(3)理解基因突变的检测方法
第十章基因突变
一、教学目的与要求：
（1）了解基因突变的类型和性质、特征
（2）掌握基因突变分子机理和诱变因素的作用方式
（3）理解基因突变的检测方法
(4) 掌握基因突变的修复途径
二、教学重点、难点、疑点：
1.突变的概念、类型和性质
2.诱发突变的分子基础
3.诱发突变与人类癌症
4.生物体基因突变的修复机制
5.果蝇基因突变的检出
6.植物基因突变的检出
7.人类基因突变的检出
[解决方法]
（1）通过出示基因结构变化的示意图，加深学生对基因突变内涵的理解。
（2）课堂教学中不断提出问题，让学生通过概念的运用达到巩固概念和知识迁移的目的。
2．教学难点及解决办法
基因突变的原因。
[解决办法]
对人类镰刀型细胞贫血症病因结合图解进行分析，使学生真正明白基因突变的原因——DNA复制过程也可能发生差错，基因中个别碱基的变化，就会造成性状改变。
3．教学疑点及解决办法
为什么说基因突变是变异的主要来源？
[解决办法]讲明基因突变与基因重组的区别，联系实际举例。
三、教学方法设计：
四、教具或教学手段：多媒体课件
五、教学过程与板书设计：
第一节基因突变的概念和特征
一、基因突变的概念及类别
1、基因突变：指在染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变基因突变：指染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变
2、类别
隐性突变：A a
显性突变：a A
自发突变—外界环境条件的自然作用或生物体内的生理生化变化而产生的突变
诱发突变—在专门诱变因素影响引起的突变，为“诱发突变”
形态突变型—可见突变：指造成外形改变的突变型
至死突变型—能造成个体死亡或生命力明显下降的突变型
条件突变型—在一定条件下有致死效应
3.一般特征
①突变的频率：指生物体在每一世代中发生突变的机率，或者在一定时
间内突变可能发生的次数。
高等植物 10-5— 10-8
细菌和噬菌体 10-4—10-10范围大、突变频率比动植物高
例如：氨基酸过程中三种疾病是由三种基因突变导致酶发生变化引起的，有一定的突变频率
苯丙氨酸羟化酶缺乏导致苯丙酮尿症；尿黑尿酸氧化酶缺乏会产生尿黑酸尿症；酪氨酸酶缺乏导致白化病
苯丙氨酸羟化酶
苯丙酮酸苯丙氨酸酪氨酸
积累尿黑尿酸氧化酶
酪氨酸酶
苯丙酮尿症尿黑酸黑色素
延胡索酸+乙酰乙酸
突变频率不是固定不变的，受生理、外界环境的影响
温度：0—25℃，温度每增加1℃突变频率提高二倍
年份：储存了6—7年的大麦种子500r射线后比新种子高15倍
②突变发生的时期：
体细胞〈性细胞突变越早，表现的性状越明显
③突变的多向性：
虽然是多向性的，但不是可以任意发生突变，突变的方向受构成基因的化学物资、物质的制约。
④突变的重演性：同种生物中相同基因的突变可以在不同的个体中重复
出现，这称为突变的重组性。
⑤突变的可逆性： A a 隐性突变（正向突变）多
a A 显性突变（回复突变）少
任何离开野生型等位基因的变化为正向突变（forward m.）与正向突变概念相对的是任何回复到野生型的变化称为显性突变或回复突变（reverse m）。这一点与染色体缺失造成的突变不同。基因突变可以得到恢复，而染色体缺失不能得到恢复。
⑥突变的有利性与有害性：
大多数突变为不利于生物生长的突变。原因是，长期适应和选择保留了有利性状，一旦突变变为不利性状。
少数有利性状：高杆矮杆；有害与有利是相对
第二节突变检测
大突变：控制质显性性状的基因突变为大突变。
微突变：控制数显性性状的基因突变为微突变。
一、植物的显性和隐性突变出现的一般规律。
等位基因在一般情况只有其中的一个基因发生突变，另一个不突变。如何检测发生了那种突变，如何选出突变的纯合体，是要跟据突变体出现的早晚和基因纯和速度快慢来判断。
显性突变亲本 dd
Dd⊕ M1 突变一代（长杆植株）在M1代表现出来
⊕⊕⊕
DD Dd dd M2 （纯合与杂合混在一起）
DD DD Dd dd M3（获得纯合突变体） M3代才能获得纯合植株。
