16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
1.适用范围
本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理
16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S
rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S
rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
16SrDNA
27F519R
357F1115R
926F1492R
3对引物正反向测通后，拼接成1500bp左右的16SrDNA序列。
3.设备和材料
3.1器材
1 / 9
Eppendorf 100μL、10μL）；涡旋振荡器；移液器（1000μL、200μL 、96 ；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti MixMateMP VersaDoc 凝胶成像仪：Well Thermal Cycler；AB3130 、；基因分析仪：AB35004000试剂
3.2
Taq 10×Taq酶，DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：2+BigDye ExoSAP-IT；测序试剂：，dNTPs，ddHO等；Buffer(Mg)2；BigDye XTerminator Purification KitTerminator，5×Sequencing Buffer；耗材3.3TM、200μL；Micro Amp1.5mL移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：TM Optical 96-Well Reaction Plate；Micro Amp；Optical Adhesive Film引物3.4
16SrDNA 序列名称扩增长度
5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 27F 正向引物第1部分500 bp左右5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 519R 反向引物
5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 357F 正向引物第750bp左右2部分5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'
1115R 反向引物
5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3' 926F 正向引物部分560 bp左右第35'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3' 1492R
反向引物M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1
其中4.操作流程
核酸提取产物纯化基因扩增序列比对测序反应
实验方法5.核酸提取：5.1
LPrepMan
μ挑取单菌落，然后置于装有10010min后，以离心机最左右，然后100℃水浴Ultra的离心管中，涡旋震荡混匀30s大转速离心3min，取10μL上清液与490μL
ddHO（即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DNA。提取的DNA于-220℃保存。
5.2基因扩增
模DNA模板量通常在100 ng以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的备注：DNA仪PCR反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却3~5min，最后放于板使用量。PCR 扩增的特异性。上进行反应，这种冷启动法可增强PCR反应条件PCR5.2.210min ℃：9430s ℃：9430s ℃：5830Cyc45s ℃：725min ℃：72 ∞4℃：5.2.3电泳℃100mL TAE 电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60称取1g琼脂糖置于成板，制均左右时，匀铺电压进行琼脂糖凝胶电泳。PCR反应结束后，加样，以100V1%的琼脂糖凝胶。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。5.3产物纯化试剂，混匀。产物加入2μL ExoSAP-IT5.3.1每5μLPCR 。℃温育
15minPCR仪中，37℃温育15min, 80放入5.3.2
产物做为下一步测序反应的模板。纯化后的PCR5.3.3
2min ℃：9630s 96℃：15s 55℃：30Cyc4min ℃：60 4℃：∞3 / 9
(BigDye XTerminator Purification Kit)
测序反应纯化5.4.3
BigDye XTerminator Solution。SAM Solution和6μL5.4.3.1每管加入27μL 30min上2000rpm。震荡5.4.3.2放在Eppendorf MixMate
2min。1000×g离心5.4.3.3在离心机上以96孔板中，放入测序仪中测序。10μL上清液于5.4.3.4每管吸取序列比对5.5微生物鉴定系统中进行比对，得基因测序仪得到的测序结果，在MicroSEQ 到菌种的种属信息。关键说明6.
