凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程

引言：

蛋白纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤之一。凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过分子大小的差异来分离和纯化目标蛋白。本文将介绍凝胶过滤层析的流程及其应用。

一、凝胶过滤层析的原理

凝胶过滤层析是基于分子大小的差异来分离蛋白的一种方法。该方法利用特定的凝胶材料，通过将待纯化的蛋白溶液加入凝胶柱中，较大分子的蛋白无法渗透进入凝胶内部，而较小分子的蛋白则可以通过凝胶孔道进入凝胶内部。通过这种方式，可以实现对蛋白的分离和纯化。

二、凝胶过滤层析的步骤

1. 准备凝胶柱：选择适当的凝胶材料和柱子，根据待纯化蛋白的分子大小选择合适的孔径。

2. 杂质去除：使用缓冲液预先洗脱凝胶，去除其中的杂质和阻塞物。

3. 样品加载：将待纯化的蛋白溶液加载到凝胶柱中，注意保持柱子的垂直姿势，防止样品泄漏。

4. 洗脱：使用缓冲液进行洗脱，以去除非目标蛋白和杂质。

5. 收集纯化蛋白：将目标蛋白收集，可以使用分级洗脱或直接洗脱的方法。

三、凝胶过滤层析的优势和应用

凝胶过滤层析具有以下优势：

1. 无需特殊设备：相较于其他蛋白纯化方法，凝胶过滤层析不需要昂贵的设备，操作简单方便。

2. 高分辨率：凝胶过滤层析可以实现对不同分子大小的蛋白进行高效分离，得到高纯度的目标蛋白。

3. 适用范围广：凝胶过滤层析适用于各种类型的蛋白，包括酶、抗体、细胞因子等。

凝胶过滤层析在生物学研究中有广泛的应用，主要包括以下方面：1. 蛋白纯化：凝胶过滤层析是常用的蛋白纯化方法之一，可以用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白。

2. 质量控制：凝胶过滤层析可以用于检测蛋白样品的分子大小和纯度，对蛋白质的质量进行评估。

3. 蛋白互作研究：凝胶过滤层析可以用于研究蛋白与其他分子（如核酸或小分子化合物）的相互作用。

4. 蛋白结构分析：凝胶过滤层析可以为蛋白的结构分析提供高纯度的样品。

结论：

凝胶过滤层析是一种简单、快速且高效的蛋白纯化方法，通过分子大小的差异实现对目标蛋白的分离和纯化。该方法在生物学研究中有广泛的应用，可以用于蛋白纯化、质量控制、蛋白互作研究和蛋

白结构分析等领域。凝胶过滤层析的优势和应用使其成为研究人员常用的蛋白纯化方法之一。

蛋白纯化步骤

蛋白纯化步骤引言：蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其结构和功能对于维持生命活动至关重要。为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们需要将蛋白质从复杂的混合物中纯化出来。蛋白纯化是一项复杂而重要的实验步骤，本文将介绍常用的蛋白纯化步骤。一、细胞裂解和收集蛋白纯化的第一步是将含有目标蛋白质的细胞裂解，并将目标蛋白质收集起来。常用的细胞裂解方法包括机械破碎、超声波破碎和渗透破碎等。裂解后，通过离心等方法将蛋白质从其他细胞组分中分离出来。二、沉淀和上清液分离细胞裂解后蛋白质溶液中可能存在大量杂质，需要通过沉淀与上清液分离的方法去除。常用的方法包括盐析法、有机溶剂沉淀法和凝胶渗析法等。这些方法可以根据蛋白质的特性选择合适的杂质去除方法。三、蛋白质分子量筛选蛋白质纯化过程中，通常需要对蛋白质进行分子量筛选。这样可以去除低分子量的杂质和蛋白质降解产物。常用的方法包括凝胶过滤法、凝胶电泳法和离子交换色谱法等。

四、亲和纯化亲和纯化是一种常用的蛋白纯化方法，该方法利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用进行纯化。亲和基质可以是抗体、金属离子、亲和标签等。通过将亲和基质与目标蛋白质结合，再通过洗脱等步骤将目标蛋白质从杂质中分离出来。五、离子交换层析离子交换层析是一种基于蛋白质与离子交换基质之间的静电作用力进行纯化的方法。根据蛋白质的电荷性质，可以选择合适的离子交换基质和缓冲液条件，使目标蛋白质与基质发生相互作用。通过调整离子浓度和pH值，可以实现目标蛋白质与基质的分离。六、凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种根据蛋白质的分子量进行纯化的方法。通过选择合适的凝胶基质和孔径，可以使目标蛋白质从较大分子量的杂质中分离出来。这种方法适用于蛋白质的富集和浓缩。七、逆流层析逆流层析是一种根据蛋白质的亲和性进行纯化的方法。该方法利用逆流层析柱中填充的亲和基质与目标蛋白质之间的特异性相互作用进行纯化。通过调整流动相的条件，可以实现蛋白质的吸附和洗脱，从而分离目标蛋白质。

凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤

凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化技术，可用于分离和富集目标蛋白。其原理是利用凝胶材料的孔隙大小和蛋白分子的大小差异，通过层析柱中的凝胶层对混合蛋白进行分离。这种方法操作简单，效果稳定，是许多实验室常用的蛋白纯化方法之一。下面将详细介绍凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤： 1. 准备工作在开始实验之前，首先需要准备层析柱和凝胶。层析柱可以使用预填充的封闭柱，也可以自己制备。常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶（PAA）和琼脂糖凝胶。根据实验需求和目标蛋白的分子量，选择合适的凝胶孔隙大小。 2. 样品的制备将待纯化的蛋白样品制备好。通常需要将样品溶解于缓冲液中，并添加一定的抑制剂，以防止蛋白的降解和活性丢失。在制备样品时，可以根据需要对蛋白进行特定的标记或修饰。 3. 样品的加载将制备好的蛋白样品加载到层析柱上。可以使用注射器或微量移液器将样品缓慢地滴加到层析柱顶部。为了保证样品的均匀加载，可以在样品前后添加一定量的缓冲液。

4. 蛋白的分离一旦样品加载完毕，蛋白分子将开始在凝胶层中进行分离。较小的蛋白分子能够进入凝胶孔隙，而较大的蛋白分子则无法进入，从而实现了蛋白的分离。分离过程中，可以通过重力流动或离心力来推动样品通过层析柱。 5. 洗脱纯化蛋白待纯化的蛋白通常会与凝胶层中的其他成分发生相互作用，如亲和作用或静电作用。为了洗脱纯化的蛋白，可以使用适当的洗脱缓冲液。洗脱缓冲液中的成分可以改变蛋白与凝胶层之间的相互作用，使蛋白从凝胶中解离出来。 6. 收集纯化蛋白洗脱后的蛋白溶液即为纯化蛋白，可以通过收集溶液进行后续的实验或分析。为了保证蛋白的完整性和活性，收集的溶液应该尽快进行保存或下一步实验。总结：凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过凝胶层的孔隙大小与蛋白分子的大小来实现蛋白的分离。其步骤包括准备工作、样品制备、样品加载、蛋白分离、洗脱纯化蛋白和收集纯化蛋白。这种方法操作简单，适用于不同分子量的蛋白纯化，是许多实验室常用的技术之一。在实验过程中，需要注意样品的制备和加载，以及选择合适的凝胶材料和洗脱缓冲液。通过凝胶过滤层析，可以得到高

凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程

凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程引言：蛋白纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤之一。凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过分子大小的差异来分离和纯化目标蛋白。本文将介绍凝胶过滤层析的流程及其应用。一、凝胶过滤层析的原理凝胶过滤层析是基于分子大小的差异来分离蛋白的一种方法。该方法利用特定的凝胶材料，通过将待纯化的蛋白溶液加入凝胶柱中，较大分子的蛋白无法渗透进入凝胶内部，而较小分子的蛋白则可以通过凝胶孔道进入凝胶内部。通过这种方式，可以实现对蛋白的分离和纯化。二、凝胶过滤层析的步骤 1. 准备凝胶柱：选择适当的凝胶材料和柱子，根据待纯化蛋白的分子大小选择合适的孔径。 2. 杂质去除：使用缓冲液预先洗脱凝胶，去除其中的杂质和阻塞物。 3. 样品加载：将待纯化的蛋白溶液加载到凝胶柱中，注意保持柱子的垂直姿势，防止样品泄漏。 4. 洗脱：使用缓冲液进行洗脱，以去除非目标蛋白和杂质。 5. 收集纯化蛋白：将目标蛋白收集，可以使用分级洗脱或直接洗脱的方法。

三、凝胶过滤层析的优势和应用凝胶过滤层析具有以下优势： 1. 无需特殊设备：相较于其他蛋白纯化方法，凝胶过滤层析不需要昂贵的设备，操作简单方便。 2. 高分辨率：凝胶过滤层析可以实现对不同分子大小的蛋白进行高效分离，得到高纯度的目标蛋白。 3. 适用范围广：凝胶过滤层析适用于各种类型的蛋白，包括酶、抗体、细胞因子等。凝胶过滤层析在生物学研究中有广泛的应用，主要包括以下方面：1. 蛋白纯化：凝胶过滤层析是常用的蛋白纯化方法之一，可以用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白。 2. 质量控制：凝胶过滤层析可以用于检测蛋白样品的分子大小和纯度，对蛋白质的质量进行评估。 3. 蛋白互作研究：凝胶过滤层析可以用于研究蛋白与其他分子（如核酸或小分子化合物）的相互作用。 4. 蛋白结构分析：凝胶过滤层析可以为蛋白的结构分析提供高纯度的样品。结论：凝胶过滤层析是一种简单、快速且高效的蛋白纯化方法，通过分子大小的差异实现对目标蛋白的分离和纯化。该方法在生物学研究中有广泛的应用，可以用于蛋白纯化、质量控制、蛋白互作研究和蛋