显性突变M1代出现，M3代检出
亲本 AA
↓
Aa⊕ M1（没有表现）
↓
AA Aa aa M2 (表现纯合)
隐性突变比显性突变表现的晚一代，但纯和速度早一代。
二果蝇突变的检出
1、性连锁基因突变的检出--- ClB品系方法
主要用来检测X染色体上是否发生了致死突变、隐性突变等。
ClB是指果蝇的某个品系，X染色体上有一个较大的倒位，记做C,后代中也保持这个倒位环。l为X染色体的隐性致死基因,雄个体有l基因时不能存活。而雌蝇仅有一个l基因时存活。B是X染色体上一个标记棒眼性状的基因。
ClB方法：
第一步：CIB雌蝇与被检测雄蝇杂交
后代雌蝇∶雄蝇 = 2∶1，雌蝇中一半是棒眼，由于被检测出的chr均在雌蝇上，都有对应的等位基因，所以不能检测出是否发生了致死突变。
第二步：选出棒眼雌蝇×一般雄蝇（非被检测雄蝇）
①如果在被检测的X染色体上发生了致死突变，F2无雄性
② X染色体发生了隐性突变，雄蝇则全部带有该隐性突变性状。雌蝇一半棒眼，
一半野生
③如果X染色体没有发生隐性突变，雌蝇棒眼∶野生=1∶1，野生雄蝇仅为雌蝇
一半
2 常染色体基因突变的检出
平衡致死系统法
第二对染色体 cy +
cy + 纯合致死
第二对染色体另一位点
+ S
+ S 纯合致死
cy +
+ S 杂合时不致死
cy +
+ S
F1 雌 cy + + S
雄 cy + + S
从F1代中选出翘翅雄蝇再与平衡致死的品系雌蝇成对饲养。
Cy × cy + + S
B1
♀ ♂ cy + + S
cy + cy + + S
cy + cy +
cy + + S
在B1代选翘翅雌蝇和翘翅雄蝇互交。
cy + cy + .
×
F3 ♂ ♀
♀ ♂ cy + × ♀
♂ ♀
cy + cy + cy +
cy +
cy +
（1）如果F3只有翘翅类型证明只有cy + 杂合体，那么被检测雄蝇染色体上发生了隐性致死突变
（2）如果F3有2/3翘翅类型，有1/3野生型说明没有发生致死突变，也没有隐性突变
（3）如果有2/3的翘翅类型，1/3突变类型，说明发生了隐性突变。
3 微生物基因突变的检出----营养突变的筛选
营养缺陷型只能在基本培养基上生长，不能在某一缺营养培养基上生长。在完全培养基上能生长，在基本培养基上不能生长，证明发生了突变。
4 、人类基因突变的检出
离子法、芯片法、PCR 技术（见基因组学部分）
第三节诱变因素及作用机理
诱发突变：是有机体暴露在诱变剂中引起的遗传物质改变
诱变剂：能诱发生物体变异的理化条件称诱变剂
一、物理诱变因素及作用机理
1927年Muller用X射线处理果蝇精子，证明X射线可以诱发突变这一结论为辐射遗传学奠定了基础。因此Muller在1941年获得了诺贝尔奖。差不多同一时期Ctadler用X射线、γ射线处理大麦和玉米种子，也得到了相似的结果。随着研究的深入，人们已经知道α、β中子及紫外线等均有不同程度的辐射作用。用这些诱变剂进行辐射研究又解决了以下几个方面的问题
①可提供诱发突变的有效方法
②研究诱变的过程及诱变的机理
③证明辐射不仅对人体有害，而且更重要的是影响后代
电离辐射ionization radiotion
非电离辐射unionizating
1、电离辐射
（1）辐射源粒子射线：γ、β射线、中子
电磁辐射：γ射线、X 射线
X射线：带正电的粒子束2-9百万电子伏特（MeV）高能电子，质量大，穿透力弱，在生物细胞中仅穿透十分之几mm，但因能量大，具有较大的电离作用，如氢原子核。
β射线：带负电的β粒子构成的电子流，能量也较大，几百万电子伏特，有较大的穿透能力。
中子：不带电的质点，按所带的能量可分为快中子、慢中子。中子是在反应堆回旋加速中产生的。如镭中子源可产生中子流
电磁辐射：不带电核的γ射线、X射线是一种电磁，具有很大能量和光一样的速度。
（2）电离作用：电离作用是从中性原子或分子形成离子的过程称为电离作用。
影响电离作用大小的因素：
①辐射剂量（伦琴表示）
定义：1γ的照射可使1cm3的标准状态的干燥空气产生一个静电单位的电离量。辐射剂量越大，电离作用越大