时，对于细胞壁比较薄的革兰氏阴性细菌，可挑DNA6.1提取细菌基因组O ddH100μL 取一菌环菌株，置于2PC倍后做为分离，稀释50中，混匀，沸水热变性10min后，离心3min 确认最佳的模板量。模板。必要时做梯度PCRR及测序反应时，为了保证酶的活性，整个体系应在冰中配置；然PCR6.23~5min，最后放于PCR后置于低温冰箱中冷却仪上进行反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。
6.316SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行
16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。具体参照附录。
PCR出现非特异性条带的原因：一是引物与靶序列不完全互补、或
引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶4 / 9
浓度过高，退火温度浓度过高，Mg2+量过多或酶的质量差，dNTP 过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源度。增加模板量，的浓度。适当降低Mg2+浓的酶。②减少dNTP 减少循环次数。污染。阴性对照检测是否被基因组用RTDNA模板浓度过高
10ul体系100ngDNA
5 / 9
附录（资料性附录）结果电泳图三部分的PCR1.细菌16SrDNA M123
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
M：DL2000；
1：引物27F和519R的PCR产物（第1部分500bp）
2：引物357F和1115R的PCR产物（第2部分750bp）
3：引物926F和1492R的PCR产物（第3部分560bp）
6 / 9
2.细菌16SrDNA鉴定结果
2.1即可反映细菌的种属信息：500bp16SrDNA前菌株TL140924的鉴定结果
7 / 9
2.216SrDNA前500bp不足以反映细菌的种属信息：
菌株70528的鉴定结果
16SrDNA的全序列信息：2.3 70528菌株的鉴定结果8 / 9
序列不足以将待500bp所示，当待测菌株的2.316SrDNA前、如附录 2.2 全长序列以将其区分。16SrDNA测菌株与库中菌株区分时，则需要测其
9 / 9
标准菌株的鉴定及其特点
埃希菌属（Escherichia） 1、形态与染色：为革兰阴性短杆菌，多数有周鞭毛，能运动。有菌毛、荚膜及微荚膜。 2、培养特性：兼性厌氧菌，营养要求不高，在普通营养肉汤中呈浑浊生长。普通营养琼脂上呈灰白色的光滑型菌落。血琼脂平板上，少数菌株产生溶血环。麦康凯和SS琼脂中的胆盐对其有抑制作用，耐受菌株能生长并形成粉红色菌落。 3、生化反应：吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐（柠檬酸盐）试验（IMViC试验）为++--（肠杆菌属多为--++）。克氏双糖铁琼脂（KIA）上斜面和底层均产酸产气，H2S阴性。动力、吲哚、尿素（MIU）培养基的生化反应为++-. 4、致病性大肠埃希菌有下列五个病原群。 （1）肠产毒型大肠埃希菌（ETEC）：引起儿童腹泻和旅行者腹泻（水样泻）。 （2）肠致病型大肠埃希菌（EPEC）：主要引起婴幼儿腹泻。 （3）肠侵袭型大肠埃希菌（EIEC）：可侵入结肠黏膜上皮，引起志贺样腹泻（能产生粘液脓血便）。 （4）肠出血型大肠埃希菌（EHEC）：又称产志贺样毒素（VT）大肠埃希菌（SLTEC或UTEC），其中O157：H7可引起出血性大肠炎和溶血性尿毒综合征（HUS）。严重者可发展为急性肾衰竭。 （5）肠粘附（集聚）型大肠埃希菌（EAggEC）：与世界各地慢性腹泻有关。 5、CDC将大肠埃希氏菌O157：H7列为常规检测项目 沙门菌属（salmonella）
1.形态与染色：为革兰阴性直杆菌，无芽胞，无荚膜。除鸡沙门菌外都有周身鞭毛，能运动，多数有菌毛。？ 2.培养特性：营养要求不高，在普通琼脂培养上即能生长，在液体培养基中呈均匀混浊。在SS琼脂和麦康凯琼脂培养基上35℃～37℃24h可形成直径约2～4mm的透明或半透明菌落，对胆盐耐受。产H2S者在SS琼脂上形成黑色中心。？ 3.生化反应：除亚利桑那菌外均不能发酵乳糖，大多数IMViC试验为-+-+，KIA：K／A、产气+／-、H2S+／-，MIU：动力+、吲哚-、尿素酶-。 4.致病因素有侵袭力、内毒素和肠毒素3种。临床上可引起胃肠炎、肠热症、菌血症或败血症等。其中肠热症属法定传染病。？ （1）肠热症：即伤寒与副伤寒病。由伤寒与副伤寒沙门菌所引起的慢性发热症状。为法定传染病之一。？ （2）食物中毒：引起食物中毒的沙门菌以鼠伤寒、肠炎、汤卜逊、猪霍乱、乙型及丙型副伤寒沙门菌为常见。？ （3）慢性肠炎：沙门菌可引起老人和儿童的慢性肠炎。？ （4）败血症：多由猪霍乱沙门菌引起。？ （5）沙门菌的局部感染如颈部、腰部等。 血清学诊断：肥达试验：用已知的伤寒沙门菌0、H抗原，甲乙丙副伤寒沙门菌H抗原稀释后与被检血清作定量凝集试验，以检测患者血清中抗体的含量，来判断机体是否受沙门菌感染而导致肠热症并判别沙门菌的种类。 志贺菌属（shigella） 1.形态与染色：革兰染色阴性，杆菌，无鞭毛,有菌毛.？ 2.培养特性：在肠道鉴别培养基上形成无色,半透明的菌落.均能分解葡萄糖只产酸不产气,
营养缺陷型菌株的筛选和鉴定
营养缺陷型菌株的筛选和鉴定 mutugenesis and isolation of auxotroph 细菌革兰氏染色法 gram stain 酵母菌的形态结构观察 yeast morphology 培养基的配制和灭菌 types of mddia and sterlization 菌种保藏 preservation of cultures 细胞计数法 conting of cell 凝集反应 agglutination reactions 相差显微镜 phase contrast microscope 细胞融合 cell fusion 质粒DNA的提取 isolation of plasmid DNA 植物DNA的提取 isolation of plant DNA 多肽的末端分析 analysis of terminal of polypeptide PCR扩增DNA PCR amplify DNA fragment SDS-聚丙烯凝胶电泳 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 蛋白质的性质 properties of protein 植物组织培养 plant tissue culture BL-410生物机能实验系统简介 the introduction of BL-410 biofunctional experiment system 青蛙坐骨神经-腓肠肌标本的制备 preparation methods for nerve-muscle specimen of frog 人ABO血型的鉴定 Identification of humankind ABO blood group
