实验八 补体结合试验
医学免疫学实验指导
实验八补体结合实验由长沙达尔锋生物科技有限公司整理
【文章介绍】
实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。
BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。
【实验目的】
1.熟悉补体结合试验的原理和方法及其应用。
2.了解溶血素单位、补体单位、抗原单位的测定方法。
【实验原理】
补体结合试验（complement fixation text ,CFT）是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统，来检测未知的抗原或抗体的血清学试验。有五种成分参与，分为指示系统和待检系统(已知抗原和未知抗体或已知抗体和未知抗原)。补体用新鲜豚鼠血清。方法是将已知的抗原或抗体与未知标本(可能含相应抗体或抗原)充分混合，再加入补体作用一段时间，最后加入指示系统。若待检系统有相应抗体或抗原，则能形成抗原抗体复合物，从而消耗了补体不出现溶血现象，此为阳性；相反，出现溶血则为阴性。补体结合试验的影响因素较多，正式试验前需对已知成分作一系列滴定，尤其是补体，应选择适宜的量参与反应，避免假性结果。每次试验尚需同时设立多种对照，以作为判断结果可靠性的依据。
该法对颗粒性或可溶性抗原均适用，临床上常用于检测某些病毒、立克次氏体和螺旋体感染者血清内的中的抗体，亦可用于某些病毒的分型。
一、溶血素单位滴定
【材料】
1.抗体：溶血素血清。
2.抗原：2％绵羊红细胞悬液。
3.补体：（1:30）取自豚鼠新鲜血清
4.其它：生理盐水、小试管、试管架、吸管、37℃水浴锅。
【方法与结果】
1.按下表8-1于各试管分别加入不同稀释的溶血素0.2ml及其成分。
2.充分混合后置于37℃水浴锅中30分钟，然后观察结果。
3.凡最高稀释度的溶血素可呈现完全溶血者为一个单位。举例：上表结果表明，第11管（即1：9600倍稀释）0.2毫升溶血素为一个单位，在溶血反应中常用0.2毫升中含有2个溶血
素单位的稀释液。配置时可取1：100倍稀释的溶血素1ml加生理盐水47ml。
二、补体单位滴定
【材料】
1.抗体：2单位溶血素。
2.抗原：2％绵羊红细胞悬液。
3.补体：（1:30）取自豚鼠新鲜血清
4.其它：生理盐水、小试管、试管架、吸管、37℃水浴锅。
【方法与结果】
1.按下表8-2于各试管分别加入1:30稀释液的补体。
2.依次加入其他各成分至每管中，37℃水浴一定时间后观察结果，判定补体单位。
3.补体单位：凡能使一定量红细胞发生完全溶解的最小补体量，称为1个确定单位。如上表中第3管开始出现溶血现象，因此第3管（0.1ml）所含补体量为1个确定单位。
由于在实际应用时补体有一部分损失，故须酌量增加一些，通常取其次高一管补体量称为1个实用单位。在下例中：
1个确定单位=0.1ml 1:30稀释的补体。
1个实用单位=0.12ml1:30稀释的补体。
4.补体的稀释：若使每0.2ml补体含2个实用单位，可照下法计算。
30:2×0.12=X:0.2
X=（0.2×30）÷0.24=25
即将补体稀释25倍，用0.2ml即可。
（三）正交试验
正交试验可以做定性的，液可以做定量的。本实验用伤寒杆菌的提取液为抗原与其免疫血清做定性实验。
【材料】
1.抗体：1:5稀释的伤寒血清。
2.抗原：1:50稀释的伤寒抗原，1:80稀释的痢疾抗原。
3.补体：（1:25）取自豚鼠新鲜血清。
4.指示系统：2单位溶血素，2%绵羊红细胞。
5.其它：同预备试验。
【方法】
按表8-3顺序操作。
【结果】
观察各管溶血情况，记录并分析其意义。
【注意事项】
1.以细菌作抗原时，应使用细菌的提取液而不用悬液，通常滴定找出最适稀释度。
2.血清需56℃30分钟灭活。
3.补体性质不稳定，以实验的当天采取效果最好，操作时尽量减少在室温停留的时间。
第五章 补体参与的反应
第五章补体参与的反应 内容 一、溶血试验 二、补体结合试验 一、溶血试验 当红细胞与相应抗体相结合，在电解质存在时，可使红细胞产生凝集现象；若同时加入新鲜动物血清，则血清中的补体可与红细胞及其抗体（溶血素）形成的免疫复合物结合，从而激活补体导致红细胞溶解，产生溶血现象。 【材料】 1、抗原：2%绵羊红细胞（简称SRBC）。 2、抗体：溶血素即（SRBC抗体）。 3、补体，新鲜豚鼠血清。 4、生理盐水。 5、小试管、刻度吸管、试管架、37℃水溶箱等。 【方法】 1、取小试管3支，编号后按下表加入各物（容量单位均为ml） 溶血试验加样表（表2—1）单位ml 管号2％红血球溶血素（2单位）补体（2单位）生理盐水结果 1 0.5 0.5 0.5 0.5 2 0.5 0.5 - 1.0 3 0.5 - 0.5 1.0 2、将试管摇匀后置37℃水箱内：15—30分钟，取出观察有无溶血现象； 3、结果观察：管底无血球沉淀，液体红色透明管为溶血。 注意分析结果及其意义，了解补体的性质与作用。 二、补体结合试验 凝集反应和沉淀反应分别是颗粒性抗原、可溶性抗原与特异抗体结合的结果。