而重要的实验步骤，本文将介绍常用的蛋白纯化步骤。

一、细胞裂解和收集

蛋白纯化的第一步是将含有目标蛋白质的细胞裂解，并将目标蛋白质收集起来。常用的细胞裂解方法包括机械破碎、超声波破碎和渗透破碎等。裂解后，通过离心等方法将蛋白质从其他细胞组分中分离出来。

二、沉淀和上清液分离

细胞裂解后蛋白质溶液中可能存在大量杂质，需要通过沉淀与上清液分离的方法去除。常用的方法包括盐析法、有机溶剂沉淀法和凝胶渗析法等。这些方法可以根据蛋白质的特性选择合适的杂质去除方法。

三、蛋白质分子量筛选

蛋白质纯化过程中，通常需要对蛋白质进行分子量筛选。这样可以去除低分子量的杂质和蛋白质降解产物。常用的方法包括凝胶过滤法、凝胶电泳法和离子交换色谱法等。

四、亲和纯化

亲和纯化是一种常用的蛋白纯化方法，该方法利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用进行纯化。亲和基质可以是抗体、金属离子、亲和标签等。通过将亲和基质与目标蛋白质结合，再通过洗脱等步骤将目标蛋白质从杂质中分离出来。

五、离子交换层析

离子交换层析是一种基于蛋白质与离子交换基质之间的静电作用力进行纯化的方法。根据蛋白质的电荷性质，可以选择合适的离子交换基质和缓冲液条件，使目标蛋白质与基质发生相互作用。通过调整离子浓度和pH值，可以实现目标蛋白质与基质的分离。

六、凝胶过滤层析

凝胶过滤层析是一种根据蛋白质的分子量进行纯化的方法。通过选择合适的凝胶基质和孔径，可以使目标蛋白质从较大分子量的杂质中分离出来。这种方法适用于蛋白质的富集和浓缩。

七、逆流层析

逆流层析是一种根据蛋白质的亲和性进行纯化的方法。该方法利用逆流层析柱中填充的亲和基质与目标蛋白质之间的特异性相互作用进行纯化。通过调整流动相的条件，可以实现蛋白质的吸附和洗脱，从而分离目标蛋白质。

八、凝胶电泳

凝胶电泳是一种常用的蛋白质分子量分析方法，也可以用于蛋白质的纯化。通过将蛋白质样品在凝胶电泳中进行分离，可以根据蛋白质的迁移速度和分子量来判断目标蛋白质的纯度和分子量。

结论：

蛋白纯化是一项复杂而重要的实验步骤，不同的蛋白质可以选择不同的纯化方法。细胞裂解和收集、沉淀和上清液分离、蛋白质分子量筛选、亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤层析、逆流层析和凝胶电泳是常用的蛋白纯化步骤。通过合理地选择和组合这些步骤，可以获得高纯度的目标蛋白质，为后续的蛋白质研究提供可靠的基础。

蛋白纯化步骤

蛋白纯化步骤引言：蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其结构和功能对于维持生命活动至关重要。为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们需要将蛋白质从复杂的混合物中纯化出来。蛋白纯化是一项复杂而重要的实验步骤，本文将介绍常用的蛋白纯化步骤。一、细胞裂解和收集蛋白纯化的第一步是将含有目标蛋白质的细胞裂解，并将目标蛋白质收集起来。常用的细胞裂解方法包括机械破碎、超声波破碎和渗透破碎等。裂解后，通过离心等方法将蛋白质从其他细胞组分中分离出来。二、沉淀和上清液分离细胞裂解后蛋白质溶液中可能存在大量杂质，需要通过沉淀与上清液分离的方法去除。常用的方法包括盐析法、有机溶剂沉淀法和凝胶渗析法等。这些方法可以根据蛋白质的特性选择合适的杂质去除方法。三、蛋白质分子量筛选蛋白质纯化过程中，通常需要对蛋白质进行分子量筛选。这样可以去除低分子量的杂质和蛋白质降解产物。常用的方法包括凝胶过滤法、凝胶电泳法和离子交换色谱法等。