②射程：从粒子进入物质到能量被吸收最后停止，这段距离称粒子在该物质内的射程。射程越大，分子和原子的电离作用越大
③辐射强度：单位时间内照射剂量。大剂量短时间照射比比相同剂量多次长时间照射容易引起突变。：
粒子照射到物质之后，它的分子或原子的核外电子丢失，丢失的电子的原子或分子成为常正电的阳离子，而被激出的电子被其他的中性原子所捕获，形成带负电的阴离子。
（3）、电离作用对生物体遗传物质的影响
电离辐射诱发生物变异的全过程分四个阶段
物理学阶段：指能量从辐射源传递到生物细胞内，使细胞内的各种分子发生电离和激发。电离作用
物理化学阶段：是储存能量的迁移和生物大分子损伤形成的辐射化学过程。在这一过程中形成许多特别活跃的自由基和自由原子，其中水是最多的，所以水分子中产生的离子对一系列复杂的反应起重要的作用。水射解水的电离过程又称水的射解H2o H2o+＋e+
电离
H2O＋e H2O -(水负离子)
水中正负电子对形成了水的射解
H2O +H＋＋O H0
氢O H自由基
H2 O -H0＋O H-水自由基与离子团结合
OH0＋H0H2 O
OH-＋H+H2 O
OH o＋OH+H2 O2
水的射解之后，形成的许多自由基对大分子产生影响，尤其产生氧化物。
生物学阶段
a辐射作用于细胞分裂间期，核物质，染色质有的部位空泡化或出现成团现象。
b辐射作用于细胞分裂中期染色体粘合松弛断裂
辐射作用于细胞分裂后期可见染色体桥梁片段缺失倒为易位重复等结构变异
c辐射引起染色体数目的改变形成多倍体或单倍体个体发生的表观型发生改变或突变个体不育或死亡体的细胞活力下降生长势小。
d辐射对DNA结构的影响，碱基发生替代，碱基之间的化学键发生变化，糖和磷酸之间的键发生变化，使染色体和DNA结构发生变化。
e对细胞质的影响，使细胞膜透性增加，细胞质外渗，或粘滞度加大，影响物质运输，代谢紊乱。
2、非电离辐射：辐射过程中不引起电离，但可以突变
（1）辐射源：紫外线电磁波，带电量低近3-5eV，穿透力弱，不足以引起电子发生电离.
照射时有效的波长为270nm，植物和微生物诱变作用（ultraviole,UV）。30%的紫外线又穿过珠花粉壁，8%可穿透膜。
（2）诱变机理：直接作用→分子活化→化学键变化
间接作用→甲物质被活化→能量→乙物质→化学变化
①胞腺嘧啶二聚体，阻止DNA正常识别和转录、翻译或错误复制。
②胞嘧啶与水分子发生水合作用
③化学键发生断裂，主要是配对的碱基化学键断裂；糖和磷酸之间的键断裂。
二、化学诱变
1、化学诱变剂的种类
（1）烷化剂：有一个或几个不稳定的甲基、已基烷基团能与核酸中的碱基发生化学反应，引起碱基配对的转换。
（2）碱基类似物：分子结构与DNA上的碱基相似，当DNA复制时，可作为碱基插入引起突变。
（3）嘧啶类染料：使分子DNA上减少或增加一、二个碱基，引起碱基的移码突变，发生转录和翻译错误诱变。
2、作用的机理
DNA模型确定后，基因突变是由于和甘酸顺序发生变化，可以发生两种形式的改变，碱基突变（base substitution ）和移码突变(frameshift mutation ).显然引起这两种改变的因素很多，但研究较为清楚的是化学诱变。
（1）、碱基类似物（base analogues）
某些化合物结构上与碱基类似，有时会代替正常的碱基，插入DNA分子后，配对不同于正常碱基，DNA序列中该位置插入不正确的碱基。
碱基替换——转换transitions
颠换trans versions
引起转换的诱变剂为：5——溴尿嘧啶、亚硝酸、烷化剂
2——氨基嘌呤、5——氟尿嘧啶、5——氯尿嘧啶
2——氨基嘧啶2AP
引起颠换的诱变剂为：甲基磺酸已酯亚硝酸甲基脲等
例：5——溴尿嘧啶、5——BU与胸腺嘧啶有类似的结构
Ecd ：在含有5——BU 的培养基上培养后，DNA中的胸腺嘧啶被5——BU取代，5——BU域多，突变细菌域多，以后在不含有5——BU的培养基上仍保持突变性状，如何解释这一现象：
5——BU 稀醇式与G配对
5——BU 酮式与A配对
（2）亚硝酸（HNO2）——脱氨作用
（3）烷化剂——特异性错配和脱氨作用
芥子气——对噬菌体细菌链孢霉、蚕和果蝇都有诱变作用
