白腐真菌

白腐真菌

前言

白腐真菌(white rot fungi)为丝状真菌，系木腐真菌(wood—degrading fungi)的一种，绝大多数为担子菌纲，少数为子囊菌纲，着生在木材上，因其能降解木材中的木质素、纤维素和半纤维素使木材呈现特征性的白色腐朽状而得名。日前研究最多的有：黄孢原毛平革菌(Phanerochete chrysosporium)[1]、彩绒草盖菌(Coridusversicolor)、变色栓菌(Thametes versicolor)、射脉菌(Phlebia radiata)、风尾菇(Pleurotus pul—mononanus)等。其中黄孢原毛平革菌是其典型种，也是研究木质素降解的模式菌。白腐真菌是已知的唯一能在纯系培养中有效地将木质素降解为CO2和H2O 的一类微生物。木质素是由苯丙烷单元通过醚键和碳一碳键连接而成的具有三维空间结构的高分子芳香族类聚合物。组成单元的结构及其连接键复杂而稳定，使得木质素很难降解[2]。木质素结构的异质性和不规则性，决定了对其生物降解的复杂性和特殊性。白腐真菌经过长期进化，形成了相应的适应性特性：白腐真菌能分泌氧化酶到胞外，在催化氧化过程中形成自由基，进而攻击木质素结构，此过程不需要特异的电子供体，因此其作用具有非特异性[3]。1983年Kirk和Gold两个研究小组发现能够利用白腐真菌的上述生物学特性降解染料[4,5]。此后，白腐真菌受到许多研究者的高度关注，并在将白腐真菌应用于降解诸如染料、三硝基甲苯(TNT)等许多难降解有机物方面进行了有成效的探索[6]，在木质素降解酶的生理生化过程以及基因调控方面获得了一些有意义的研究成果。以下就酶系统基因结构，催化机制，应用及新发展几方面进行介绍。木质素降解酶系统

白腐真菌依赖一系列酶催化反应实现对难降解有机物的转化，这一过程殊为复杂，其中的关键酶系为木质素降解酶系。木质素降解酶主要包括了3 种酶:木质素过氧化物酶( lignin peroxidase，LiP) 、锰过氧化物酶( mangnase peroxidase，MnP) 、漆酶( laccase，Lac) 这3 种木质素降解酶均能单独降解木质素，也能两两联合，或者3 种酶一起作用对木质素进行降解。

1、木质素降解酶的比较

1.1 LiP、MnP 和Lac 三种酶的结构及组成特点

LiP 和MnP 都属于以H2O2为电子受体的过氧化物酶类，化学本质都是含血红素的糖蛋白。LiP 有多种同工酶，分子量约为41 －44 kD，由10 条长的蛋白质单链和 1 条短的蛋白质单链组成[7,8]。酶的活动中心由包埋在蛋白质内的血红素构成，并由4个二硫键和2 个Ca2 + 来维持其活性部位的结构。MnP 也有多种同工酶，分子量约在40 －70 kD 之间，同样由10 条长的蛋白质单链和1 条短的蛋白质单链组成[8,9]。MnP 的催化活性中心不仅含有血红素，还含有1个Mn2 + ; LiP 的同工酶大多数发生了磷酸化，但MnP 同工酶都没有发生磷酸化; LiP 的C 端在血红素的两个丙氨酸根之间，MnP 的C 端与血红素基是分开的[11]。

Lac 与LiP 和MnP 分属于不同的酶类，是一种含多铜的多酚氧化酶，其化学本质也是一种糖蛋白。因为Lac 基因具有多样性，且Lac 基因的表达调控在不同的真菌中有较大差异，所以Lac 的同工酶具有多样性。Lac 的分子量约在38 －150 kD 之间，其分子由520 －550 个氨基酸的单一多肽组成[8,10]。典型铜蛋白结构的Lac 的活性中心含有4 个Cu2 +，2个Cu2 + 之间通过水桥( -OH-) 联接

1.2 三种酶的分布情况

三种木质素降解酶的分布范围不相同，Lac 最早是日本学者Yoshida 从漆树渗出物中分离得到的，后来证实在细菌、真菌及高等植物，甚至是某些昆虫中都存在，在自然界中的分布范围最为广泛; LiP 最先在黄孢原毛平革菌( Phanerochaete chrysosporium) 中被发现的，是白腐菌中最早被发现的木质素降解酶，普遍存在于白腐菌中，并且在某些放线菌、藻类中也有发现，MnP 最初也是在黄孢原毛平革菌( P．chrysosporium)中发现的，后经证实广泛存在于白腐菌中的担子菌纲中

