免疫学实验指导书(学生用..

关于实验报告的要求

实验过程：

通常实验过程的记录是同学的弱项，报告已经明确说明：要给出实验原始数据记录，实验现象记录，实验过程中发现的问题等。

现象记录要准确、科学，例如：台盼兰染色细胞后，死、活细胞的颜色或状态要给出。

过程的操作描述也要准确、科学，例如：荧光显微镜观察荧光时用到荧光组件时，我们会用到3、5光孔，而不是用3、5号灯；不用荧光时我们用的是普通白光，不能用“可见光”这个说法，因为可见光是相对于不可见光如：红外、紫外光的，这里我们用的荧光激发光也是可见光（兰光）。

结果与讨论：

这里给出结果，前面实验过程中给出过程中的现象、数据记录等，这里给出结果和讨论。

实验一外周血单个核细胞的分离

一、实验目的：

通过该实验了解常用细胞分离方法，掌握用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞以及单核细胞的具体操作方法。

二、基本原理：

细胞分离方法很多，请同学自己查阅或根据已经学过的知识总结。

本实验是利用不同的细胞之间密度不同的性质，通过速度沉降法来分离制备外周血中单个核细胞。

三、试剂与器材：

（1）外周抗凝血

（2）含5～10IU/ml肝素的PBS

（3）淋巴细胞分离液

（4）1%台盼兰染液（台盼兰溶于无血清PBS中）

（5）离心管

（6）小牛血清

（7）离心机

（8）移液管，吸耳球

（9）光学显微镜，细胞计数板

（10）滴管

四、操作步骤：

（一）分离过程：

1．取正常人抗凝血，加等量含5～10IU/ml肝素的无血清缓冲液悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上，室温中，水平离心500×g 20分钟。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是PBMC，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又称为棕黃层。

2．收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加1～2倍量含5IU/ml肝素、2％灭活小牛血清的PBS液（洗涤液），混匀后离心200×g 10分钟，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。

3．再用同样洗涤液洗涤细胞2次，每次离心500×g 10分钟，洗去残留的淋巴细胞分离液。

（二）、台盼兰染色（测定细胞存活率）

1．将1滴细胞悬液和1滴台盼兰混匀，静置5-10分钟。

2．上述混合液滴入细胞计数板，在显微镜下观察细胞，计数活细胞数和死细胞数。

（三）结果：

1．本实验回收的细胞中外周血单个核细胞占90%以上（细胞存活率应大于90%），粒细胞占0%~5%，血小板小于5%，红细胞0%~7%。

2．收集的外周血单个核细胞大约占初始细胞数目的40~60%。

五、实验要点：

1．抽血后在2小时内使用。

2．整个过程在室温下进行。

3．注意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在细胞分离液上，避免破坏其界面。

4．在一个较大容积（50ml）的试管中洗涤细胞，以便更好地出去多余的细胞分离液和血小板。

5．在收集单个核细胞时，预先将毛细滴管中的气体排空，再将毛细滴管轻轻插入单个核细胞层，沿管壁轻轻旋转吸取细胞，千万不能吹打，以免影响细胞的收集效果。

实验二、微量酶联免疫法测定IgG

[实验目的]

1．通过该实验学会并掌握酶联免疫实验的具体操作方法，进一步加深对原理的理解，巩固理论知识。

2．通过该实验，学会并掌握酶标仪的使用方法及工作原理。

[实验原理]

酶联免疫测定法实质上是将专一性很强的、十分灵敏的、能够定量进行的原抗体结合反应与高催化效能的酶促反应偶联在一起的一种分析方法。它除了用来测定抗体外，原则上适用于一切可以诱导动物产生相应抗体的抗原和半抗原物质的测定。其特点是专一性强．灵敏度高，操作简便，无须特殊设备，特别适用于测定成分复杂的体液及组织中的微量生命物质，而且几乎不受其他物质的干扰。

酶联免疫测定法应用非常广泛。具体操作方法随测定对象及测定要求的不同而有很大差异。除一般的液相竞争法外，还有固相吸附测定法，也就是酶联免疫吸附测定法(ELISA)简称酶标法。酶标法的基本测定方法有三类：即间接法(抗原-抗体-酶标抗抗体)、双抗体(夹心)法(抗体-抗原-酶标抗体)和抗原竞争法。