标准菌种管理规程
标准菌种管理规程 目的：规范药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确 保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 职责： QC 主管负责菌种的申购、接受、保存、分发，微生物检验员 负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传 代、使用及销毁等。 内容： 1术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理 中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存 的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养 后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即 称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 2.标准： 2.1 检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购 买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购
买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制 代数。 2.2 检定菌的接收 菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及 每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表 1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种 的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并 储存于 2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过 5 年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养 基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。此法仅用于 工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同， 细菌： 1 个月；酵母菌： 2 个月；霉菌及芽胞： 3 个月。 2.3.2 传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1．甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面 的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到 预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10 号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度 20%），
标准菌株
概述：标准菌株是细菌室室内质控工作必不可少的、重要的生物资源，我室的标准菌株主要来自省临检中心的发放和从卫生部临检中心以及国家菌种保存中心购买所得，为了让标准菌株能够得到合理的应用，特制定以下规定。 1.对每批购买的标准菌株要做好登记，包括菌种的菌名、编号、购买时间、保存地点、记录人等 2.每次使用标准品都应作好使用记录，包括标准品的名称、编号、使用时间等。 3.购买的标准品初次使用时，应大量增殖，然后分装在含10-15%甘油的胰蛋白胨肉汤中，-20℃以下保存。 4.新的标准菌株复苏最多不得超过三次，如超过三次将不在视为标准菌株使用。 5.标准菌株保存管一经溶化使用后，不得再次冻存。 本篇文章来源于检验在线https://www.360docs.net/doc/4c15161686.html,/ 原文链接：https://www.360docs.net/doc/4c15161686.html,/paper/manual/1OMDAwMDAwMDc1OQ.html 目的: 建立检定菌的管理制度。 范围: 检验用菌种的管理。 责任者: 化验员、中心化验室主任。 程序： 1、菌种接收 （1）检定菌由专人保管，此人须受过专业培训，有足够的菌种保存经验。 （2）根据检验品种的需要，由检定菌保管员制定购买计划，报中心化验室主任审核、质量部负责人批准。（3）检定菌保管员在接收标准菌种时，须填写接收记录，并在保存菌种容器外加贴标签（内容为名称、编号、接收日期），妥善保管。 2、菌种的移植传代 （1）长久保存的菌种在启用时，要经移种至适宜的培养基上进行培养，待生长后再行移种，如此连续2—3次，甚至多次，直至出现典型的形态和生化特征为止。 （2）保存的菌种须按规定时间进行传代。 （3）在检查或保存菌种过程中，遇有形态构造上有变异或污染菌等情况，需进行菌种移植分离培养以得到纯菌。 （4）移植传代时须核对编号、传代次数、传代日期、所用培养基等并记录。每次移植传代后，要与原种的编号、名称核对，检查培养特征无误时方可再继续保存。 （5）传代次数必须控制，传代次数越多，突变的机率越大。因此要尽量少传代，必须根据菌种保存情况规定最多传代次数。 第2页共2页 3、菌种原种须按标签或所附说明书妥善保存，并上锁，以保证安全，防止意外。移植传代后的菌种于普通冰箱内2—8℃保存，每周检查一次冰箱温度、湿度，菌种管的棉塞是否松动生霉，有无异常，并逐次记录。 4、菌种的使用和销毁 （1）每次使用的菌种必须是培养后健康、生命力强、无变异的菌种。每次使用菌种均须作记录。 （2）超过传代限度或经鉴定检查不合格的菌种，报中心化验室主任、质量部负责人审核批准后销毁灭活（加
标准菌株质量控制作业指导书