补体结合试验，则是基于抗原抗体复合物可以结合补体的原理，在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统来检测抗原或抗体是否发生特异性结合的一种抗原抗体反应。 补体结合试验有两个系统共五个成分参加：检测系统的已知抗原（或抗体）与持检抗体（或抗原）、补体、指示系统的绵羊红细胞和溶血素。依次加入检测系统成分与补体作用后再加指示系统，若不出现溶血，即为补体试验阳性，表示检测系统中抗原抗体相对应（待检标本中有相应抗体或抗原），形成抗原体复合物并结合了补体，指示系统因缺乏补体而不发生溶血；反之若出现溶血，则为补体试验阴性，表示检测系统的抗原抗体不对应（持检标本中无相应抗体或抗原），不能结合补体，游离的补体与后加入的指示系统结合，导致绵羊红细胞溶解。 补体结合试验敏感性和特异性均较高，可用于检测梅毒，立克次体病和病毒感染等患者体液中的抗体或抗原以辅助诊断，还可用于某些病毒的分型。但本试验操作繁琐，影响因素甚多，各种参与成分均需适量（在正式试验之前必须通过一系列预备试验来滴定补体、溶血素、抗原或抗体的单位，以确定其使用量），并需设立多种对照和使用洁净试管等，才能保证实验结果的可靠性。因此，近年来其应用日趋减少，而为其它新的免疫学方法所取代。 【材料】 1、抗原：（已知，并已经滴定调定）。 2、灭活的持检血清。阳性血清和阴性血清（56℃×30' 灭活）。 3、补体（2个使用单位）。
溶血素与补体激活实验报告
实验报告
4. 补体结合反应实验原理 补体结合反应是一种有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。参与本反应的五种成分可分为两个系统： 一为待检系统，即为已知抗原（或抗体）和待检抗体（或抗原）； 另一个为指示系统，即绵羊红细胞和其相应的溶血素。待检抗原、抗体和补体作用后，再加入指示系统。若待检系统中的抗原和抗体相对应，两者特异性结合后激活补体，补体被消耗。再加入的指示系统无补体结合，不出现溶血；若待检系统中的抗原与抗体不对应或缺少一方，补体不被激活，当指示系统加入后，绵羊红细胞和溶血素复合物激活补体，产生溶血现象。 5. 空斑形成实验 是一种体外检测IgM、IgG类型抗体产生细胞的实验方法，又称空斑形成细胞（PFC)测定。可作为评估药物影响抗体产生水平以及临床筛选抗肿瘤新药的重要依据。 经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞混合后，抗体形成细胞产生的抗体与绵羊红细胞结合；在补体参与下，绵羊红细胞溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
一、SRBC的制备 （一）无菌抽取绵羊血 1.手术剪减去绵羊颈部毛发备皮，止血带扎住颈部，碘酒消毒，酒精棉球再擦拭。 2.抽取一定量的绵羊血，注入无菌玻璃瓶，轻轻摇晃获得抗凝绵羊血，摇晃时不能用力过猛，防止SRBC破裂。 （二）绵羊红细胞的制备 1.在无菌实验室中，用移液枪吸取5ml抗凝绵羊血于试管中，共4支试管。 2.配平后对称放入离心机中2000rpm离心10分钟。 3.4支试管，胶头滴管吸去上清液，加入适量的灭菌生理盐水后轻轻摇晃混匀。 4.再次配平后，2000rpm离心10分钟，2-3次。 5.吸去上清液，获得绵羊红细胞。 （三）绵羊红细胞悬液制备 1.20%绵羊红细胞悬液制备 在无菌实验室中，用移液枪吸取2ml绵羊红细胞于锥形瓶中，用移液管再加入8ml灭菌生理盐水，混合均匀。 2.2%绵羊红细胞悬液制备 在无菌实验室中，用移液枪吸取1ml绵羊红细胞于锥形瓶中，量筒量取49ml无菌生理盐水加入锥形瓶，混合均匀。 二、溶血素的制备 （一）免疫接种程序
第十九章补体参与的反应及补体测定ComplementMediated
第十九章补体参与的反应及补体测定 Complement Mediated Reactions and Assays of Complement 第一部分目的要求和教学内容 一、目的要求 掌握：免疫溶血试验及CH，。测定的原理及意义；熟悉：补体参与的反应试验类型、补体依赖的细胞毒试验的原理、旁路途径溶血活性测定；了解：补体结合试验和免疫黏附试验的原理、C4和B因子活性测定的原理。 二、教学内容 1．补体参与的反应：免疫溶血试验，补体结合试验，补体依赖的细胞毒试验，免疫黏附试验。 2．补体的测定：补体活性的测定，补体含量的测定，补体测定的临床意义。 第二部分测试题 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1．溶血素效价滴定判定的温度和时间是 A．37℃、30min B．4℃、30min C．37℃、15min D．40℃、30min E．56℃、30min 2．在补体连锁反应中最终形成的攻膜复合体是 A．C5b6789 B．C4b2a3b C．C4b2b D．C3bBb E．C3b4b 3. 下列哪项试验没有补体参加 A．CH试验 B．CDC试验 C．溶血空斑试验 D．ADCC试验 E．Raji细胞试验 4．补体结合试验中所用补体是哪种动物血清 A．马血清 B．绵羊新鲜血清 C．豚鼠新鲜血清 D．大白鼠新鲜血清 E．山羊新鲜血清