1.3三种木质素降解酶分泌的时间

白腐菌在培养基营养丰富时会优先利用易降解的碳源，因此白腐菌对木质素的降解一般发生在次生代谢阶段。Lac 并不是严格限氮的次级代谢产物，而LiP 和MnP 是严格的次级代谢产物，一般在限氮或限碳的情况下才能产生。从分泌时间上看，三种酶也并非同时分泌。

2、三种木质素降解酶的催化作用及催化循环过程

LiP 能催化各种非酚型木质素模式化合物及芳烃类污染物的氧化，在木质素的降解过程中，LiP 催化的反应主要有: 苄醇的氧化、C-C 键断裂( 包括侧链断裂和开环) 、羟基化、脱甲氧基、脱甲基、氧化性脱氯及酚二聚化或聚合等; MnP 能催化木质素模式化合物、木质素以及各类酚类化合物等的氧化。在木质素的降解过程中，MnP 催化的反应主要有: Cα-Cβ键断裂、C-O 键断裂、芳基－芳基断裂及甲氧基断裂等; Lac 也能催化多种酚类化合物的氧化，其催化的反应主要有: Cα-Cβ键断裂、Cα-O 键断裂、脱甲基、氧化性脱氯、苄醇氧化、氧化性聚合和解聚等。

LiP 的催化氧化与其他过氧化物酶一样，需要H2O2首先对其进行氧化，使其氧化为酶的中间体compoundⅠ( LiPⅠ) ( H2O2使血红素发生2 个电子的氧化后，LiP 的酶活性中心的血红素被夺取了2个电子，天然状态被改变，其血红素中的Fe3 + 氧化成Fe4 + ，同时血红素成为一种阳离子自由基，此时即为LiPⅠ状态) 。LiPⅠ是一种不稳定状态，能夺取底物分子的1 个电子，使底物氧化成阳离子自由基，同时自身还原成另一种中间体compoundⅡ( LiPⅡ) ( LiPⅡ的血红素中含有不稳定的高价态Fe离子) ，LiPⅡ再通过夺取底物分子的1 个电子，使血红素中的Fe4 + 还原成Fe3 + ，LiPⅡ恢复成天然状态的LiP。在此循环过程中产生的阳离子自由基再去进攻其他底物，进而引发一系列自由基反应( 图1) [11,12]

图1 Lip的催化循环

MnP 的催化循环也需要H2O2启动催化循环，同时在催化反应过程中都有酶的中间体产生，中间体同样是由于血红素中的Fe3 + 变化而产生的，但MnP 在催化反应过程需要通过Mn2 + 对电子进行传递。在催化循环初始阶段，首先是H2O2将MnP 氧化成compoundⅠ( MnPⅠ) ( MnPⅠ的形成过程同LipⅠ的形成过程) ，MnPⅠ可以通过夺取MnⅡ( Mn2 + ) 中的1 个电子，自身还原成compoundⅡ

( MnPⅡ) ，同时Mn2 + 被氧化成MnⅢ( Mn3 + ) ; MnPⅠ也可以通过直接夺取底物中的1 个电子形成Mn2 + ，此时底物直接被氧化成阳离子自由基。此过程中形成的MnPⅡ再夺取Mn2 + 中的1 个电子，使其自身恢复成天然状态的MnP，同时Mn2 + 被氧化成Mn3 +。MnP 催化循环过程中产生的Mn3 + 是一种强氧化剂，被有机酸( 如草酸) 螯合后，离开MnP 的活性中心，可以将底物氧化成阳离子自由基，进而引发一系列的自由基反应( 图2) [11,12]。

图2 MnP催化循环

Lac 催化循环其分子结构不存在血红素结构，Lac 的催化循环不需要H2O2启动，就能直接进行。Lac 的活动中心由4 个Cu2 + 组成，Lac 的催化反应是通过在这4 个Cu2 + 之间进行电子传递实现的。通常Lac 偏好夺取酚类化合物的电子，将其氧化为苯氧自由基，苯氧自由基再促发一系列的自由基反应( 图3) ，同时夺取的电子先与Ⅰ型Cu2 + 结合，再通过Cys-His 途径将电子传递到三核铜簇，随后三核铜簇把电子传递给O2，使之还原成H2O[13]。

图3 Lac的催化循环

4、三种木质素降解酶在木质素降解过程中的相互作用

在自然界中，除灰盖鬼伞( Coprinus cinereus) 、原毛平革菌属的Phanerochaete sordida 和朱红栓菌( Trametes cinnabarina) 等少数白腐菌只能分泌一种木质素降解酶外[14]，绝大多数白腐菌能够同时分泌2 种或3 种木质素降解酶。因此，在自然界白腐菌降解木质素时，通常也是两种或两种以上的木质素降解酶共同降解木质素。