标准菌株质量控制作业指导书 1、目的： 对微生物标准菌株的验收、复活、确认、转代、储存、使用、废弃等进行规定，确保标准菌株符合要求，保证检测结果。 2、职责： 2.1、检测中心主任负责标准菌株资源的配备。 2.2、微生物检测室工作人员负责标准菌株的有效储存和正确的使用。 3、要求： 3.1供应商的选择：选择有资质的标准菌株的合格供应商，每批标准菌株必须有附件的供应商的合格证或检测报告，来证明所采购的标准菌株是合格的。 3.2标准菌株和验收 菌株一到实验室，一定要记录好菌株号和标准菌株来源，确保溯源性清楚。同时，还应尽可能多的菌株信息，如：标准菌株名称和数量、生产日期、接收日期和有无破损等。 3.3冻干标准菌株的复活： 3.3.1、开启产品包装：先用70%酒精棉擦拭外包装，从凹口处撕开产品外包装，撕掉标签上的拉片，将其贴于菌株保藏管上。 3.3.2、复活：选择合适的培养基和培养条件（根据生产商说明）进行复活。冻干菌株的传代次数不得超过5代，从标准菌株保藏中心购买的冻干标准菌株为第F0代。捏管帽处安瓿瓶（仅一次）使其释放水合液体。垂直握住安瓿瓶并轻拍之，使液体流入含小球的管底。通过挤捏压碎小球使其与液体混合，立即将拭子浸于水合液体。挤压并旋转拭子，接种于初级培养平板，接种圈的直径约为25mm，用一无菌接种环在先前接种区域划线10-20次，促使分离出单菌落。同时吸出部分菌液接种胰蛋白胨大豆肉汤管，副溶血性弧菌接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤管。将接种好的平板和管立即进行培养。细菌培养温度通常为25℃或37℃。多数冻干菌株会在几天后长出，但是少数菌会表现出延滞期延长的现象，需要将正常培养时间加倍。复活后的菌株为F1代。 3.3.3将TSB生长的浓菌液吸0.5mL于菌株保藏管充分混匀后将液体吸出，将保藏管-18℃保存1-3年为标准储备菌株F2代。将平板上生长的良好菌株接种
葡萄球菌属的常规鉴定标准操作程序
葡萄球菌属的常规鉴定标准操作程序 1 概述 葡萄球菌属是一类触媒试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌，表面葡萄球菌、腐生葡萄球菌等32个种。是临床最常见的化脓性球菌，广泛分布于自然界中，在人体表面鼻、咽、肠道也经常存在。 2 形态与染色 革兰阳性球菌，直径0.4~1.2μm成单、双、短链或不规则状排列。在液体培养基浓汁标本中，往往排列成双或短链状多数有鞭毛。 3 培养特性 金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上典型菌落为金黄色，周围有明显的透明（β）溶血环，部分菌落呈橙色，在高盐甘露醇平板上呈橙色菌落。表皮葡萄球菌等其他葡萄球菌在血琼脂平板上菌落为白色或柠檬色，不溶血。 4 生化反应 触酶试验阳性，多数能分解葡萄糖、麦蚜糖、蔗糖和甘露醇。不分解棉籽糖和水杨苷，液化明胶，血浆凝固酶和DNA酶实验分阳性。 5 鉴别要点 5.1 本菌属特征：触酶实验阳性，革兰阳性球菌，葡萄状排列，菌落中等大小，中等干燥。 5.2 与微球菌属的鉴别：触酶实验都为阳性，但O∕F试验葡萄球菌属为发酵型，而微球菌为氧化型或无反应，而且菌体较葡萄菌属更大，排列呈四联状为主。5.3 与链球菌属的鉴别：葡萄球菌属触酶试验都为阳性，而链球菌为阴性，O∕F试验葡萄球菌属为发酵型而链球菌为氧化型。 5.4 凝固酶阳性葡萄球菌的鉴别见下表。 结合型凝游离型凝鸟氨酸脱 菌名PYP试验DNA试验VP试 验 固酶试验固酶试验 羧酶实验
金黄色葡萄球菌+ + - + + - 中间型葡萄球菌- + + + - - 施氏葡萄球菌+ - + + + - 路邓葡萄球菌+ - + - + + 注：“+”为90%以上菌株为阳性，“--”为90%以上菌株为阳性。 5.5 凝固酶阳性葡萄球菌的鉴别见下表 + 腐生葡萄球菌——+ V + + — 溶血葡萄球菌+ ——V + — — 人型葡萄球菌——+ —+ — — 华纳葡萄球菌——+ V + —— 模仿葡萄球菌+ —+ + + —— 头状葡萄球菌——V + + ——
标准储备菌株纯度确认标准操作规程
1.目的：建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。 2.范围：微生物限度实验室所用标准储备菌株。。 3.职责：QC主管生测员对本规程的实施负责。 4.依据：中国药典2015年版四部通则。 5.内容： 5.1.实验菌株 5.1.1 标准菌株 5.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。 5.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。 5.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 5.1.2 工作菌株 5.1.2.1 标准储备菌株可用于定期转种（每3个月）或制备工作菌株。 5.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 5.2 菌种确认试验的主要内容 5.2.1 菌种的纯度确认 5.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 5.2.1.2 实验内容
⑴菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，用一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。 ⑵镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。 5.2.2 菌种的特性确认 5.2.2.1 生化试验 各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 5.3 菌种的确定方法 用无菌的接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 5.3.1 大肠埃希菌的确认 5.3.1.1 菌落形态 ⑴取大肠埃希菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经35℃培养18～24小时后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。 ⑵取上述培养物接种于麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24小时后，观察结果。 ⑶麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16S r D N A鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程 1.适用范围 本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。 本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。 2.方法和原理 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。 在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。 3.设备和材料 3.1器材 移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪： AB3500、AB3130 3.2试剂 DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit； 3.3耗材 移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；