5．下列哪项试验不能用于补体缺陷的过筛诊断 A．CDC式验 B．CH50试验 C．血清C3含量测定 D．血清Cl含量测定 E．C4溶血活性试验 6．B因子溶血活性测定中，在缓冲液中加．),．EGTA是为了螯合反应体系中的A．Mg2+离子 B．Ca2+离子 C．zn2+离子 D．Fe3+离子 E．P3+离子 7．在单个补体成分溶血活性测定中，用氨水处理是为了去除哪个补体成分A．C1 B．C2 C．C4 D．C5 E．C3 8．检测免疫小鼠脾细胞分泌到细胞外的抗SRBC抗体的试验是 A．CH50试验 B． CFT C，APH50测定 D．B因子活性测定 E．溶血空斑试验 9．利用溶血反应作为指示系统，判断抗原抗体是否相对应的试验是 A．CHs50试验 B．CFT C．APH50测定 D．B因子活性测定 E．抗补体试验 10．补体经典途径的最重要激活物是 A．特异性抗原 B．特异性抗体 C．抗原抗体复合物 D．细菌脂多糖 E、酵母多糖 11.正常血清中,补体含量最低的是 A.C1q B. C5aR C. C1rR D.Df E.C1INH 12.正常血清中,补体含量最高的是 A.C1 B.C2 C.C3
补体检测及其应用安徽理工大学
安徽理工大学医学院
（教案续页） 基本内容辅助手段和时间分配备注 第一节补体系统的性质与活化途径 一、补体系统的组成与性质 补体(complement，C)是存在于人和脊椎动物血清及组织中的一组具有酶样活性、不耐热和功能上连续反应的球蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，故称为补体系统。补体并非单一成分，而是由补体及其调节因子和相关膜蛋白以及补体受体共同组成的补体系统。补体系统广泛参与机体的抗感染防御反应，具有介导细胞溶解、调理吞噬、免疫黏附以及参与炎症反应引起机体免疫损伤等作用，是体内具有重要生物学功能的免疫效应和放大系统。 补体系统由30多种活性成分组成，按其性质和功能可以分为三大类：①补体系统的固有成分；②以可溶性或膜结合形式存在的补体调节蛋白； ③结合补体片段或调节补体生物学效应的补体受体受体(complement receptor，CR)。 由于由于补体系统组成和功能的复杂性，其命名较为复杂，一般有以下规律可循：参与补体经典邀活途径的固有成份，按其被发现的先后次序命名为C1、C2、……C9，其中Cl由Clq、Clr、Cls三种亚单位组成；补体系统的其他成分以英文大写字母表示，如B因子、D因子、P因子、H因子；补体调节蛋白多以功能命名，如Cl抑制物、C4结合蛋白和膜协同因子蛋白等；补体活化后的裂解片段，以该成分的符号后面附加小写英文字母表示，如C3a、C3b等；具有酶活性的成分或复合物，在其符号上划一横线表示，如Ci、C—3bB—b等；灭活的补体片段，在其符号前加英文字母i表示，如iC3b。补体性质不稳定，易受各种理化因素影响，加热、紫外线照射、机械振荡或某些添加剂等理化因素均可能破坏补体。在0-10℃补体活性可保持3～4天，冷冻干燥可较长时间保持其活性，加热56℃30 min即被灭活，所以补体活性检测标本应尽快进行测定。 补体多为糖蛋白，且多属于B球蛋白，少数为7球蛋白或a球蛋白，其中Clq分子量最大，D因子最小。正常血清中补体各组分含量相差较大，以C3含量最多，D因子最少。 二、补体活化途径 补体系统各组分通常以非活性的酶前体形式存在，只有在某些活化物的作用下，补体各组分便产生连锁酶促反应，又称级联反应，才表现出生
补体结合
第十一节补体结合反应技术 （Complement fixation reaction technique） 一、概况 可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂质和病毒等，与相应抗体结合后，抗原抗 体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入红细胞和溶血素，即 可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相应的抗原或抗体。这个反应 就是补体结合反应。 补体结合反应是一种古老的血清学技术，Bordet和Gengou在1901年设计这一 试验，由于有敏感性高和适应性广的优点，尽管操作繁杂，目前仍被有效地应用。 （一）补体及其作用特点 补体存在于哺乳动物血清中，各种动物比较，豚鼠血清中补体含量最高，成分 较全，效价稳定，采取方便，故通常将豚鼠的全血清作为补体。56℃30min可使补 体失去活性，称为“灭能”或“非动”。 补体的作用为能与抗原—抗体复合物结合，但不能与抗原单独结合，也不易与 抗体单独结合；补体的作用没有特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合。它能 与红细胞（抗原）和溶血素（抗体）的复合物结合，引起红细胞破坏（溶血），也能 与细菌、病毒成分及其相应抗体的复合物结合。 （二）溶血反应 将红细胞多次注射于动物（如将绵羊红细胞多次免疫家兔）可使之产生相应的抗体（溶血 素），这种抗体与红细胞结合，若有补体存在时，则红细胞被溶解，这种现象称为溶 血反应。红细胞和溶血素被称为溶血系统，常在补体结合反应中用作测定有无补体 游离存在的指示剂。 （三）补体结合反应及其原理 可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等或者颗粒性抗原，与相应抗体结 合后，其抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能觉察。如再加入红细 胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相对应的抗原 和抗体。此反应即为补体结合反应。 补体结合反应中的抗体主要是IgG和IgM。 反应的原理在于补体本身没有特异性，能与任何抗原抗体复合物结合。以检查 鼻疽病为例，先向试管中加入已知的抗原（鼻疽菌的浸出液），再加入被检马匹的血 ? 1 ?
补体结合试验
第二节补体结合试验 补体结合试验（complementfixationtest，cft）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。 一、类型及原理 该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图14-2）。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。
图14-2补体结合试验示意图 二、试验方法 补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。 （一）试剂 1．抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。2．抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓
免疫学实验
免疫学检验备考版 辛酸/硫酸铵法提纯IgG 在酸性条件下( pH4.5)，血清或腹水中非IgG的蛋白成份(包括白蛋白，部分Ig)，能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。辛酸/硫酸铵法比硫酸铵法能够获得更高纯度的IgG。 50%溶血试验（CH50）测定补体实验 绵羊红细胞（SRBC），与相应抗体（溶血素）结合后，可激活待检血清中的补体而导致SRBC 溶血。其溶血程度与血清中补体的含量和功能有关。由于补体含量与溶血程度之间呈正相关，但不是直线关系，而呈S曲线关系，故通常取反应曲线中间部位即50％溶血（CH50）为判定终点。由于抗原抗体复合物激活的是补体的经典途径，C1～9任何一种成分缺陷都可使CH50降低，所以此实验反映了总补体的活性。 补体结合试验的基本原理 抗原抗体复合物可以结合补体，这是补体结合试验的依据。绵羊红细胞和其相应抗体（溶血素）的复合物结合补体后出现溶血现象。因此，绵羊红细胞和溶血素被作为补体结合试验中判断待测系统中有无抗原抗体反应的复合物系统。如待测系统产生抗原抗体复合物，则可结合一定量补体，此时加入溶血系统则不出现溶血。如待测系统中只有抗原或抗体，不能结合补体，加入溶血系统则与游离补体结合而发生溶血，这就是补体结合试验的基本原理。 补体结合试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或 抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即SRBC与相应溶血素， 试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统， 先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。 如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加 入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。 如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当 加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。因此补体结合试验可用已知抗原 来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。 单向免疫扩散实验 (1)原理：待测抗原从局部含有定量抗体的凝胶内自由向周围扩散，抗原抗体特异性结合，在两者比例合适的部位，形成白色沉淀环，沉淀环的大小与抗原的浓度呈正相关。 (2)技术要点：将抗体和热融化琼脂(约50%)混合，倾注成平板。待凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入已稀释的抗原液，和不同浓度的抗原标准品，置37～12℃温箱，24～48h后观察孔周围沉淀环。量取沉淀环直径，通过抗原标准品，计算待测抗原的浓度。