为检测抗体，可用间接法。先将已知抗原吸附在固相载体上，然后待测血清，如有相应抗体存在，则与抗体在载体表面形成抗体-抗原复合物。洗涤后加酶标抗抗体，保温后洗涤，加地物显色，加酸终止反应。有色产物的量与待测抗体的量呈正比。

为检测抗原，可用双抗体夹心法。先将特异性抗体吸附在固相载体上，然后加待测血清，如有

相应抗体存在，则与抗原在载体表面形成抗原-抗体复合物。洗涤后加酶标抗体，保温后洗涤，加地物显色，加酸终止反应。有色产物的量与待测抗体的量呈正比。

抗原竞争法原理是将抗体(或某些抗原)吸附于聚苯乙烯反应板的孔内壁(或别的载体)上，样品和一定量的酶标记抗原(或抗体)混合后加入反应板孔，使二者与抗体发生竞争性免疫结合反应。洗去未结合物后再以酶底物进行显色，比色定量。样品中抗原含量愈高，光吸收愈低。

本次实验检测血清IgG，应用的是双抗体夹心法。

[实验器材]

l、材料与试剂

(1)、抗人IgG抗体溶液，一般为兔、鼠或羊抗人IgG抗体

(2)、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG(HRP-抗人IgG，一般也为上述几种抗体的酶标记)溶液，

(3)、人IgG标准液

(4)、4mol/L硫酸溶液

(5) 、包被液: 0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液。取NaHCO3，2.93g，Na2C03，1.95g以水溶并定容至1000毫升，pH计校正。

(6)、保温液：0.075mol/L pH6.5磷酸缓冲液。取Na2HPO4·H2O(MW．356.22)8.6g，NaH2PO4·2H2O (MW．156.01)7.12g，Tween20(吐温)0.2ml，溶液定容100ml，pH计校正。临用前再加0.5％BSA(牛血清白蛋白)。

(7)、底物溶液：．先配制pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液：取柠檬酸6.53g，NaHPO4·H2O 93g，溶解定容1000ml。使用前称取40mg邻苯二胺(OPD)溶于100ml上述缓冲液中，再加入30％H2O2，0.15ml，置棕色瓶中，冷暗处保存，可用4小时。

(8)、待测样品液(血清)。

(9)、洗涤液pH7.4，0.01ml／L Tris-HCl缓冲液。

2、器皿

(1)、恒温培养箱，(2)、酶标光度计。(3)、聚苯乙烯反应板(带盖。40孔、55孔、96孔均可)。(4)容量瓶：50ml(或100m1)1只。(5)、试管及试管架。(6)、加样枪50ul、100u1、200ul各一支。(7)、吸水纸，(8)、停表。

[实验方法]

1、抗体包被：取酶标板，然后按所需孔数向其它孔加入用包被液稀释至工作浓度的抗体溶液(Ab)

每孔加量100微升（浓度10ug/ml），所有孔都加。勿使液滴沾在孔壁上部或出现气泡。加毕，盖好盖，置4℃冰箱过夜(或37℃，3小时)，用时倾去上述包被溶液，以洗涤液洗三次后甩干备用。标准曲线共5孔，样品孔2孔，共6孔，每孔均做一个平行孔。

2、标准曲线的制作及样品测定：将IgG标准品按倍比关系稀释成一系列浓度，见下，

C1 S1——S4 X1—X2 N P X1—X2

S1—S5：（标准人IgG ）50，100，200，300，500 ng/ml

原液1000ng/ml，因此S1—S5分别加10，20，40，60，100ul，再分别加入90，80，60，40，0ul 含BSA的保温液稀释即为终浓度，每孔总量为100微升。将待测样品稀释（含BSA保温液）为两个浓度(估计在标准曲线范围内1：20，1：40)，同法加入反应孔内，每孔100ul。加盖，置37℃保温箱中保温l小时，取出，倾去上述标准液和样品液，定量加洗涤液洗涤三次(每孔约200微升)。