4.1 MnP 与LiP 的相互作用

LiP 和MnP 共同降解木质素时，二者可以相互作用，共同降解木质素。H2O2是MnP 和LiP 催化循环的共底物，通常情况下，白腐菌通过产H2O2酶系提供H2O2，但MnP 也在Mn2 + 和O2的参与下，使氧化谷胱甘肽( GSH) 或还原性辅酶Ⅱ( NADPH) 产生H2O2。因此，在木质素降解过程中MnP 可以为LiP 的降解反应提供H2O2Mn2 + 对于MnP 的催化循环是不可缺少的递电子体，而当反应体系中存在LiP 的底物时，LiP 同样会将Mn2 + 氧化成Mn3 + ，从而使Mn2 + 成为能够参与MnP 和LiP 催化循环的共底物。

4.2 Lac 与LiP、MnP 的相互作用

Lac 同时具有催化解聚和聚合木质素的作用，理论上Lac 单独存在时不能很好地降解木质素，只有反应体系中同时存在MnP、LiP、GOD 和CDH 等其他酶，以避免降解木质素重新聚合时，才能较好地降解木质素［15，16］。因此Lac 对木质素的降解在一定程度上依赖MnP、LiP 和GOD 等酶对木质素的降解。另一方面，在木质素降解过程中，LiP 和MnP 的催化循环都需要H2O2的启动，因此在自然状态下，LiP 和MnP 对木质素的降解都依赖产H2O2酶系提供H2O2而Lac 能够催化酚型二聚体模型物的β-1和β-O-4 等结构，或者催化氧化单体木质素模型物产生甲氧基取代的醌，而醌正是产H2O2酶系所需O2的来源，由此3种木质素降解酶就建立起了一定的联系，可以相互作用，共同降解木质素[10]。

5、白腐真菌降解机理

细胞学定位表明白腐真菌对木质素的降解发生在细胞外，这种细胞外降解系统为众多不可水解的、异质的、结构复杂的大分子有机物提供更易被处置的调节环境。白腐真菌能以自由基为基础的链式反应过程对木质素进行降解。先是木质素解聚，形成许多有高度活性的自由基中间体，继而以链式反应方式产生许多不同的自由基，导致各种连接键断裂，使木质素解聚成各种低分子量片段，其中小于l kf的

占多数．再经完全彻底氧化直到降解为C02。这种自由基反应是高度非特异性和无立体选择性的，正好对应于木质素结构的多变性，方能完成这种异质大分子高聚物的瓦解。木质素过氧化物酶(Lip)以低浓度H2O2为氧化剂，经历1个双电子氧化步骤和2个单电子还原步骤，使1非酚型芳香族底物形成阳离子自由基，后者再进行一系列非酶催化的反应从而导致芳香环裂解。当H2O2和二羧酸螯合剂(如内二酸盐和草酸盐)存在时，锰过氧化物酶(Mnp)能氧化Mn2+成为Mn3+，后者再进一步氧化各类酚型化合物。在许多真菌中，Mnp是木质素起始降解的关键酶。因为Mnp可产生强氧化态的Mn3+。Mn3+又可作为可扩散的氧化还原介质再进一步裂解木质素聚合物中的芳香环部分．然后在其他酶的协同作用下，最终导致大分子的断裂。

6、木质素降解酶的分子生物学研究进展

6.1 木质素过氧化物酶基因

P.chrysosporium lip的基因组成已基本明确。其LiP家族由至少10个结构上紧密关联的基因编码，它们分别被命名为lipA～lipJ，定位于4个连锁群，每个基因还有不同形式的等位基因。1999年Stewart等完成了lipG和lipJ的测序工作，在此基础上，stewart等按基因的内含子和外显子的结构，将P.chrysosporium lip的lip基因分为5个可明显区分的亚家族，其中lipA，lipB，lipE，lipG，lipH，lipJ 同属一个亚家族，另外4个lip基因分别为单独的亚家族。Stewart等还建立了lip 基因的物理图谱，4个基因lipA、lipB、lipC、lipE定位于一个35 kb的区域，lipG、lipH、lipJ、lipI定位于一个15 kb的区域，lipD和lipF不与其他的基因相连；lipA 与lipB、lipG与lipJ、lipH与lipJ分别以相反的转录方向成对位于染色体上

6.2 锰过氧化物酶基因

从P．chrysosporium的胞外液中分离出至少6种Mnp的同工酶，均由多基因编码。Mnp基因含有6个或7个内含子，50—72 bp．6个内含子的位置是保守的。mRNA位点也同样是保守的．遵循GA—TG法则。Mnp基因5’端上游序列在启动子保守盒(TATA和CAAT盒)，翻译位点高度保守(GCAATGG)，具有一些保守顺式凋控元件，如AP2、热激应答元件(HRH)、金属离子应答元件(MRE)。在基因表达方面．Mnp的产生明显依赖Mn2+浓度、培养基、热休克、C和N源变化。且调节是在转录水平上[17]。