标准菌种确认标准操作规程完整
一目的 建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。 二围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 三容 1.1 试验菌株 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501] 白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941] 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104] 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001] 1.1.1 标准菌株 1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国或国外菌种收藏机构。 1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。 1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 1.1.2 工作菌株 1.1. 2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。 1.1. 2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 1.2 菌种确认试验的主要容
1.2.1 菌种的纯度确认 1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 1.2.1.2 试验容 ①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。 1.2.2 菌种的特性确认 1.2.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代过程中所参与的物质分解和合成代的产物也不同，这些代产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 1.3 菌种的确定方法 用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 1.3.1 大肠埃希菌的确认 1.3.1.1 菌落形态 1.3.1.1.1 取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。 1.3.1.1.2 取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24h后，观察结果。 ①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。 ②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。 1.3.1.2 革兰染色、镜检 1.3.1. 2.1 革兰染色
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程 1.适用范围 本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。 本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。 2.方法和原理 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。 在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。 由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。 16SrDNA 27F519R 357F1115R 926F1492R 3对引物正反向测通后，拼接成1500bp左右的16SrDNA序列。 3.设备和材料 3.1器材 1 / 9 Eppendorf 100μL、10μL）；涡旋振荡器；移液器（1000μL、200μL 、96 ；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti MixMateMP VersaDoc 凝胶成像仪：Well Thermal Cycler；AB3130 、；基因分析仪：AB35004000试剂
QC-TY-2008 菌种鉴定标准操作规程
目的：建立菌种鉴定标准操作规程 范围：适用于质量控制部菌种鉴定标准操作 职责：质量控制部 内容： 1整体操作步骤 1.1纯化、分离待鉴定菌 用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。 1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。 1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。 1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。 1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。 1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。 2革兰氏染色 2.1染色剂的配制 2.1.1结晶紫染色液：