蛋白质纯化实验步骤

蛋白质纯化实验步骤引言: 蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。二、离心将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。三、初步分离将离心后的上清液取出，进行初步分离。可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。四、亲和层析

亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据

蛋白质分离纯化步骤

一、蛋白质分离纯化的一般原则大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。

力不均而使细胞破碎。 5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 (三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度

蛋白质凝胶层析柱的洗脱顺序

蛋白质凝胶层析柱的洗脱顺序蛋白质凝胶层析是一种常用的蛋白质分离纯化技术，其原理是利用凝胶层析柱中的凝胶颗粒与蛋白质之间的物理化学互作用实现蛋白质的分离和纯化。在蛋白质凝胶层析中，洗脱顺序是非常重要的，不同的洗脱顺序会对分离和纯化的效果产生明显的影响。下面将详细介绍几种常用的蛋白质凝胶层析柱的洗脱顺序。一、离子交换层析离子交换层析是一种利用离子交换树脂分离和纯化蛋白质的方法。在离子交换层析中，蛋白质与树脂之间的相互作用是通过蛋白质和树脂之间的电荷相互吸引而实现的。树脂表面带有固定电荷，蛋白质通常具有正电荷或负电荷，因此它们可以相互吸附在树脂上。洗脱时，通常采用逐渐增加或减少盐浓度的方法，通过改变离子强度来控制蛋白质的吸附与解吸，实现蛋白质的分离和纯化。离子交换层析的洗脱顺序通常分为以下几步： 1. 预洗：用高盐缓冲液清洗层析柱，去除附着在树脂上的亲和物质和非特异性吸附物。 2. 去除杂质：使用低盐缓冲液洗脱非特异性吸附物，如组织碎片、细胞碎片和核酸等。 3. 分级洗脱：从低盐到高盐逐渐增加缓冲液中的离子浓度，根

据蛋白质的亲和性和亲和强度，逐渐洗脱目标蛋白质。 4. 再生：在蛋白质完全洗脱之后，使用高盐缓冲液再次洗脱树脂上的杂质和非特异性吸附物。 5. 平衡：用平衡缓冲液平衡层析柱，使其恢复初始的交换能力。二、尺寸排阻层析尺寸排阻层析是一种根据蛋白质的大小差异来分离和纯化蛋白质的方法。在尺寸排阻层析中，凝胶层析柱中的凝胶颗粒具有固定的孔径，大分子蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，而小分子蛋白质则可以进入凝胶颗粒内部。因此，大分子蛋白质会流经凝胶颗粒，而小分子蛋白质会进入凝胶颗粒内部，实现二者的分离。尺寸排阻层析的洗脱顺序通常分为以下几步： 1. 预洗：用高盐缓冲液清洗层析柱，去除附着在凝胶颗粒表面的亲和物质和非特异性吸附物。 2. 去除杂质：使用低盐缓冲液洗脱非特异性吸附物，如细胞碎片、核酸等。 3. 分级洗脱：从大孔径到小孔径逐渐减少缓冲液中的孔径，根据蛋白质的大小差异，逐渐洗脱目标蛋白质。 4. 再生：在蛋白质完全洗脱之后，使用高盐缓冲液再次洗脱凝

凝胶层析法脱盐和分离蛋白质(附凝胶过滤法原理及基本操作)-1

凝胶层析法脱盐和分离蛋白质（附凝胶过滤法原理及基本操作）-1 （一）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。所以，要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。（二）试剂与器材（1）Sephadex G-25。（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。（3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘11 0g，汞150g及蒸馏水100ml。用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏水至2000ml，混匀备用。（4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。（5）1.5cm×20cm层析柱。（6）黑、白比色磁盘。（三）操作（1）取层析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口。将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒出去，加入2倍体积的0. 0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex G-25，使凝胶自然沉降

高度到17cm左右，关闭出口。待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.017 5mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。（2）凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将盐析所得全部IgG样品加到凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让IgG样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面上加一层的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右。用试管收集洗脱液，每管10滴。（3）在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。为此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入1滴20%磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀即证明已有蛋白质出现，直到检查不出白色沉淀时，停止收集洗脱液。（4）由经检查含有蛋白质的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盘孔中，加入1滴奈氏试剂，若呈现棕黄色沉淀说明它含有硫酸铵。合并检查后不含硫酸铵的各管收集液，即为“脱盐”后的IgG。注意：在检测时，用皮头滴管吸取管中溶液后应及时洗净，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。附：凝胶过滤法原理及基本操作 1．原理凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatograph y）、分子筛过滤（molecularsieve filtration）、凝胶渗透层析（g el osmotic chromatography）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。

“凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质”生化实验报告

凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质操作人：XXX 时间：XXXX 地点：XXXX 温度：20℃ 实验目的： ①理解凝胶过滤层析的原理。 ②掌握装柱、平衡、上样、柱效检验的方法。 ③学会分析洗脱峰峰型。试验方法与过程： 1.装柱 ①固定层析柱，柱内装1/2双蒸水，双蒸水下降到1/4时，关闭出口。 ②搅拌凝胶浆液，用玻璃棒引流缓慢倒入层析柱，打开出口，让凝胶沉降。 ③装至柱内有2/3凝胶，上层保留至少0.5cm的水。 2.平衡双蒸水平衡柱，管口上接恒流泵、下管接检测仪入口，控制流速。观察紫外检测仪平衡后A280应小于0.01.然后调整流速为2ml/min，暂停恒流泵。 3.加样吸取5%丙酮溶液500ul，沿柱壁缓慢加入，控制出水口管的高度使使样品缓缓进入胶内，用1ml双蒸水冲洗壁上的样品，在加入3-4ml双蒸水后关闭盖子。 4.洗脱凝集打开恒流泵开关，监视紫外检测仪的情况，待丙酮全部流出后加入，加入蛋白质混合物，监视紫外检测仪情况，开始出现上升即开始收集流出液。蛋白质样品全部流出后，用双蒸水冲洗凝胶。原始数据：

图一：从左到右第一个峰为丙酮，第二第三个峰分别为混合物中的两种蛋白质。结果处理与分析： ①根据图像得As略大于1，说明装柱压力不足，可能滤网内有空气进入。 ②由于是先加入丙酮再打开色谱分析软件，所以不能分析到分配系数Kd。 ③在图一黑色箭头所指处色谱曲线出现了抖动，可能是因为在丙酮洗脱过程中打开了层析柱上口，导致空气进入。 ④加入样品后出现两个峰，说明混合样品中有两种大小不同的物质被分离出来。讨论： 1.注意事项：一定要保证凝胶柱上层有液体覆盖，不能使之暴露于空气中；保证所灌凝胶中没有气泡，当有气泡和凝胶有明显分层时3，应在灌胶过程中及时用玻璃棒搅拌去除气泡及使不均匀的凝胶重悬后重新沉淀。 2.经验和心得：用滴管向凝胶柱内加入双蒸水和样品时，一定要沿管壁边旋转边缓慢加入，防止加入时产生压力太大，使凝胶柱上表面不平整；用滴管比用移液枪加样品好，因为滴管产生的压力小。 3.思考题： ①凝胶过滤层析柱的柱效与层析柱内凝胶的均匀程度，凝胶颗粒的完整程度有关。 ②实验中易出现的问题：凝胶柱上层双蒸水流干；加入样品破坏凝胶柱表面平整。

蛋白纯化步骤

纤溶（溶栓）酶的分离及其性质研究血栓是一种严重危害人类尤其是中老年人身体健康和生命的疾病，近年来发病率逐年增加，已成为常见病和多发病，是造成死亡和病残的首要原因。纤溶酶对纤维蛋白（原）具有专一水解活性，纤溶酶作为溶栓药物可以降解血栓骨架结构——纤维蛋白多聚体，从而达到溶解血栓栓子的目的，因此，药物溶栓是目前临床上治疗血栓性疾病的首选策略。对“理想”溶栓药物的要求是：快速溶栓，对纤维蛋白特异，只作用于血栓而全身反应低，效力持久；出血危险性低；无全身性副反应，无抗原性，避免全身性纤溶、价廉等。目前对溶栓药物研究工作主要从两方面开展，一是应用基因工程和单克隆抗体技术对现有药物进行改造使之更理想；另一方面是开发新型天然来源的溶栓药物。近几年，寻找天然来源的纤溶酶也成了一个研究热点。在动物、植物、海洋生物、微生物中都发现了天然的溶栓物质。在动物来源的纤溶酶中，人们研究较多的是从蚯蚓、蛇毒和蝙蝠的唾液及吸血动物中提取的纤溶酶；植物来源的纤溶酶主要是从丹参和蒲黄中提取；微生物更是纤溶酶的一种重要来源，如目前临床应用的溶栓药物链激酶、葡激酶、纳豆激酶等；在细菌、真菌、藻类中还发现了多种新型纤溶酶。从作用机理上纤溶酶分成两类：一类是纤溶酶原激活剂，能将纤溶酶原激活为纤溶酶而降解纤维蛋白（原）；另一类是纤溶酶类活性物质，直接可以降解纤维蛋白（原）；都具有溶解血栓的作用（见下图）。发现和筛选新型来源的纤溶酶是研发溶栓药物的基础，利用基因工程技术或蛋白质工程技术改造天然纤溶酶制成变异体、嵌合体或导向药物，是提高纤溶酶的选择性溶栓效果，延长半衰期，减少用药剂量和变态反应，降低成本的重要手段。制药工程研究室已从土壤中筛选出70多株纤溶酶产生菌，上学期的毕业生对其中9株菌进行了鉴定，并提取了外泌蛋白，检测后其中6（30—60），6（60—90），15（20—90），31（30—60），31（60—90），45（20—90），50（20—90），55（20—90），70（30—60），70（60—90），72（20—90）（菌号（硫酸铵沉淀浓度））具有纤溶活性。本学期主要工作有： 1. 纤溶酶活性测定：琼脂糖—纤维蛋白平板法 2. 蛋白含量测定：考马斯亮蓝法 →比活力测定 3. 分离和纯化：离子交换层析DEAE Sepharose 或CM-Sepharose 4. SDS-PAGE 电泳：硝酸银染色和考马斯亮蓝G-250染色, 检测分子量大小和分离效果。 5. 活性电泳：检测活性带位置， 6. 等电聚焦电泳：分离纤溶蛋白、测定等电点 7. 转膜、测序纤溶酶原激活剂纤溶酶原纤溶酶纤维蛋白原或纤维蛋白（血栓栓子）纤维蛋白原降解物(FgDP)或纤维蛋白降解物(FDP) （血栓溶解）血栓的溶解过程