补体实验报告
补体实验报告 篇一：补体结合试验 第二节补体结合试验 补体结合试验（complementfixationtest，cft）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。 一、类型及原理 自身免疫性溶血，如果有补体参与时，补体通过一系列的激活，最后形成膜攻击复合物（membrane attack complex），它可以直接攻击红细胞膜，导致红细胞破裂，这就是所谓“血管内溶血”。而没有补体参与的免疫性溶血，抗体与红细胞膜上抗原结合后，没有直接把红细胞破坏，而是把红细胞“致敏”，致敏RBC在通过脾脏等网状内皮系统时，被吞噬细胞“吃掉”，这就是所谓“血管外溶血”。 该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）； ②补体系统；③指示系统，即srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的
机会。 如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图14-2）。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。 图14-2补体结合试验示意图 二、试验方法 补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也 较好。以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。 （一）试剂 1．抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。 2．抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按
补体实验报告
补体结合实验 原理：补体无特异性，可与任何抗原抗体复合物结合而被激活，但不能与单独的抗原或抗体结合。 补体结合试验是一种有补体参与，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应体系。绵羊红细胞与溶血素结合后可激活补体，导致红细胞破坏，出现溶血现象。参与补体结合反应的五种成分可分为两个系统：(1)检测系统，已知抗原（或抗体）、待测抗体（或抗原）；（2）指示系统，SRBC、溶血素。待检测系统与补体作用后，加入指示系统，若不出现溶血，表示待测系统中的抗原抗体相对应；两者特异性结合形成抗原抗体复合物结合并消耗了补体，无游离的补体与指示系统结合，故不溶血，为补体结合试验阳性。反之，若出现溶血，则为补体结合试验阴性。 方法： 1.取五支试管，依次做好标记，放在试管架中。 2.按照下表加样。 结果： 结果分析： 1.羊血用前轻轻摇匀，避免剧烈正当引起溶血。 2.各种试剂的吸管不要混用。 3.补体的性质较不稳定，低温保存，加样时再从冰箱里取出。 4.水浴时避免水滴滴进试管。 5.本实验影响因素很多，对照组的反应情况是否正常是判断实验可信度的参照。 人外周血单个核细胞分离 原理：常用来分离人外周血单个核细胞的分离液是由聚蔗糖和泛影葡胺按一定比例混合制成。它分子量大又无化学活性，20摄氏度时比重约为1.077kg/L，淋巴细胞和单核细胞比重略小于分层液，为1.070kg/L左右。而粒细胞和红细胞比重大，为1.092 kg/L左右。通过离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布，淋巴细胞和单核细胞位于分离液的上层，而粒细胞和红细胞沉于离心管的管底，从而将淋巴细胞和单核细胞等单个核细胞分离出来。方法： 1.抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml Hank’s液 2.混匀后取3ml稀释液，沿试管壁缓慢加入到2ml分离液中。2000rpm,离心20min。
实验八 补体结合试验
医学免疫学实验指导 实验八补体结合实验由长沙达尔锋生物科技有限公司整理
【文章介绍】 实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。 BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。 【实验目的】 1.熟悉补体结合试验的原理和方法及其应用。 2.了解溶血素单位、补体单位、抗原单位的测定方法。 【实验原理】 补体结合试验（complement fixation text ,CFT）是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统，来检测未知的抗原或抗体的血清学试验。有五种成分参与，分为指示系统和待检系统(已知抗原和未知抗体或已知抗体和未知抗原)。补体用新鲜豚鼠血清。