3、加酶标记抗体：向各孔加入用保温液稀释成合适浓度的酶标记抗人IgG溶液100微升。加毕。

加盖，置37℃保温箱中保温45分钟。取出后保温平衡10分钟，倾出反应液，定量加洗涤液洗涤三次(每孔约200微升)，甩干备用。

4、酶反应：取酶底物溶液按顺序加入各孔，每孔50微升(或100微升)，置37'C恒温箱内反应15

分钟(或30分钟)。然后每孔加入4mol/L硫酸溶液50微升(或100微升)终止反应。

5、酶标仪测定结果，打印结果：显色后于酶标仪上测各孔492nm波长的光吸收值。

[结果处理]

1、以光吸收A492为纵坐标，IgG浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2、由样品吸收值从标准曲线上查出相应的IgG含量，再计算两个稀释度对应的样品浓度并求平均值。

3、将结果打印出来并附于实验报告上，报告中指出相关系数，标准差。

实验三、纳米金免疫检测抗原

胶体金（即纳米金微粒）标记技术(Colloidal gold marking technique)是从70年代初开始逐渐发展起来的。利用还原剂将氯化金分子聚合成具有特定大小的胶体金颗粒(gold particle，GP)，经生物大分子(IgG或SPA)包被后，作为一种特异性的标记探针，在生物分子检测方面得到广泛的应用。

一、实验目的：

巩固免疫金标记技术的应用原理，训练并掌握免疫金技术操作方法，能够达到设计新型抗原检测方法的水平。

二、基本原理：

免疫金检测除了电镜水平检测外，根据检测装置的不同可分为金免疫层析试验和金免疫渗滤试

验。

1、斑点金免疫渗滤试验

以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来建立的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验（dot immuno gold filtration assay，DIGFA），又名滴金免疫测定法（简称滴金法）。在滴金法中不需酶对底物的反应，更加简便、快速，在临床检验中应用日渐广泛。

以双抗体夹心法为例。在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等滤出膜片。其后加入的胶体金标记的抗体也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。

A B C

图1 DIGFA实验示意图

A.阳性对照

B.样品检测点

C.阴性对照

2、斑点免疫层析试验

斑点免疫层析试验（dot immuno chromatographic assay，DICA）简称免疫层析试验（ICA），也以硝酸纤维素膜为载体，但利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一般。

免疫层析试验以单克隆双抗体夹心法为例。试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被组合在一个约6mm×70mm的塑料板条上，成为一单一试剂条（图2），试剂条上端（A）和下端（B）分别粘贴吸水材料，免疫金复合物干片粘贴在近下端（C）处，紧贴其上为硝酸纤维素膜条。硝酸纤维素膜条上有两个反应区域，测试区（T）包被有特异抗体，参照区（R）包被有抗小鼠IgG。

图2 免疫层析试纸条装配示意图

检测样品时如图3所示，在硝酸纤维素膜上左侧（相当于图2中的C区）是包被了抗体的金纳

米粒，中间偏右（绿色）是针对检测抗原的抗体（相当于图2中的T区），最右边（紫色）是针对金纳米粒上抗体的抗体（图2中的R区），当有抗原沿膜向右扩散时，首先遇到带有抗体的金纳米粒，并与该抗体反应继续右行，当遇到中间针对抗原的抗体时，被该处的抗体捕获，使金纳米粒在此聚集，从而显示出颜色，未与抗原反应的纳米粒继续扩散至最右边，与抗抗体反应也得到聚集而显示颜色以检验纳米粒的有效性。

显然两种方法均可用肉眼直接观察，反应迅速，操作简单。

本实验选做斑点金免疫渗滤实验。

三、试剂与器材：

1．抗人IgG抗体：常用兔、鼠或羊抗人IgG抗体。

2．人IgG标准：做阳性对照（质控点）

3．检测样品：人血清

4．金标抗人IgG抗体

5．PH7.4 PBS（含BSA1%）

6．硝酸纤维素滤膜（NC膜）：0.45um

7．微量移液器

8．吸水纸

四、实验操作：

1．点加抗体（若实验用金标非抗人抗体时，此步略）：

在硝酸纤维素膜下垫吸水材料（卫生纸），用微量移液器取1-10ul抗体溶液（根据浓度求得该体积，使其中含抗体达到1-5ug）点于硝酸纤维素膜上，注意点样时要逐次点于膜上，待前次所点