凝胶过滤层析实验报告

凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告引言：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，广泛应用于蛋白质纯化、分析和富集等领域。本实验旨在通过凝胶过滤层析的方法，对混合蛋白样品进行分离和纯化，探究其原理和应用。材料与方法： 1. 凝胶过滤层析柱：选择合适的分子量截留范围，如10 kDa。 2. 混合蛋白样品：包含多种蛋白质，分子量范围从10 kDa到100 kDa。 3. 缓冲液：选择适当的缓冲液，如PBS。 4. 装载样品：将混合蛋白样品与缓冲液按比例混合，使其浓度适当。实验步骤： 1. 准备凝胶过滤层析柱：将柱子连接到系统中，并进行预洗，以去除残留物和杂质。 2. 样品装载：将装载样品注入凝胶过滤层析柱中，注意不要过载。 3. 层析过程：使用缓冲液进行层析，使样品在柱子中通过，并收集出流液。 4. 收集样品：根据需要，可以分别收集不同分子量范围的样品。结果与讨论：通过凝胶过滤层析实验，我们成功分离并纯化了混合蛋白样品。在层析过程中，不同分子量的蛋白质通过凝胶过滤层析柱时，会受到凝胶孔径的限制，从而分离出不同大小的蛋白质。较大分子量的蛋白质无法通过凝胶孔径，会在柱中滞留，而较小分子量的蛋白质则能够通过凝胶孔径，从柱中流出。

通过收集不同分子量范围的样品，我们可以得到纯化后的蛋白质。这些蛋白质可以进一步进行质谱分析、酶活性检测等实验，以获取更多关于蛋白质的信息。凝胶过滤层析方法具有许多优点。首先，它是一种快速、简单且高效的分离技术。其次，凝胶过滤层析柱具有较高的容量和稳定性，可以处理大量样品。此外，凝胶过滤层析适用于多种样品类型，包括细胞裂解液、培养基和体液等。然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。首先，凝胶孔径的选择需要根据样品的分子量范围来确定，如果样品中存在分子量相近的蛋白质，则可能无法完全分离。其次，凝胶过滤层析无法去除溶液中的小分子物质，如盐离子和小分子有机物，这些物质可能对后续实验产生影响。结论：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，通过分子量选择性分离和纯化蛋白质。本实验通过凝胶过滤层析的方法，成功分离了混合蛋白样品，并获得了纯化后的蛋白质。凝胶过滤层析具有快速、简单和高效的特点，适用于多种样品类型。然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性，需要根据实际情况进行选择和优化。在今后的研究中，我们将进一步探索凝胶过滤层析的应用，并结合其他技术手段，提高分离和纯化的效果。

凝胶过滤层析步骤

凝胶过滤层析步骤凝胶过滤层析是一种常用的色谱技术，广泛应用于生物分离和分析领域。下面将介绍凝胶过滤层析的步骤。一、样品制备在进行凝胶过滤层析之前，首先需要准备样品。样品可以是生物大分子，如蛋白质、核酸等。样品需要在适当的缓冲液中溶解，并进行必要的预处理，如去除杂质、浓缩等。二、凝胶选择凝胶过滤层析中常用的凝胶材料有几种，如琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。在选择凝胶时，需要考虑样品的分子大小、分子量范围以及分离的目的等因素。不同的凝胶材料具有不同的孔隙结构和分子筛效果，因此需要根据实验要求选择合适的凝胶。三、制备凝胶柱凝胶过滤层析通常需要制备凝胶柱。制备凝胶柱的方法有很多种，常见的有手工制备和使用专用的凝胶柱填充器。制备凝胶柱时需要注意填充均匀、不产生气泡和空隙等问题。四、样品加载将制备好的样品加载到凝胶柱中。加载样品时，需要根据样品的性质和目的选择合适的操作方法。一般来说，可以采用重力或压力驱