甲液：结晶紫 1.0g 95%的酒精20ml 乙液：草酸铵0.8g 水80ml 将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。 2.1.2碘液： 碘 1.0g 碘化钾 2.0g 水300ml 配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。 2.1.3稀石碳酸红溶液: 碱性品红 1.0g 石碳酸 5.0ml 95%乙醇10.0ml 配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。 2.2操作: 2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。 2.2.2干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过2～3次，以固定涂片。 2.2.3染色：在已固定的标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本， 染色1分钟。 2.2.4水洗：斜置玻片使很细水流的纯化水从染色标本的上端流下，勿使水流直接冲刷涂片处，直至洗下的水呈无色为止。 2.2.5滴加碘液冲去残水并媒染约1分钟，用纯化水冲去碘液吸干。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
菌种鉴定标准操作规程 目的：建立菌种鉴定标准操作规程 范围：适用于******鉴定标准操作 职责： 内容： 1整体操作步骤 纯化、分离待鉴定菌 用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。 挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。 如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。 如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。 假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。 选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色 染色剂的配制 结晶紫染色液： 甲液：结晶紫 95%的酒精 20ml 乙液：草酸铵 水 80ml 将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。 碘液： 碘 碘化钾 水 300ml 配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。 稀石碳酸红溶液: 碱性品红 石碳酸 95%乙醇 配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。 操作:
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程 目的：建立菌种鉴定标准操作规程 范围：适用于******鉴定标准操作 职责： 内容： 1 整体操作步骤 1.1 纯化、分离待鉴定菌 用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。 1.2 挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。 1.3 如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。如发酵实验结果为阴性，则 选用API20NE 试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实 验后选用API20E 试剂条进行鉴定。 1.4 如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。如实验结果为阴性则 选用API Strep 试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph 试剂条进行鉴定。 1.5 假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB 试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne 或其他试剂条进行鉴定。 1.6 选定正确的试剂条以后，根据不同的API 试剂条的标准操作规程准备接种物， 进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API 鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。 2 革兰氏染色 2.1 染色剂的配制 2.1.1 结晶紫染色液： 甲液：结晶紫 1.0g 95%的酒精20ml 乙液：草酸铵0.8g 水80ml 将甲液和乙液混合均匀，静置48h 使用，置密闭棕色瓶中储存。
1.7 碘液： 碘 1.0g 碘化钾 2.0g 水300ml 配制时先用3～5ml 水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再 加水稀释至300ml ，摇匀，分装在棕色瓶中储存。 1.8 稀石碳酸红溶液: 碱性品红 1.0g 石碳酸 5.0ml 95%乙醇10.0ml 配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml ，摇匀。 2.2 操作: 2.1.2 涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则 先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。 2.1.3 干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过2～ 3 次，以固定涂片。 2.1.4 染色：在已固定的标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本， 染色1 分钟。 2.1.5 水洗：斜置玻片使很细水流的纯化水从染色标本的上端流下，勿使水流直接 冲刷涂片处，直至洗下的水呈无色为止。 2.1.6 滴加碘液冲去残水并媒染约 1 分钟，用纯化水冲去碘液吸干。 2.1.7 滴加95%的乙醇脱色约20～30 秒，脱色时应将玻片微振动，使酒精分布均匀，立即用水冲净。 2.1.8 稀石碳酸红溶液染色 1 分钟后，用水洗净晾干或吸干。 2.1.9 镜检：先用低倍镜观察，找到适合的位置，再加一滴香柏油于涂片上，使用 100 倍物镜观察细菌革兰氏属性。