亚硝基胍（CN），甲磺酸已脂，硫酸二已脂
机理：①给鸟嘌呤添加已基或甲基。使其像A与T配对
②鸟嘌呤烷化后，还易造成烷化的嘌呤被脱掉，造成脱嘌呤作用留下一个缺口，影响DNA的复制或核苷酸序列缩短造成移码突变。
③同一DNA分子或两个DNA分子之间产生交联，使一个或几个核苷酸丢失或切除
（4）嵌合剂的致突变作用
诱变剂：丫啶橙、原黄素、黄素等染料均含有丫啶环结构与碱基差不多能嵌入DNA 分子，引起插入缺失，造成移码突变（frame shift mutations）丫啶染料嵌如DNA分子偶，使DNA分子歪斜，在遗传重组排列不齐，不是完全的同源部分对齐再发生交换，而是发生错误，造成不等价交换，最终使一条链长，一条短。
三、碱基突变对遗传信息的影响
1 mRNA 上的碱基替代
①同义关系（same senses mu.）——不引起氨基酸种类变化的碱基替代称为同义关
系
GAU GAC 天冬氨酸
②错义关系（miss sense mu.）——能转移出另一种氨基酸的碱基替代城
四、DNA损伤的修复
在自然界中，有自发突变和诱发引起的DNA损伤，但是在长期进化过程中，生物体本身还可以形成各种酶促系统来修复或纠正偶然发生的DNA复制错误或DNA损伤，修复系统又可以是DNA的一种安全保障系统。有时按原样修复不引起突变，有时不按原样修复引起突变，所以说突变是损伤和修复相互作用的结果。
一、紫线外射对DNA损伤的修复。
紫外线可以引起细菌死亡并与照射剂量成正比，但经可见光照射，细菌又部分能活过来，这是光能修复辐射损伤的实验。
1.光复活：紫外线照射引起的DNA损伤，在可见光或黑暗条件下得到恢复的现象。
光复活过程中，主要是光复活酶PR酶催化二聚体分解成胸腺嘧啶的过程。
2.切除修复(excision repair)：也称作核苷酸外切修复，是一种取代紫外线等辐射物质
所造成的损伤部位的暗修复系统。因为所需的酶都不需要可见光。所以这种修复也叫暗修复。
第一步：一种特定的识别而聚提位置的酶在二聚体附近将一条链切断造成缺口。
第二步：DNA多聚酶的未受伤的DNA链为模板，合成新的片段，弥补DNA缺口。
DNA合成的方向是5’3’
第三步：专一性的核酸外切酶切除含有二聚体的一段核苷酸链。
第四步：连接酶把缺口封闭，DNA回复
例如：人的色素性干皮症，对阳光特别敏感，皮肤发病率大大提高，说明缺乏修复能力。着色性干皮症：是一种光敏感遗传病，由常染色体隐性基因决定，基因定位在1q，但13号、19号染色体有控制修复G，隐性纯合体对阳光极度敏感皮肤暴露。患者在阳光中极易发生色素沉着、萎缩、角化过度和癌变。患者在阳光中极易患皮肤癌，基底细胞瘤，鳞状上皮细胞瘤最为常见，伴有神经系统疾病，这两种病在50%病中见到、
20岁之前90%的人类皮肤癌。
3.重组修复：DNA损伤通过DNA分子间的重组进行的修复称重组修复。
第一步：DNA复制越过嘧啶二聚体，在二聚体的部位留下缺口。
第二步：核酸内切酶与完整的DNA链上形成一个切口，使有切口的DNA链与二聚体的越过位置的链互换。
第三步：二聚体对面的缺口由新合成的片段补充。
第四步：连接酶使新片段与旧片段连接，重组修复完成。
人的色素性干皮症是典型的切除二聚体能力缺损带来的疾病，现已查明，切除修复系统中的8个基因中任何一个基因缺陷就会造成内切核酸酶功能失活，少数病人因复制后修复缺陷造成细胞死亡，染色体断裂、突变及癌变等一系列效应。
但重复修复并没有切除TT二聚体，第二次复制时，留在母链中的二聚体仍通过上述过程完成。
4.SOS修复：是DNA分子受较大范围损伤而修复受抑制的一种修复系统。可越过
TT嘧啶进行复制但保真度低，是一种错误的修复过程，可能是紫外线造成突变的一种错误修复。
.国防上通用的紧急呼救，表示细胞多大范围损伤到了危急状态的一种修复。
概念：DNA分子受损伤的范围较大而且复制范围较大而且复制受到抑制时出现的一种修复作用。是细胞处于危急状态时的一种修复方式。
一般认为:SOS修复是在DNA分子受到大范围损伤情况下防止细胞死亡而诱导出的一种应急措施，是使细胞通过一定变异换取最后生存呼吸。
如紫外线形成二聚体。