液体渗入后再继续点，不要使斑点太大，同时注意不要太用力将膜点破。待膜渗透完成至干（一定要给蛋白质一定吸附时间，否则下步的洗涤有可能将抗体洗掉！）（可用干燥箱干燥或电吹风吹干）

2．洗涤、封闭：点加10ul 含1%BSA的PBS洗涤（BSA作用是封闭），待干（以使BSA充分吸附），点三个点（阳性对照，样品，阴性对照），注意事项同上。

3．点加抗原：

本实验样品用人血清，阳性对照用人IgG标准，阴性对照用BSA（前述已在洗涤时加BSA，所以此处阴性对照可不做任何处理），点样体积1-10ul（具体体积根据溶液浓度求得，使其中含待检抗原达到1-5ug），10ul PBS洗涤，待干（此处并不一定要求吸附时间，因为抗原抗体反应较快）。

4．点加金标抗体：

金标记抗体稀释至1：25-1：50，点加10ul，即可在样品和阳性对照点处观察到红色斑点，而阴性对照则无。

五、注意事项：

1．斑点大小控制。

2．勿用力戳破膜。

3．给第一抗体和封闭蛋白（BSA）一定吸附时间。

4．把你的实验结果粘贴于实验报告上，报告测定结果，指出阳性点和阴性点。

实验四、免疫荧光检测技术

荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。

荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。

该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。

一、实验目的：

1.通过该实验学会并掌握荧光免疫实验的具体操作方法，进一步加深对原理的理解，巩固理论

知识。

2. 通过该实验，学会并掌握荧光显微镜的使用方法及工作原理。

二、实验原理：

免疫荧光检测样品时可用：即间接法(抗原-抗体-荧光标记抗抗体)、双抗体(夹心)法(抗体-抗原-荧光抗体)和抗原竞争法。本实验采用夹心法，即双抗体夹心法。先将特异性抗体吸附在固相载体上，然后加待测样品，如有相应抗体存在，则与抗原在载体表面形成抗原-抗体复合物。洗涤后加荧光标记抗体，保温后洗涤，荧光显微镜下观察荧光或者荧光分光光度计检测荧光强度。

荧光强度与待测样本中的抗原的量呈正比。

本实验检测人血清IgG。

三、试剂与器材：

l、材料与试剂

(1)、抗人IgG抗体溶液

(2)、FITC标记的抗人IgG抗体。

(3)、人IgG标准液

(4)、（见实验二）包被液: 0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液。取NaHCO3，2.93g，Na2C03，1.95g 以水溶并定容至1000毫升，pH计校正。

(5)、（见实验二）保温液：0.075mol/L pH6.5磷酸缓冲液。取Na2HPO4·H2O(MW．356.22)8.6g，NaH2PO4·2H2O (MW．156.01)7.12g，Tween20(吐温)0.2ml，溶液定容100ml，pH计校正。临用前再加0.5％BSA(牛血清白蛋白)。

(6)、待测样品液(人血清)。

(7)、洗涤液pH7.4，0.01ml／L Tris-HCl缓冲液。

2、器皿

(1)、恒温培养箱，(2)、荧光显微镜或荧光分光光度计。(3)、聚苯乙烯反应板(带盖。40孔、55孔、96孔均可)。(4)容量瓶：50ml(或100m1)1只。(5)、试管及试管架。(6)、加样枪50ul、100u1、200ul各一支。(7)、吸水纸。

四、实验方法（见实验二实验方法）

1、抗体包被：（同实验二）

2、加样本：同实验二，但在本实验中不做标准曲线，样品加两个稀释浓度，如1：20，1：40，

另外加一个阳性对照（用人IgG标准），每孔做一个复孔，加空白对照共计8孔。

3、加荧光抗体：从这里开始与实验二不同之处室一定要记得避光操作。按照要求加入一定稀释

度的荧光标记抗人IgG抗体（一般为1：500倍左右），避光37℃保温箱中保温30-45分钟。五、结果处理：

于荧光显微镜下观察荧光，并照相，于实验报告上附上你获得的荧光照片，图片标明照片样本、显微镜放大倍数等。