革兰氏阳性菌染色成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成红色，同时做阳性对照。 3 简单染色 3.1 用于真菌与细菌的鉴别。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程 目得:建立菌种鉴定标准操作规程 范围:适用于****＊＊鉴定标准操作 职责: 内容: 1整体操作步骤 1、1纯化、分离待鉴定菌 用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应得培养基上(如TＳA),划线分离,以出现微生物单菌落为止。 1。2挑取纯化后得单菌落,进行革兰染色、镜检,以确定待鉴定菌得革兰属性。 1、3如镜检结果为革兰阴性杆菌,则先进行发酵实验。如发酵实验结果为阴性,则选用APＩ2０NE试剂条进行鉴定;如发酵实验结果为阳性,则在经过细胞色素氧化酶实验后选用AＰI20E试剂条进行鉴定。 1。４如镜检结果为革兰阳性球菌,则先进行过氧化氢酶实验。如实验结果为阴性则选用API Ｓtｒｅp试剂条进行鉴定,如实验结果为阳性则选用APＩSｔaph试剂条进行鉴定。 1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞,则选用ＡPI 5０ＣＨB试剂条进行鉴定;否则,根据运动性实验与过氧化氢酶实验结果选用API Ｃｏｒynｅ或其她试剂条进行鉴定、 1、６选定正确得试剂条以后,根据不同得API试剂条得标准操作规程准备接种物,进行接种、培养等操作并将结果形成数码,用APＩ鉴定软件鉴定或查询待检菌得名称均可。鉴定结果应记录,必要时,给出相应解释、 ２革兰氏染色 2。１染色剂得配制 2、１.1结晶紫染色液: 甲液:结晶紫1、０g 9５%得酒精2０ｍl 乙液:草酸铵0。8g 水80mｌ 将甲液与乙液混合均匀,静置48h使用,置密闭棕色瓶中储存、
2、1、2碘液: 碘１、0g 碘化钾 2.0g 水300ml 配制时先用3~5ml水将碘化钾溶解,再加入碘,用力摇匀,使之全部溶解后,再加水稀释至300ml,摇匀,分装在棕色瓶中储存。 ２、1。3稀石碳酸红溶液: 碱性品红1、0g 石碳酸5、0mｌ 95%乙醇10、０ｍl 配制时用乙醇溶解碱性品红,然后加入石碳酸溶液,使用时加水稀释至100mｌ,摇匀。 2.２操作: 2.2。1涂片:用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层,固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水,用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。 ２。２、2干燥固定:涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干,并在火焰上通过2～３次,以固定涂片、 ２.２、3染色:在已固定得标本上滴加结晶紫溶液数滴,使染色液覆盖整个涂片标本, 染色1分钟。 2。2、４水洗:斜置玻片使很细水流得纯化水从染色标本得上端流下,勿使水流直接冲刷涂片处,直至洗下得水呈无色为止。 2。2。5滴加碘液冲去残水并媒染约1分钟,用纯化水冲去碘液吸干。 2.2、６滴加９5％得乙醇脱色约2０~30秒,脱色时应将玻片微振动,使酒精分布均匀,立即用水冲净、 2、2。7稀石碳酸红溶液染色1分钟后,用水洗净晾干或吸干。 2、2。8镜检:先用低倍镜观察,找到适合得位置,再加一滴香柏油于涂片上,使用1０0倍物镜观察细菌革兰氏属性。革兰氏阳性菌染色成蓝紫色,革兰氏阴性菌染成红色,同时做阳性对照。 3简单染色 3、1用于真菌与细菌得鉴别。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA 鉴定菌株的标准操作规程 1. 适用范围 本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA 片段进行PCR 扩增，然后对 扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。 本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导 信息。 2. 方法和原理 16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴 定。包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、 DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。 16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列。16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用 测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。 在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利 用恒定区序列设计引物，将16S rDNA 片段扩增出来，禾U 用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分 类鉴定。 16SrDNA 序列的前500bp 序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信 息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前 500bp 序列即可鉴别出 细菌的菌属。针对科学论文发表或是前 500bp 无法鉴别的情况，需要进行16SrD NA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA 的序列信息。 由于测序仪一次反应最多只能测出700bp 的有效序列，为了结果的可靠性， 通常将16SrDNA 全长序列分成3部分进行测序。 357F ------------------------------------------- ? ----------------------------------------- 1115R 926F ----------------------------------- ? 斗 1492R 3对引物正反向测通后，拼接成1500bp 左右的16SrDNA 序列。 3. 设备和材料 3.1 器材 移液器(lOOO^L 200卩 L 、1001、10uD ；涡旋振荡器；Eppendof 16SrDNA 519R 27F ■