动的方式进行样品加载。五、洗脱和分离完成样品加载后，可以进行洗脱和分离步骤。洗脱是指用适当的缓冲液将未结合的样品从凝胶中洗脱出来，以去除杂质。分离是指将目标分子从凝胶中洗脱出来，以实现分离纯化的目的。在洗脱和分离过程中，需要根据实验要求选择合适的缓冲液体系和洗脱条件。六、收集和分析样品完成洗脱和分离后，可以将洗脱液收集起来进行进一步的分析。收集的洗脱液可以用于测定目标分子的浓度、纯度以及其他相关性质。常用的分析方法有分光光度法、蛋白质浓度测定、电泳分析等。七、凝胶再生完成一次凝胶过滤层析后，凝胶柱需要进行再生以便下次使用。凝胶再生的方法有多种，常见的有使用盐溶液、酸碱溶液或特定的再生缓冲液进行再生。再生后的凝胶柱需要进行验证，确保再生效果良好。总结：凝胶过滤层析是一种简单有效的生物分离技术。通过选择合适的凝胶材料、制备凝胶柱、加载样品、洗脱和分离等步骤，可以实现对样品的纯化和分离。凝胶过滤层析在生物学、生物化学等领域有着广泛的应用，为研究和分析生物大分子提供了重要的手段。

凝胶过滤层析的基本操作

凝胶过滤层析的基本操作凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子（如蛋白质、核酸等）的方法。该方法基于分子的大小和形状的差异，利用一种孔隙较小的基质（凝胶）将分子按照大小分离，从而达到纯化的目的。凝胶过滤层析是一种非亲和层析法，因为分离是通过分子与基质之间的排斥效应进行的，而不是通过特定的信号配对。 1.准备样品：将待纯化的生物大分子样品（如蛋白质溶液）处理成适合进行层析的条件。这通常包括调节样品的pH值、离子强度、缓冲剂等。 2. 准备层析柱：选择合适的凝胶填料，并根据需要选择合适的柱尺寸。凝胶填料可以是聚合物凝胶或硅胶凝胶。聚合物凝胶（如Sephadex、Sepharose等）常用于分离中等分子量的生物大分子，而硅胶凝胶（如Sephacryl等）则适用于分离较大分子量的生物大分子。 3.平衡柱：将层析柱与缓冲液平衡。通常用适当的缓冲液（如甘氨酸盐缓冲液）进行平衡，以确保柱内填充物的孔隙充满均匀。 4.样品加载：取适量的样品，在不破坏填充物的情况下缓慢地、连续地将样品滴入柱顶端。加载速度要缓慢，以确保样品充分进入柱内而不是渗漏到填充物外。 5.洗脱：在缓冲液的作用下，样品溶液逐渐沿柱体下滤。较小的分子会占据填充物内较小的孔隙，因此会与缓冲液一起快速通过填充物，而较大的分子则会在填充物中逐渐滞留。洗脱时间的长短取决于目标分子的大小。 6.收集洗脱液：用收集管接收洗脱液，以便将目标分子收集起来。

7.考虑后续处理：根据需要，纯化后的生物大分子可以进一步进行其他处理，如浓缩、冻干或储存等。凝胶过滤层析技术的优点包括操作简单、不需要特殊的设备和试剂、分离过程温和且不破坏生物大分子的活性。但也需要注意凝胶的选择、控制操作速度、适当调节缓冲液等因素，以获得最佳的纯化效果。另外，凝胶过滤层析不能对极低分子量的物质进行有效分离，且柱内的适用范围有限，对于较大的生物大分子可能需要较长的时间来完成分离。因此，在选择层析纯化方法时需要根据实际情况综合考虑。

凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理

凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理一、凝胶过滤层析的概念和原理凝胶过滤层析是一种常用的生物化学分离技术，主要用于蛋白质的精细纯化和分离。其原理是利用凝胶颗粒的孔隙结构，根据蛋白质的大小和形状差异，使不同分子量和形状的蛋白质在凝胶颗粒的孔隙中发生不同程度的阻滞和流动，从而实现蛋白质的分离和纯化。二、凝胶过滤层析的操作步骤 1. 样品加载：将待纯化的蛋白样品均匀地加载到预先平衡的凝胶柱或凝胶板上。 2. 洗脱：用缓冲液通过凝胶柱，洗去未结合的蛋白和其他杂质。 3. 洗脱物收集：收集洗脱液中的目标蛋白。 4. 分析和检测：对收集的蛋白样品进行分析和检测。三、凝胶过滤层析的优点和适用范围 1. 分辨率高：凝胶过滤层析能够分离不同分子量的蛋白，分辨率较高。 2. 操作简单：操作过程不需要高昂的设备和特殊技能，相对容易进行。 3. 适用范围广：适用于各种不同分子量和性质的蛋白质的纯化和分离。