原有的DNA多聚酶催化的DNA复制进到损伤部位时，复制受到抑制，但新的DNA聚合酶能催化损伤部位的DNA合成。
二.电离辐射引起的DNA损伤和主要修复
电离辐射研究远没有紫外线研究的清楚。修复机制也不是很清晰。但研究逐步深入。
三种修复方法，需要三种修复酶系。
1.超快修复：单链打断的板块修复过程。由DNA连接酶的单独作用在无氧条件下进
行。E.cloi 0℃工分即可完成
2.快修复：经X射线照射后，室温放几分钟，能把超快修复剩下的断裂单链的90%
修复。多种参与修复
3.暗修复：照射后37℃下培养40—60min能把快修复剩下的段裂单链全部修复。需
重组修复酶引位参与。
第三节突变的鉴定和检出(2h)
一、果蝇常染色体基因突变的检出
（一）平衡致死系
（二）果蝇常染色体隐性突变的检出
二、植物突变体的选择
三．生化突变的鉴定
四．一基因一酶学说
五、突变与植物育种
六、小结：
七、课外作业：
●思考题：
●1、果蝇性染色体和常染色体基因突变的检测方法●2、电离辐射和非电离辐射作用机理和遗传效应●3、化学诱变剂的诱变机理
●4、非电离辐射引起损伤的修复途径
八、教学体会：
通过案例的讲解展开课堂教学
基因突变的检测方法
基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。
(3)理解基因突变的检测方法
第十章基因突变 一、教学目的与要求： （1）了解基因突变的类型和性质、特征 （2）掌握基因突变分子机理和诱变因素的作用方式 （3）理解基因突变的检测方法 (4) 掌握基因突变的修复途径 二、教学重点、难点、疑点： 1.突变的概念、类型和性质 2.诱发突变的分子基础 3.诱发突变与人类癌症 4.生物体基因突变的修复机制 5.果蝇基因突变的检出 6.植物基因突变的检出 7.人类基因突变的检出 [解决方法] （1）通过出示基因结构变化的示意图，加深学生对基因突变内涵的理解。 （2）课堂教学中不断提出问题，让学生通过概念的运用达到巩固概念和知识迁移的目的。 2．教学难点及解决办法 基因突变的原因。 [解决办法] 对人类镰刀型细胞贫血症病因结合图解进行分析，使学生真正明白基因突变的原因——DNA复制过程也可能发生差错，基因中个别碱基的变化，就会造成性状改变。 3．教学疑点及解决办法 为什么说基因突变是变异的主要来源？ [解决办法]讲明基因突变与基因重组的区别，联系实际举例。 三、教学方法设计： 四、教具或教学手段：多媒体课件 五、教学过程与板书设计：
第一节基因突变的概念和特征 一、基因突变的概念及类别 1、基因突变：指在染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变基因突变：指染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变 2、类别 隐性突变：A a 显性突变：a A 自发突变—外界环境条件的自然作用或生物体内的生理生化变化而产生的突变 诱发突变—在专门诱变因素影响引起的突变，为“诱发突变” 形态突变型—可见突变：指造成外形改变的突变型 至死突变型—能造成个体死亡或生命力明显下降的突变型 条件突变型—在一定条件下有致死效应 3.一般特征 ①突变的频率：指生物体在每一世代中发生突变的机率，或者在一定时 间内突变可能发生的次数。 高等植物 10-5— 10-8 细菌和噬菌体 10-4—10-10范围大、突变频率比动植物高 例如：氨基酸过程中三种疾病是由三种基因突变导致酶发生变化引起的，有一定的突变频率 苯丙氨酸羟化酶缺乏导致苯丙酮尿症；尿黑尿酸氧化酶缺乏会产生尿黑酸尿症；酪氨酸酶缺乏导致白化病 苯丙氨酸羟化酶 苯丙酮酸苯丙氨酸酪氨酸 积累尿黑尿酸氧化酶 酪氨酸酶 苯丙酮尿症尿黑酸黑色素
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基因文库中目的基因的筛选