标准菌株使用标准操作规程
标准菌株使用标准操作规程 1 检验目的 对实验室的标准菌株进行合理的保存，并规范合理的使用流程，保证菌株的性能稳定可靠。 2 范围 微生物实验室保存的标准菌株。 3 职责 微生物组工作人员正确执行本操作规程。 4 术语和定义 4.1标准菌株 其特征进行了分类和描述，有明确的来源。ATCC（American Type Culture Collection）美国标准菌株收藏中心。 4.2标准储备菌株 标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。 4.3 工作菌株 标准储备菌株传代后得到的同种菌株。 4.4 标准培养物 标准菌株、标准储备菌株、工作菌株的统称。 4.5质控菌株 ATCC最佳，但当无法获得时可以使用ATCC演化的菌株或我国国家菌种库储存的标准菌株。特殊情况，例如定性试验可用已知的菌种作为质控菌株。室间质评的菌株即可。 5 保存程序
5.1标准菌株 5.1.1商业购买的ATCC标准菌株干粉，-80℃低温保存，可以2年以上。安瓿真空包装的，-80℃可长期稳定保存。将标准菌株进行编号和登记。 5.1.2复苏 用1ml无菌的小牛血清或营养肉汤溶解。根据菌种的生长特点，接种到新鲜培养基上选择适宜的培养条件培养18-24h。酵母菌要求3天，形成孢子的微生物宜保存孢子。 5.2标准储备菌株 5.2.1由复苏后的ATCC标准菌株制备。复苏后的标准菌株要检查其纯度，必要时进行生化试验检查。刮取培养物上的菌体，用足量的菌悬浮于防冻培养基中。防冻液可以是无菌脱纤维羊血、10%甘油肉汤。储存足够量的标准储备菌株，可用1-2年。一年52周需要52支以上。 5.2.2甘油肉汤保存法 成分有蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、甘油、纯化木。相当于20%的甘油。挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。苛养菌可以适当增加菌量。-80℃保存。除链球菌和嗜血杆菌以外细菌均可使用。保存期限1-5年。 5.2.3全血保存法 成分为脱纤维羊血。挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。苛养菌可以适当增加菌量。-80℃保存。主要用于保存链球菌、嗜血杆菌及厌氧菌。保存期限1-5年。 5.2.4标准储备菌株进行编号和登记。 5.3工作标准菌株 由标准储备菌株传代得到的菌株。标准储备菌株对多向下传三代。过多的传种会增加变异的机会。标准储备菌株根据菌种特点选择适宜的培养基和培养条件进行培养18-24h即工作标准菌株。储存在2-8℃，可放四周。个别营养要求高的为2周，例如肺炎链球菌和嗜血杆菌。使用时应编号并登记。
标准菌株质量控制溯源程序
1.目的 对微生物菌种进行严格管理和使用，为确保量值传递的溯源性、稳定性、统一性、准确性和确保检验数据的可靠性，具有重要作用。 2.范围适用于对检定用标准储备菌株和工作菌株的使用和控制，包 括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等 3.职责 采购人员负责菌种的申购、接收、分发。 微生物检验员负责菌种的确认、保存、传代、使用及销毁。 4.活动 4.1 定义 标准菌种是指由微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 4.2 申购根据菌种使用情况提出申购需求向微生物菌种保藏中心购买，购买时需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数 4.3接收菌种到达实验室后，由检验人员接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《菌种接收记录》（附表1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并储存于2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过5年。 4.4 保存 4.4.1工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌：1个月；酵母菌：2个月；霉菌及芽胞：3个月。 4.4.2传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法、液体石蜡保存法和定期移植法。 4.4.2.1甘油冷冻管保藏法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面
14.1微生物菌种及样本管理规定及流程
微生物菌种及样本管理规定及流程 1.目的 规范菌种管理，保证菌种鉴定、抗菌药物药效学评价等临床微生物室研究工作中所有涉及有关微生物学部分的结果溯源性。 2.范围 临床微生物室保存的标准菌株和来自临床标本的菌株 3.职责 3.1科主任：负责菌种出入库、标准菌株的申购、菌种使用以及销毁等申请报告的审核。 3.2菌种保管员：负责标准菌株的申购报告、菌种的登记、出入库、传代、保管和使用以及销毁等日常管理，并对所做工作形成记录。 3.3检验人员：负责菌种的收集、登记、鉴定、使用、销毁，并对所做工作形成记录。 4.工作程序 4.1菌种的入库保存 4.1.1制表《菌种管理登记表》；内容包括贮存菌种的名称、来源、生物学特性、入库/出库的数量、剩余量、使用日期、领用人、保管员，以及溯源证明。 4.1.2购买的ATCC标准菌种以及收集的临床菌株均需由专人收集和登记，统一编号，登记在《菌种管理登记表》内，入库管理，并保留溯源证明等。
4.1.3 ATCC标准菌株购买后，登记并需按标准菌株要求做好菌种牛奶冻干复制及准入库；同时作标准菌株质量控制性能检查，合格后正式入库，可室温保存，有效期10年。并对所做工作形成记录。 4.1.4 临床菌株经收集后，登记，菌种复核合格后以Micreobank冷冻管或40%甘油-肉汤管做好菌种复制及入库，≤-80℃保存，有效期3年。使用中的ATCC标准菌株也可以该种保存方式保存。并对所做工作形成记录。 4.1.5 工作菌株因工作需要，从菌种库内领用的菌种经复制后生成工作菌株，此工作菌种可以营养琼脂斜面4℃～10℃冷藏保存，保存时间约2周。并对所做工作形成记录。 4.2 菌种的日常管理 4.2.1菌种保管由专人负责，实行双保管员保管； 4.2.2保存菌种的冰箱加锁，钥匙由菌种保管员持有； 4.3菌种的使用 4.3.1菌种使用者必须持主任签字的《菌种使用审核表》与保管人员预约菌种领用时间； 4.3.2菌种领用时必须在两位保管员同时在场时，才能进行； 4.3.3菌种使用完毕后及时归还；使用过程中的工作菌株一律不得外流，需妥善保管