方法是将已知的抗原或抗体与未知标本(可能含相应抗体或抗原)充分混合，再加入补体作用一段时间，最后加入指示系统。若待检系统有相应抗体或抗原，则能形成抗原抗体复合物，从而消耗了补体不出现溶血现象，此为阳性；相反，出现溶血则为阴性。补体结合试验的影响因素较多，正式试验前需对已知成分作一系列滴定，尤其是补体，应选择适宜的量参与反应，避免假性结果。每次试验尚需同时设立多种对照，以作为判断结果可靠性的依据。 该法对颗粒性或可溶性抗原均适用，临床上常用于检测某些病毒、立克次氏体和螺旋体感染者血清内的中的抗体，亦可用于某些病毒的分型。 一、溶血素单位滴定 【材料】 1.抗体：溶血素血清。 2.抗原：2％绵羊红细胞悬液。 3.补体：（1:30）取自豚鼠新鲜血清 4.其它：生理盐水、小试管、试管架、吸管、37℃水浴锅。 【方法与结果】 1.按下表8-1于各试管分别加入不同稀释的溶血素0.2ml及其成分。 2.充分混合后置于37℃水浴锅中30分钟，然后观察结果。 3.凡最高稀释度的溶血素可呈现完全溶血者为一个单位。举例：上表结果表明，第11管（即1：9600倍稀释）0.2毫升溶血素为一个单位，在溶血反应中常用0.2毫升中含有2个溶血
试验三补体参与的免疫反应
实验三补体参与的免疫反应 一、溶血反应 1. 原理：绵羊红细胞在溶血素（绵羊红细胞的抗体）、补体均存在的条件下出现溶血。此溶血反应是补体结合试验的指示系统。 2. 方法：按照实验指导进行操作。 3. 现象观察与分析：观察溶血现象；分析第3、5管为何未出现溶血，分别缺什么成分。 二、补体结合试验（原理） 1. 原理：补体结合试验是补体参与，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统进行抗原或抗体检测的试验。以检测抗原为例，若待检系统有抗原，和已知抗体结合形成抗原抗体复合物，消耗补体；此时，再加入绵羊红细胞和溶血素，不出现溶血（补体全部消耗）或部分溶血（补体部分消耗）。若待检系统无抗原，只有已知抗体，无抗原抗体复合物，不消耗补体；此时，再加入绵羊红细胞和溶血素，出现溶血且溶血最完全（补体没有消耗）。最后根据溶血现象判断抗原的有无并可定量。
秋8周，周三，免疫实验 实验四免疫标记技术 一、概述 免疫标记技术是指将已知抗体或抗原用放射性核素、酶、荧光素、胶体金、化学发光物质或电子致密物质等标记物标记作为试剂，检测相应抗原或抗体的一类免疫实验技术。根据标记物不同，免疫标记技术分放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、金免疫技术、化学发光免疫技术等。 二、双抗体夹心法ELISA（以检测HBsAg为例） 1. 原理：ELISA全称酶联免疫吸附试验，属以酶作为标记物的酶免疫技术。ELISA用于标本中抗原或抗体测定。ELISA分双抗体夹心法、间接法、竞争法等不同方法。双抗体夹心法ELISA用于标本中的抗原测定。 2. 方法（以检测HBsAg为例）： 已知抗体（抗HBsAg）包被酶标板→洗板→封闭→洗板→加待检标本，设阳性对照、阴性对照→洗板→加酶标抗体（抗HBsAg）→洗板→加底物→观察结果。 3. 结果判断 肉眼观察：阳性对照显色，阴性对照未显色。待检标本显色为待检抗原（HBsAg）阳性，待检标本不显色为待检抗原（HBsAg）阴性 三、斑点免疫层析试验（以检测HCG为例） 1. 原理：斑点免疫层析试验属金免疫技术，以胶体金作为标记物。在斑点免疫层析试验，所有试剂预先组合在一个试剂条上。以检测HCG为例，所用试剂有金标抗体（金标抗HCG，为小鼠IgG）、测试区固相特异性抗体（抗HCG）、参照区固相抗小鼠IgG抗体。检测时，若待检标本HCG阳性，在测试区、参照区均出现红线（两条红线）；若待检标本HCG 阴性，仅参照区出现红线，测试区不出现红线（一条红线）。 2. 方法： 将试剂条一端浸入待检标本，5秒后取出；3分钟内观察结果。 3. 结果判断 在测试区、参照区均出现红线（两条红线），待检标本HCG阳性；参照区出现红线，测试区不出现红线（一条红线）待检标本HCG阴性；参照区不出现红线，试剂条失效。 实验五免疫细胞的分离纯化 一、概述 获得高纯度的免疫细胞是许多免疫实验基本前提。可根据免疫细胞的不同特点应用相应方法分离纯化免疫细胞。 二、外周血单个核细胞的分离（密度梯度离心法） 1. 原理：外周血单个核细胞（PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞。PMNC比重比红细胞和粒细胞比重小，利用比重介于两者之间的淋巴细胞分离液分离出PMNC。 2. 方法：。 抗凝血稀释→在离心管加入淋巴细胞分离液→将稀释的抗凝血叠加在淋巴细胞分离液上→水平离心→吸取单个核细胞层移入另一干净试管→洗涤单个核细胞→将单个核细胞重
补体结合试验