四、亲和纯化亲和纯化是一种常用的蛋白纯化方法，该方法利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用进行纯化。亲和基质可以是抗体、金属离子、亲和标签等。通过将亲和基质与目标蛋白质结合，再通过洗脱等步骤将目标蛋白质从杂质中分离出来。五、离子交换层析离子交换层析是一种基于蛋白质与离子交换基质之间的静电作用力进行纯化的方法。根据蛋白质的电荷性质，可以选择合适的离子交换基质和缓冲液条件，使目标蛋白质与基质发生相互作用。通过调整离子浓度和pH值，可以实现目标蛋白质与基质的分离。六、凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种根据蛋白质的分子量进行纯化的方法。通过选择合适的凝胶基质和孔径，可以使目标蛋白质从较大分子量的杂质中分离出来。这种方法适用于蛋白质的富集和浓缩。七、逆流层析逆流层析是一种根据蛋白质的亲和性进行纯化的方法。该方法利用逆流层析柱中填充的亲和基质与目标蛋白质之间的特异性相互作用进行纯化。通过调整流动相的条件，可以实现蛋白质的吸附和洗脱，从而分离目标蛋白质。

四种蛋白纯化方法

四种蛋白纯化方法 1. 溶液沉淀法溶液沉淀法是一种常用的蛋白纯化方法，适用于从复杂的混合物中分离目标蛋白。该方法基于蛋白质在不同条件下的溶解度差异，通过添加盐类或有机溶剂来诱导蛋白质的沉淀。步骤： 1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到含有目标蛋白的混合物。 2.溶解度测试：在不同条件下（如pH、温度、盐浓度等）测试目标蛋白质的溶解度，并确定最适合其沉淀的条件。 3.沉淀：根据前一步骤确定的最佳条件，向样品中添加盐类或有机溶剂，使目标蛋白质发生沉淀。可以通过离心将沉淀物与上清液分离。 4.溶解：将沉淀物重新溶解在适当的缓冲液中，得到纯化后的目标蛋白。优点： •简单易行，不需要复杂的设备和操作。 •适用于从复杂混合物中纯化目标蛋白。缺点： •可能会导致非特异性沉淀，使得纯化后的蛋白含有杂质。 •沉淀方法对蛋白质的溶解度要求较高，不适用于所有蛋白。 2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于分子大小的蛋白纯化方法，适用于分离不同分子量范围的蛋白。该方法利用孔径可调的凝胶柱或膜来分离目标蛋白和其他小分子。步骤： 1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到含有目标蛋白的混合物。 2.凝胶柱选择：根据目标蛋白的分子量范围选择合适孔径的凝胶柱或膜。 3.样品加载：将样品加载到凝胶柱上，并使用缓冲液进行洗涤，以去除小分子。

4.蛋白洗脱：通过改变缓冲液的组成或pH值，使目标蛋白从凝胶柱上洗脱下来。 5.收集纯化蛋白：将洗脱得到的蛋白收集起来，即可得到纯化后的目标蛋白。优点： •可以根据分子量范围选择合适的凝胶柱，实现高效分离。 •纯化后的蛋白质纯度较高。缺点： •操作相对复杂，需要一定的专业知识和技术。 •只适用于分子量差异较大的目标蛋白。 3. 亲和层析法亲和层析法是一种基于生物分子间特异性相互作用的蛋白纯化方法，适用于富含目标蛋白的混合物。该方法利用目标蛋白与特定配体之间的亲和力进行分离和纯化。步骤： 1.配体固定：将具有亲和力的配体固定在石英珠、琼脂糖等载体上，并填充在层析柱中。 2.样品加载：将待纯化的样品加载到层析柱中，目标蛋白与配体发生特异性结合。 3.洗脱：通过改变缓冲液的组成或pH值，使目标蛋白与配体解离，从而洗脱下来。 4.收集纯化蛋白：将洗脱得到的蛋白收集起来，即可得到纯化后的目标蛋白。优点： •可以实现高选择性的分离和纯化。 •纯化后的蛋白质纯度较高。缺点： •需要特定的配体和载体进行固定，成本较高。 •需要对目标蛋白和配体之间的亲和力进行研究和优化。 4. 离子交换层析法离子交换层析法是一种基于生物分子电荷差异的蛋白纯化方法，适用于具有不同电荷特性的目标蛋白。该方法利用离子交换树脂对样品中带电物质进行吸附和洗脱。

蛋白质纯化实验步骤

蛋白质纯化实验步骤引言: 蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。二、离心将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。三、初步分离将离心后的上清液取出，进行初步分离。可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。四、亲和层析

亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据

蛋白质分离纯化步骤

一、蛋白质分离纯化的一般原则大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。

力不均而使细胞破碎。 5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 (三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。（―）蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使