四、对凝胶过滤层析的个人理解和观点凝胶过滤层析作为一种生物化学分离技术，在蛋白质纯化领域有着广泛的应用。它的原理简单易懂，操作相对容易，且适用范围广，因此备受科研人员的青睐。在生物制药和基因工程等领域，凝胶过滤层析也发挥着重要的作用，为蛋白质的纯化和分离提供了有效的技术手段。总结：凝胶过滤层析作为一种重要的蛋白质纯化技术，具有分辨率高、操作简单、适用范围广等优点。通过对凝胶过滤层析的深入理解和掌握，能够为生物化学研究和生物制药领域的发展提供有力支持。通过本文的深度探讨，相信您对凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理有了更深入的了解。希望本文能够帮助您更全面、深刻和灵活地理解这一主题。凝胶过滤层析属于分子量分馏技术，是一种物理性质分离方法。它基于蛋白质在凝胶柱内孔隙中的迁移速度的差异，可以将混合物中的不同分子量的蛋白质分离开来。对于高分子量的蛋白质来说，凝胶柱内的孔隙会成为一个障碍，从而使它们在柱内停留的时间更长，而低分子量的蛋白质会更容易通过孔隙，因此在经过相同时间的洗脱后，不同分子量的蛋白质就可以被有效地分离开来。在进行凝胶过滤层析时，首先需要准备好凝胶柱或凝胶板。常见的凝胶材料有琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。选择合适的凝胶材料可以使得孔隙大小合适，从而适应不同分子量范围的蛋白质分离。接下来，需

凝胶层析法分离蛋白质实验报告

凝胶层析法分离蛋白质实验报告实验目的：通过凝胶层析法对不同分子量的蛋白质进行分离纯化，掌握凝胶层析的基本原理和操作方法，并熟悉蛋白质纯化过程中的注意事项和常见问题。实验原理：凝胶层析法是一种蛋白质纯化方法，其基本原理是利用凝胶的三维结构和孔径大小对不同分子量的蛋白质进行分离纯化。常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、硅胶凝胶等。在实验中我们采用了聚丙烯酰胺凝胶，其孔径大小是可以控制的，所以利用不同孔径大小的凝胶对不同分子量的蛋白质进行分离。通常，具有较大分子量的蛋白质被排除在凝胶顶端的孔径较小的区域，而具有较小分子量的蛋白质则可以渗透入较小孔径的凝胶中，因此存在于较深的凝胶层中。实验步骤： 1.准备干燥的聚丙烯酰胺凝胶片，并将其装入凝胶层析柱中。 2.通过密封顶部的小孔，加入显色剂和柠檬酸盐缓冲液制成试样，注意不要将试样直接滴入凝胶中。 3.将制备好的样品通过重力作用，缓慢流经凝胶柱，待所有样品渗透完毕后，收集洗脱出来的蛋白质。 4.将收集得到的蛋白质样品通过SDS-PAGE电泳分析其分子量和纯度。实验结果：在本次实验中，我们以三种分子量不同的蛋白质作为样品，分别是Bovine Serum Albumin（分子量为66kDa）、Egg Albumin（分子量为44kDa）以及Cytochrome C（分子量为12.4kDa）。结果显示，我们的分离纯化效果较好，三个分子量不同的蛋白质在凝胶中得到了良好的分离。而通过SDS-PAGE电泳也证实了每个样品的分子量与预期相符，并且纯度较高。 1.凝胶层析柱和样品的pH值要一致，避免蛋白质发生脱变性。 2.样品加入凝胶层析柱后，立即加入缓冲液，避免样品直接流入凝胶中。

蛋白质分离纯化步骤

蛋白质分离纯化步骤一、蛋白质分离纯化的一般原则大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。二、分离纯化蛋白质的一般程序分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法

简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 (三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。（四）样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂

凝胶过滤技术在蛋白质纯化中的应用研究

凝胶过滤技术在蛋白质纯化中的应用研究蛋白质是生命活动的重要组成部分，其种类和数量都非常丰富。在科学研究和生产实践上经常需要对蛋白质进行分离、纯化和定量分析。其中蛋白质纯化是获得高质量蛋白质样品的关键步骤。凝胶过滤技术是一种广泛应用于蛋白质纯化中的分离技术。其原理是利用孔径大小选择性地分离分子量不同的蛋白质。本文将从凝胶过滤技术的工作原理、操作流程及优缺点等方面介绍该技术在蛋白质纯化中的应用研究。一、凝胶过滤技术的工作原理凝胶过滤技术是一种分子筛分离技术，其基本原理是利用凝胶中固定的孔径大小选择性地分离分子量不同的蛋白质。凝胶即为一种多孔矩阵，孔径大小可以通过选择不同的凝胶材料和孔径大小来实现。孔径大小越小，则分子量较大的蛋白质会被凝胶孔道完全阻挡；而孔径大小较大的蛋白质则可以通过凝胶的孔道流经。因此，分子量越大的蛋白质，越容易被阻挡在凝胶中。二、凝胶过滤技术的操作流程凝胶过滤技术主要有以下操作流程：凝胶柱装载、样品加入、洗脱和收集。下面将详细介绍各个步骤的操作要点。 1. 凝胶柱装载凝胶柱是凝胶过滤技术的主要工作部件，其作用是将凝胶填充到管柱中形成一定长度的分离柱。凝胶柱的选择应该根据样品的性质和目标蛋白质的分子量来进行，选择适合的凝胶柱可以有效提高分离纯化效率。 2. 样品加入

将样品加入到凝胶柱中，一般采用重力流动或离心的方式。样品的加入应该控制加入量和加入速度，以避免溢出和凝胶塌陷等问题。 3. 洗脱洗脱是为了去除与凝胶表面结合不紧密的杂质和低亲和力的蛋白质，从而避免影响目标蛋白质的分离纯化。在洗脱过程中，一般采用缓冲液进行冲洗，洗脱程度的控制应该根据目标蛋白质的特性来确定。 4. 收集收集是将经过凝胶柱洗脱后的目标蛋白质进行收集和提纯。在收集过程中，一般采用分数收集和毒性分析来确定收集峰。三、凝胶过滤技术的优缺点凝胶过滤技术在蛋白质纯化中有很多优点，例如分离过程不受温度和pH等因素的影响，操作简单易行，对生物活性蛋白质有保护作用等。但是，凝胶过滤技术也存在着一些缺点，如分离精度受孔径分布和粒径分布的影响、分子束效应导致分离峰变宽等问题，这些问题需要在实践中逐步解决。四、凝胶过滤技术的应用研究凝胶过滤技术在蛋白质分离纯化中具有广泛应用前景。一方面，凝胶过滤技术可以用于分离和纯化不同种类的蛋白质，例如血清蛋白、细胞膜蛋白、重组蛋白等。另一方面，凝胶过滤技术还可以用于分析蛋白质在生物学过程中的组分构成和分子结构，例如蛋白质配体相互作用、大分子的构象变化等。在实际应用中，凝胶过滤技术除了常规的手工制备外，也可以采用自动化平台或微流控技术等进行高通量分离纯化。这些方法可以大大提高分离效率和纯化度，为生物学、药学、食品科学等领域蛋白质研究和实际生产提供有效手段。结语：

凝胶过滤层析的基本操作

凝胶过滤层析的基本操作 ①凝胶介质的选择根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用Sephacryl S-300。对于分子量在3~5kDa的蛋白质，脱盐时应选用Sephadex G 50或G 25；而对于小分子量多肽物质（1~5kDa），脱盐则应选用Sephadex G 10 或 Sephadex G 15。 ②凝胶介质的处理和装柱商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50~100:1。装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约1 /3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）搅拌均匀，缓慢并连续地一次性注入柱内。装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝。装完后，可用2 ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。如柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。要保持凝胶和缓冲液温度一致，以减少气泡的产生。③上样凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。样品体积不应超过柱床体积的1~5 %，如超过5 %，则会导致分离效率降低，低于1%则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10般0 mg/ml。样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2,样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。上样前样品应经0.2 Pm?孔径滤膜过滤或10，000 &离心5 min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。④洗脱洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结合作用。Sephadex和Sepharose CL凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为0.02 mol/L；Sephacryl凝胶应为0.05 mol/L。有时洗脱溶液的离子强度甚至可达0.2 mol/L，以保证蛋白质不与凝胶介质结合。在凝胶过滤层析过程中，洗脱速度要恒定。流速不应过高，一般在1ml/min左右，低流速可提高分辨率。可以用恒流泵控制流速。⑤分离蛋白的监测和收集凝胶过滤层析中，分离蛋白的监测和搜集与离子交换层析相同。⑥层析柱的再生与保存洗脱完成后，继续用3-5个柱床体积缓冲液洗涤柱体，即可使凝胶再生。也可用0.2 mol/L NaOH或1 mol/L NaCl或非离子型去垢剂0.2~1% NP-40去除吸附过紧的杂质，再用双蒸水充分洗脱除去离子，加0.02% NaN3 (抑菌剂)保存。也可在20 %乙醇中保存(如 Sephacryl

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，