补体结合试验 补体是一组正常血清蛋白成分，可被免疫复合物激活产生具有裂解细胞壁的因子。如果该过程发生在红细胞表面上则导致红细胞裂解而出现溶血。利用这种反应来检测血清中的抗体或(抗原)，称作补体结合试验(Complement Fixation Test，CFT)。CFT准确性高，容易判定，对抗原纯化要求不严格，因而普遍用于传染病的诊断。该试验的不足之处是操作繁锁，尤其是对所用试剂的准备和量化要求较严。 (一) 原理CFT包括两个系统，第一为反应系统，又称溶菌系统，即已知抗原(或抗体)，被检血清 (或抗原)和补体。第二系统为指示系统(亦称溶血系统)，即溶血素＋绵羊红细胞，溶血素即抗绵羊红细胞抗体。补体常用豚鼠血清，它对红细胞具有较强的裂解能力。补体只能与抗原－抗体复合物结合并被激活产生溶血作用。因此，如果试验系中的抗原和抗体是对应的，形成了免疫复合物，定量的补体就被结合，这时加入指示系统，由于缺乏游离补体，就不产生溶血，即为阳性反应。反之试验系中缺乏抗原或特异性抗体，不能形成免疫复合物，补体就游离于反应液中，被指示系统，即溶血素＋绵羊红细胞免疫复合物激活，而发生溶血，即阴性反应。为了测定阳性血清中抗体的效价，可将血清作系列稀释，其结果是由完全不溶血逐步达到完全溶血，发生50%溶血的血清最高稀释倍数为该血清的抗体效价。 在进行CFT主试验之前，抗原、补体、绵羊红细胞和溶血素必须经仔细测定。所加补体的量必须准确，补体少导致不完全溶血，出现假阳性结果；反之，超量的补体不能被反应系统的免疫复合物完全结合从而出现假阴性结果。超量的抗原影响补体的结合，抗原不足不能完全结合补体。 在CFT操作中，经常遇到的一个问题是被检血清存在“抗补体作用”。即被检血清在无抗原存在的情况下结合补体。这有多种可能的原因，主要原因是血清取自感染动物，在血清中存在免疫复合物；或者血清被细菌污染，通过其它途径激活了补体。 (二) 分类补体结合试验分直接法、间接法和固相法。 1.直接法如图2-9所示，该法为最常用的操作方法，在试管中加抗原、被检血清和补体，在一定温度下感作一定时间后，加溶血素和红细胞，再感作一定时间后判定结果。直接法又根据试剂量的差异分为常量法和微量法。常量法试剂总量一般为0.5ml。微量法一般为0.125ml。前者在试管内进行，后者在U形底的96孔微量反应板内进行。
第6章 补体结合反应技术
? 1 ? 第六章 补体结合反应技术 （Complement fixation reaction technique ） 一、 概况 可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂质和病毒等，与相应抗体结合后，抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相应的抗原或抗体。这个反应就是补体结合反应。 补体结合反应是一种古老的血清学技术，Bordet 和Gengou 在1901年设计这一试验，由于有敏感性高和适应性广的优点，尽管操作繁杂，目前仍被有效地应用。 （一）补体及其作用特点 补体存在于哺乳动物血清中，各种动物比较，豚鼠血清中补体含量最高，成分较全，效价稳定，采取方便，故通常将豚鼠的全血清作为补体。56℃30min 可使补体失去活性，称为“灭能”或“非动”。 补体的作用为能与抗原—抗体复合物结合，但不能与抗原单独结合，也不易与抗体单独结合；补体的作用没有特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合。它能与红细胞（抗原）和溶血素（抗体）的复合物结合，引起红细胞破坏（溶血），也能与细菌、病毒成分及其相应抗体的复合物结合。 （二）溶血反应 将红细胞多次注射于动物（如将绵羊红细胞多次免疫家兔）可使之产生相应的抗体（溶血 素），这种抗体与红细胞结合，若有补体存在时，则红细胞被溶解，这种现象称为溶血反应。红细胞和溶血素被称为溶血系统，常在补体结合反应中用作测定有无补体游离存在的指示剂。 （三）补体结合反应及其原理 可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等或者颗粒性抗原，与相应抗体结合后，其抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能觉察。如再加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相对应的抗原和抗体。此反应即为补体结合反应。 补体结合反应中的抗体主要是IgG 和IgM 。 反应的原理在于补体本身没有特异性，能与任何抗原抗体复合物结合。以检查鼻疽病为例，先向试管中加入已知的抗原（鼻疽菌的浸出液），再加入被检马匹的血清（抗体）和豚鼠血清（补体），这三种成分称为反应系统或溶菌系统。如果该马是鼻疽病马，则血清中有抗鼻疽杆菌的抗体。抗原和抗体发生结合，吸附补体。如果该马没有鼻疽病，血清中没有抗鼻疽菌的抗体，则不能形成抗原抗体复合物，不能吸附补体，则补体游离存在。 由于许多抗原是非细胞性的，而且上述抗原、抗体和补体三种成分都是用生理盐水或缓冲盐水稀释的比较透明的液体，所以补体不论是否被结合，都不能直接看到，故无法判定。 因此，在反应系统的三种成分作用一定时间之后，再向其中添加指示系统—绵羊红细胞和特异性抗体溶血素。如果抗原和病马血清中抗体特异性结合，吸附补体，没有游离补体存在，加入指示系统，因无补体参加，不发生溶血，这种情况称为补体结合反应阳性，即该马患有鼻疽病；反之，则该马未患鼻疽病。 (四) 补体结合反应的特点 补体结合反应操作繁杂，且需十分细致，反应的各个因子的量必须有恰当的