大量纯化蛋白的简易步骤

纯化蛋白的简易步骤纯化 1.配制培养基LB, 挑取菌种至含有抗生素的LB液体培养基中(50ml+1管菌种)，37 ℃ 220 rpm培养。 2.取10mL培养的菌液转接到1000 mL新鲜的LB抗性培养基中，37 ℃220 rpm培养至 OD600≈0.4-0.5。 3.将培养箱温度调至20℃，转速调至180rpm，继续培养约0.5h-1h（取出1mL菌液作为诱导前对照）。之后加入1 M IPTG至终浓度为0.1-1 mM（本次实验的浓度为0.1mM），继续诱导培养大约9-10小时（取出1mL菌液作为诱导后对照）。 4.4℃，4000rpm离心，15min收集菌体。沉淀可冻于-80℃保存（做蛋白结晶尽量不要冻存）。 5.配制buffer A，如下 6.加入适当的buffer A （含有100mM PMSF 1：100、10mg/mL Dnase 1: 1000、2M MgCl2 1:2000）。1000mL菌液收的菌，加入30mL即可，太少超声时容易起泡。 7.混匀后冰上放置20Min，期间不时的震荡。混合物使用液压破碎（比超声破碎好）。 8.离心10000rpm，4℃，45min，彻底去除菌体碎片，取上清备用。（一定不要菌体碎片！取4ul+4ulLB 作为binding前的对照） 9.Ni beads的预处理：取适量beads，加入适量的buffer A，如800uL beads（1000mL菌液沉淀）加入1mL buffer A，800rpm，2.5min，洗3次。 10.将步骤6所得的上清与预处理好的beads加入50mL的离心管中，封口膜封口后，静音混匀器4℃binding1-2h（时间过长蛋白易降解）。 11.将binding后的溶液过柱（取4ul+4ulLB 作为binding后的对照），加入10CV wash buffer，放置10min后冲洗（取4ul+4ulLB 作为wash后的对照）。

蛋白纯化方法

2.1天然条件下纯化His标签蛋白缓冲液的准备：建议所有加入到柱中的液体都是用0.45 um滤膜过滤。 LE buffer: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 8.0 Wash Buffer: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 咪唑, pH 8.0 Elution buffer: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM咪唑, pH 8.0 样品准备： 1. 将50-100 ml培养液在4℃，5000 rpm离心5 min，弃上清液。 2. 每50 ml培养液用8 ml预冷的LE buffer重悬沉淀，加入合适的蛋白酶抑制剂如PMSF （蛋白酶抑制剂需要对树脂无影响） 3. 冰上超声破碎，180 V，超一秒停三秒，直到样品不再粘稠。 4. 4℃，12000 g离心15 min除去细胞碎片，将上清液用0.45 um滤膜过滤后即可上样。取10 ul上清样品和10 ul沉淀样品，留作SDS-PAGE分析检测His融合蛋白的量和表达形式（溶解性）。柱子准备： 1. 将装有resin的小瓶轻柔颠倒数次以彻底重悬树脂。 2. 转移合适的树脂量到柱中，待树脂沉降后将储存缓冲液放掉。通常取2 ml 50% slurry （沉降后有1 ml树脂）可以结合20 mg His标签蛋白。 3. 使用4倍床体积的LE buffer平衡树脂。柱子纯化步骤： 1. 上样：将含有His融合蛋白的上清液以0.5-1 ml/min的流速上样。 2. 洗杂：所有样品上样结束后，加入8倍床体积的Wash Buffer洗涤，流速：1 ml/min 3. 洗脱：用5-10倍床体积的Elution buffer洗脱His融合蛋白，流速：0.5-1 ml/min 4. 收集10-20 ul 上样后流出液、洗杂液、洗脱液，用SDS-PAGE分析确认目标蛋白的量。 5. 根据目的蛋白的后续应用，决定是否需要4℃透析（透析液：20 mM Tris‐HCl, pH 8.0 或1 × PBS, pH 7.4） 2.2变性条件下的纯化方式目的蛋白主要以包涵体形式表达。缓冲液的准备：

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT—PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3)、Rosetta gami(DE3）、Bl21 codon（DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2）SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达.注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50％以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10％甘油保种，保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。甘油是用0。22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60％,使用时自己计算用量。 4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度，低转速（140—180rpm)，诱导过夜作为包涵体检测样品. 注意:1。如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达.葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达，则扩大摇菌。 1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD〉=1.5，约5h左右,视菌种

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤（待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total—RNA. 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA。 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒. 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3)、Rosetta gami（DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0。6左右，加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达）。 2)SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50％以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带. 3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围. 甘油是用0。22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30％—60％，使用时自己计算用量. 4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度,低转速(140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融. 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度，300rpm摇至OD>=1。5，约5h左右，视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。 2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约 2。5h～3h)，然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。 3）过夜摇菌,使用包涵体检测的温度（18°左右)，转速140rpm左右. 4）将菌液6000rpm,4min，4度离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。可用4支50ml 的离心管同时离心，但是,离心管要重复使用，用完后洗净保存。 10、超声波裂解. 1）用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作，7s休息，50min即可. 注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡. 4.正常声音为:孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因,要及时调整.溶液由浑浊变清透,由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min(即关闭总电源开关）。注意：1。如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂(PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解 60分钟，60分钟足够裂解.