6.3 漆酶基因

漆酶是由一个结构相近的基因家族编码，许多真菌的漆酶基因已被克隆和测序。Eduardo karahanian等从Coprnus cinerens中克隆出了3个漆酶基因Lacl、Lac2和Lac3，其中，lacl含7个内含子，大小为54—70hp，成熟蛋白约521个氨基酸，有3个潜在的N一连接糖基化位点，C端有23个氨基酸的延伸序列，富含Arg和Lys，其酶蛋白成熟至少需剔除信号肽、前体肽和C端延伸区。Lac2和Lac3均有13个内含子．表达出的成熟蛋白氨基酸同源性80％。Lac3和Lacl的氨基酸同源性58％，Lac2和Lacl的氨基酸同源性59％，而Lac3与Aspergillus nidulan漆酶的氨基酸问源性只有18％。因此．真菌漆酶之间的氨基酸同源性较低，但在铜结合区具有较高保守型[18]。

7、白腐真菌的应用

7.1农作物秸秆的饲料化。

白腐真菌不仅可以将秸秆等农副产品中动物难以利用的木质素进行降解。还可以把秸秆中的低质非蛋白氮(NPN)转化为较高质量的菌体蛋白。经白腐真菌处理后的秸秆不仅营养成分有了极大提高。而且有水果香味，并且秸秆质地柔软，适口性明显改善[19]。用白腐真菌处理秸秆饲料时。秸秆饲料不需要进行化学或物理预处理，对底物没有选择性[20]。

7.2造纸工业。

白腐真菌降解木质素广泛应用于造纸工业中的生物机械制浆、生物漂白及废水处理等过程[21]。生物机械制浆是指在机械制浆之前，利用自腐真菌对木片进行预处理，降低磨浆能耗及提高产品质量。

7.3食品工业。

在食品工业中，由于啤酒、果汁等饮料中含有酚或芳胺类物质。因而在生产以及储存期间常常出现浑浊或沉淀。可以利用白腐真菌木质素降解酶中的漆酶氧化饮料中的多酚物质。达到净化饮料的目的[22]。

7.4生物堆肥。

生物堆肥是指利用微生物的降解作用将秸秆等有机物转化为有机肥料的1种资源化方法。由于白腐真菌在生长活动中分泌木素降解酶、纤维素降解酶以及半纤维素降解酶。将自腐真菌应用到堆肥中，可以有效地降解秸秆中的木质纤维素，

再将木质纤维素转化为腐殖质[23].在堆肥中接种白腐真菌菌剂，可加速堆肥过程，使堆肥中木质素降解更为彻底。

7.5降解染料类化合物

很多染料对微生物有毒性，且需氧条件下难以降解而厌氧条件下容易产生有毒物质，因此传统生物处理受到了限制。白腐真菌可通过其分泌降解酶系将各种人工合成的染料彻底降解为CO2和H20，且对脱色具有良好的作用。

7.6造纸废水

造纸废水中主要的污染成分是木质素及其衍生物。木质素对微生物攻击有极大抗性。白腐菌能将漂白废水中的有机氯化物转变成无机氯和CO2。白腐真菌因其降解木质素和其相关化合物的潜力倍受关注。

7.7对芳香污染物的降解

近年来，白腐真菌对芳香性污染化合物降解的研究成了环境科学的研究热点问题。这种处理不但降解程度较高，且能达到相当程度的矿物化效果。

7.8降解火炸药生产废水

进来年来，白腐真菌的生物降解能力被用来处理火炸药生产废水，为火炸药废水的高效处理和不断规模化带来了曙光。白腐真菌生物降解与其他技术，如电化学技术、物理技术、物理化学技术等结合的方法来处理火炸药废水中的TNT、RDx、硝基苯等难降解有机物已经初具规模，并在不断更新壮大。

总结

白腐真菌以其独特的生理生化机制和强大的降解代谢能力而成为木质素降解研究的模式菌株。在对白腐真菌降解作用的研究越来越深入的今天，三种木质素降解酶在木质素降解中的具体功能，以及它们之间的具体协同机制等问题有待进一步的研究。白腐真菌作为降解木质素最有效的真菌，其应用前景非常广阔。随着研究的不断深入，人们对白腐真菌降解木质素的机理以及产酶机理有了较多了解。但在实际应用中，仍存在不少问题。如菌株合成木质素降解酶系的周期长、产酶量低、抗杂菌能力差等问题，制约了白腐真菌在工业化生产中的应用。因此，需要加强农业、生物、化工等多学科交叉研究，开发出产高效低能耗的木质素分解菌种以及能在饲料上迅速生长，且与杂菌在生长竞争中处于生物量的绝对优势的优良菌种，并探索影响酶合成和活性的各种因子的作用规律，以满足工业化生

产需要。

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