中和试验
第五节中和试验 抗原与相应抗体在体内和体外均能发生特异性结合，因抗体主要来自血清，因此在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术。 第一节概述 免疫血清学技术按抗原抗体反应性质不同可分为： 1. 凝聚性反应包括凝集试验和沉淀试验。 2. 标记抗体技术包括荧光抗体、酶标抗体、放射性标记抗体、发光标记抗体技术等。 3. 补体参与的反应补体结合试验、免疫黏附试验等。 4. 中和反应病毒中和试验、毒素中和试验。 一、血清学反应的一般特点 1. 特异性与交叉性血清学反应具有高度特异性，如抗猪瘟病毒的抗体只能与猪瘟病毒结合，而不能与口蹄疫病毒结合。这是血清学试验用于分析各种抗原和进行疾病诊断的基础。 但若两种天然抗原之间含有部分共同抗原时，则发生交叉反应。交叉反应是区分血清型和亚型的重要依据。 2. 抗原抗体结合机理抗原和抗体的结合为弱能非共价键结合，其结合力决定于抗原决定簇和抗体的抗原结合点之间形成的非共价键的数量、性质和距离。 常规的血清学反应，如凝集反应、沉淀反应、补体结合反应等，只有在抗原与抗体呈适当比例时，结合反应才出现凝集，沉淀等可见反应，在最适比例时，反应最明显。 这种因抗原过多或抗体过多而出现抑制可见反应的现象，称为带现象。 二、血清学反应的影响因素 1.电解质特异性的抗原和抗体具有对应的极性基(羧基、氨基等)，它们互相吸附后，其电荷和极性被中和因而失去亲水性，变为憎水系统。 易受电解质作用失去电荷而互相凝聚、发生凝集或沉淀反应。 2.温度较高的温度可以增加抗原和抗体接触的机会，从而加速反应的出现。常用37℃水浴保温。 3.酸碱度血清学反应常用pH为6-8，过高或过低的pH可使抗原抗体复合物重新离解。 第二节凝聚性试验 抗原与相应抗体结合形成复合物，在有电解质存在下，复合物相互凝聚形成肉眼可见的凝聚小块或沉淀物，根据此现象来测定相应抗体或抗原，称为凝聚性试验。分为凝集试验和沉淀试验。 一、凝集试验 细菌、红细胞等颗粒性抗原，与相应抗体结合，在有适当电解质存在下，形成肉眼可
实验十 补体结合反应
实验十补体结合反应 目的要求 1．以鼻疽补体结合反应为例，了解补体结合反应术式的基本环节。 2．能独立运用本血清学反应的知识，作血清学检验。 操作步骤 一、材料准备 （一）溶血素从兽医生物药品厂购买，保存于冰箱中，有效期1年以上，1月之内效价变动不大，1月可以测一次效价。 （二）补体从兽医生物药品厂购买冻干补体，保存于冰箱，效价可半月测一次。也可以采3～4只成年雄性豚鼠血，分离血清，混合，保存于冰箱或冷处，24小时内应用。若检查材料多，需大量补体时，不从心脏采血，可由颈动脉放血于培养皿中，待血液凝固后移于冰箱次晨分离血清。如当日采血可直接离心分离血清。将混合的新鲜豚鼠血清，加入NaCl 达10％，置于冰箱或冷处，保存期可达数日或1周。 （三）绵羊颈静脉采血，盛于预先加玻珠的玻璃瓶中（或加有5％柠檬酸钠水溶液的玻瓶中），然后，将血分盛于离心管中，以每分钟1500～2000转离心10～15分钟，使红细胞下沉，吸弃上清液，加3～4倍生理盐水混合，再次离心，每分钟1500转15分钟。这样经第三次洗涤后，吸弃上清，将下沉的红细胞配成2.5％红细胞悬浮液（或临用前配制）。配制好的红细胞下沉液置5～10℃下保存，24小时内可应用。若发现溶血时需重新配制。 （四）鼻疽抗原从兽医生物药品厂购买。 （五）标准血清鼻疽阴、阳性血清由兽医生物药品厂购买。 （六）被检血清采取被检动物血清。分离血清后，用生理盐水稀释10倍，加热灭能，以破坏其中补体和其中可能含有的抗补体物质。马血清加热至58～59℃，维持30分钟，骡驴血清加热至63～64℃，维持40分钟。 （七）生理盐水蒸馏水中加入0.85％化学纯氯化钠，经灭菌后使用。 二、预备试验 （一）溶血素滴定将溶血素在水浴箱中加热至56℃、30分钟灭能。用生理盐水配成1:100的基础稀释液（0.1ml溶血素加入生理盐水9.9ml），取10个试管，按表10-1作各种稀释度（1:1000～1:5000）。 然后另取13支试管，按表10-2加入各成分。第11、12和13管分别为溶血素、补体与生理盐水对照管。摇振均匀，置37℃水浴箱中，10分钟后取出观察结果：若1～7管红细胞完全溶解，8管部分溶解，9～13管不溶解。溶血素的效价为1:3000，即能使红细胞完全溶解的最小溶血素量，称为溶血素的效价，亦称为一个单位。当补体滴定、抗原滴定、正式试验时，均用两个单位的溶血素（减少1倍稀释）。 （二）溶血素补体滴定按表10-3加入各成分。混合后置37℃水浴箱中，10分钟后取出检查结果。 补体、溶血素、生理盐水三个对照管均为不溶血（表10-3中12、13、14管）。 溶血系补体效价在有两个单位溶血素存在时，于37℃10分钟能完全溶解2.5％绵羊红细胞0.5毫升的最小补体量，为一个溶血系补体单位。溶血系补体效价为溶菌系补体测定提供用量的参考。