蛋白表达纯化试验步骤

1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA 。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽, 要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、R T-PCR,KO［酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5z感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株, 挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3) 、Rosetta gami(DE3) 、Bl21 codon(DE3) 等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至0。=左右，加入IPTG,浓度梯度从25卩M 到1m 37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。甘油是用卩m过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽, 不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50卩l 一管，每次用一管，避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件 2 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=约5h左右,视菌种

1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA 。 9、如有上清表达, 则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=约5h左右,视菌种

蛋白纯化步骤

纤溶（溶栓）酶的分离及其性质研究血栓是一种严重危害人类尤其是中老年人身体健康和生命的疾病，近年来发病率逐年增加，已成为常见病和多发病，是造成死亡和病残的首要原因。纤溶酶对纤维蛋白（原）具有专一水解活性，纤溶酶作为溶栓药物可以降解血栓骨架结构——纤维蛋白多聚体，从而达到溶解血栓栓子的目的，因此，药物溶栓是目前临床上治疗血栓性疾病的首选策略。对“理想”溶栓药物的要求是：快速溶栓，对纤维蛋白特异，只作用于血栓而全身反应低，效力持久；出血危险性低；无全身性副反应，无抗原性，避免全身性纤溶、价廉等。目前对溶栓药物研究工作主要从两方面开展，一是应用基因工程和单克隆抗体技术对现有药物进行改造使之更理想；另一方面是开发新型天然来源的溶栓药物。近几年，寻找天然来源的纤溶酶也成了一个研究热点。在动物、植物、海洋生物、微生物中都发现了天然的溶栓物质。在动物来源的纤溶酶中，人们研究较多的是从蚯蚓、蛇毒和蝙蝠的唾液及吸血动物中提取的纤溶酶；植物来源的纤溶酶主要是从丹参和蒲黄中提取；微生物更是纤溶酶的一种重要来源，如目前临床应用的溶栓药物链激酶、葡激酶、纳豆激酶等；在细菌、真菌、藻类中还发现了多种新型纤溶酶。从作用机理上纤溶酶分成两类：一类是纤溶酶原激活剂，能将纤溶酶原激活为纤溶酶而降解纤维蛋白（原）；另一类是纤溶酶类活性物质，直接可以降解纤维蛋白（原）；都具有溶解血栓的作用（见下图）。发现和筛选新型来源的纤溶酶是研发溶栓药物的基础，利用基因工程技术或蛋白质工程技术改造天然纤溶酶制成变异体、嵌合体或导向药物，是提高纤溶酶的选择性溶栓效果，延长半衰期，减少用药剂量和变态反应，降低成本的重要手段。制药工程研究室已从土壤中筛选出70多株纤溶酶产生菌，上学期的毕业生对其中9株菌进行了鉴定，并提取了外泌蛋白，检测后其中6（30—60），6（60—90），15（20—90），31（30—60），31（60—90），45（20—90），50（20—90），55（20—90），70（30—60），70（60—90），72（20—90）（菌号（硫酸铵沉淀浓度））具有纤溶活性。本学期主要工作有： 1. 纤溶酶活性测定：琼脂糖—纤维蛋白平板法 2. 蛋白含量测定：考马斯亮蓝法 →比活力测定 3. 分离和纯化：离子交换层析DEAE Sepharose 或CM-Sepharose 4. SDS-PAGE 电泳：硝酸银染色和考马斯亮蓝G-250染色, 检测分子量大小和分离效果。 5. 活性电泳：检测活性带位置， 6. 等电聚焦电泳：分离纤溶蛋白、测定等电点 7. 转膜、测序纤溶酶原激活剂纤溶酶原纤溶酶纤维蛋白原或纤维蛋白（血栓栓子）纤维蛋白原降解物(FgDP)或纤维蛋白降解物(FDP) （血栓溶解）血栓的溶解过程

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤〔待改良〕 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因cDNA. 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21〔DE3〕、Rosetta gami〔DE3〕、 Bl21 codon〔DE3〕等。 7、蛋白的诱导表达。 1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，参加IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会到达菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度围。甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。 4）用上述IPTG浓度围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速〔140-180rpm〕，诱导过夜作为包涵体检测样品。注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中参加1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2. 保种可以取一局部分成50μl一管，每次用一管，防止反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达，那么扩大摇菌。 1）取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。 2）将上一步中的8ml参加300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右〔约 2.5h~3h〕，然后加IPTG〔浓度同包涵体检测中使用的浓度。〕注：菌液浓度要适当的浓一些，否那么第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。 3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度〔18°左右〕，转速140rpm左右。 4）将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体。参加20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。 10、超声波裂解。 1）用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比拟大的时候不会出现大量气泡。 4.正常声音为：孜孜声，锋利刺耳的声音说明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因，要与时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠说明裂解完成〔后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好〕。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min〔即关闭总电源开关〕。注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂〔PMSF〕，PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60

天然蛋白纯化的基本流程

天然蛋白纯化的基本流程一、引言天然蛋白纯化是生物化学和生物技术领域中的重要研究内容之一。蛋白质作为生物体内功能性分子的基本组成部分，其纯化和分离对于研究蛋白质的结构、功能和生物学特性具有重要意义。本文将介绍天然蛋白纯化的基本流程。二、样品制备天然蛋白纯化的第一步是样品制备。通常，我们需要从生物体中提取蛋白质样品。提取方法的选择取决于样品的来源和特性。常见的提取方法包括机械破碎、超声波破碎、化学法和生物法等。在提取过程中，需要注意保持样品的完整性和稳定性，以确保蛋白质的纯度和活性。三、初步分离在样品制备之后，需要进行初步分离。初步分离的目的是将蛋白质与其他生物大分子（如核酸、多糖等）分离开来。常用的初步分离方法包括离心、过滤、电泳和层析等。离心通过调节离心力和离心时间，可以将蛋白质从细胞碎片、细胞核和细胞器中分离出来。过滤则是利用孔隙大小的差异，将蛋白质和其他生物大分子分开。电泳是利用蛋白质在电场中的迁移速度差异进行分离，常见的电泳方法有SDS-PAGE和等电聚焦。层析则是利用不同蛋白质在固定相和

流动相之间的亲和性差异进行分离。初步分离后，可以得到蛋白质的粗提物。四、纯化策略在初步分离得到蛋白质的粗提物之后，需要根据具体的研究目的和蛋白质的特性选择合适的纯化策略。常见的纯化策略包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、逆流层析和高效液相色谱等。亲和层析是利用蛋白质与某种配体之间的特异性相互作用进行分离，常见的亲和层析方法有金属螯合层析、免疫亲和层析和亲和吸附层析等。离子交换层析是利用蛋白质与固定相之间的电荷差异进行分离。凝胶过滤层析则是根据蛋白质的分子大小进行分离。逆流层析则是利用溶剂的逆向流动和蛋白质与固定相之间的亲和性差异进行分离。高效液相色谱则是利用溶液在固定相上的流动和蛋白质与固定相之间的亲和性差异进行分离。五、纯化步骤根据选择的纯化策略，进行相应的纯化步骤。在进行纯化步骤时，需要注意控制条件，如pH值、离子浓度、温度等。同时，也需要监测纯化过程中的蛋白质含量和纯度，常用的检测方法有紫外吸收光谱、蛋白质浓度测定、SDS-PAGE电泳和Western blot等。通过逐步纯化，最终可以得到目标蛋白质的高纯度样品。六、纯化评估

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改良) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,参加IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会到达菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中参加1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一局部分成50μl一管,每次用一管,防止反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。 2)将上一步中的8ml参加300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约 2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。拿起锥形瓶对光摇动,看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是,将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。 3)过夜摇菌,使用包涵体检测的温度(18°左右),转速140rpm左右。 4)将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体。参加20mM PBS,洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。可用4支50ml 的离心管同时离心,但是,离心管要重复使用,用完后洗净保存。 10、超声波裂解。 1)用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。注意:1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比拟大的时候不会出现大量气泡。 4.正常声音为:孜孜声,锋利刺耳的声音说明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因,要及时调整。溶液由浑浊变清透,由粘稠变不粘稠说明裂解完成(后面3000转离心时,如果沉淀少说明裂解的好)。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min(即关闭总电源开关)。注意:1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂(PMSF),PMSF 工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全,就按上述条件裂解 60分钟,60分钟足够裂解。