基因文库中目的基因的筛选 克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可以使用以下的方法克隆目的基因： 1. PCR或RT-PCR法 2. 从基因文库中分离基因 3. 从cDNA文库中分离基因 4. 转座子标签法 5. 图位克隆法 6. 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法 7. 人工合成法 本章中主要介绍从基因文库中筛选目的基因的几种方法。 获的目的克隆的方法有两种 1）目的基因的直接选择 2）从基因文库中筛选 称为鸟枪射击法，建立一个包含所有基因或大部分基因的克隆，从中筛选目的克隆。 一、直接选择 直接选择的基因比较少，如抗生素抗性基因。如克隆一个kan抗性基因，在R6-5质粒上含有四种抗性基因：kan, 氯霉素、链霉素、硫胺类药物，kan抗性基因存在于13个EcoRI片段中的一段中。将R6-5的片段插入pBR322的EcoRI位点中，连接混合物中将含有13个不同片段的大量重组拷贝，其中部分是kan抗性的。只有含kan的克隆才能在含有kan的培养基上正常生长。 1.1 标记援救可以扩大直接选择的范围 利用E. coli的突变系可扩展该项技术。例如要从E. coli中克隆trpA基因，编码色氨酸合成
酶，一个突变系不能合成色氨酸，只有加入色氨酸后才能存活。因此E. coli的突变体可以用来克隆trpA基因。首先从一个正常个体中提取总DNA，然后酶切，连接产生大量重组DNA分子，其中一个将携带完整的trpA基因。连接混合物用来转化缺陷型E. coli细胞，大部分转化子是缺陷型的，携带trpA的重组子将是野生型的，可以在基本培养基上生长。 1.2 标记援救的范围和限制 存在两个限制因素： 1）必须存在着目的基因的突变品系 2）需要一种只有野生型能够生长的培养基。 一般而言，标记援救适用于微生物的合成酶，可以在基本培养上选择。
基因突变检测多少钱检测方法是什么
基因突变检测多少钱检测方法是什么 一代测序法（Sanger法）： 科学家Sanger，于1977年建立，他本人也因此而获得了诺贝尔奖。该技术至今已用 三十多年，现在已相当成熟完善。人类基因组计划的测序工作就是使用该项技术完成的， 现在***的仪器是美国ABI公司的***3730型全自动遗传分析仪，是经过国际和国家认证的仪器，可重复性达到100%，是亲子鉴定和法医鉴定的专用仪器。该方法是目前基因检测的国际金标准。缺点是通量小，适合少量样本，可进行个性化位点检测，成本极高，比芯片 或高通量检测高100倍。 Taqman法： 准确性好，适合于大量样本、少量位点，价格贵，缺点是不能读出序列，不太直观。 质谱法： 准确性较好，缺点只能读出质量数据，不能读出序列，对于缺失和插入突变无法读出，但这种突变更加可怕，适合于大量样本、多位点（最多能检测25个位点），所以可能会 出现少量假阳性和假阴性。 二代基因检测芯片法： 适合于超多位点，大量样品检测和科研参考，每个样本做几百个位点和做几千个位点 的检测成本，相差无几，最大优点是成本低廉，一个位点的价格只相当于一代测序价格的1%，缺点是出来的大量数据，可信度不高。 我们都知道“是药三分毒”，癌症患者的过度治疗会造成患者的器脏损伤，甚至化疗 整个过程费钱费力却“不讨好”，所以进行在进行治疗之前先进行基因测序检测，会让靶 向药物治疗事倍功半。 肺癌的靶向药基因检测，现在很多公司都可以做，医院基本上也是外送公司做，看你 检测几个几个基因，一般不会超过7200，一般检测就是EGFR,融合基因ALK,ROS1，C-MET，中源协和基因检测。 一般的，基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术。 基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检 测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、 遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。目前有1000多种遗传性疾病可以通过基因检 测技术做出诊断。
基因突变习题
1 、基因突变常发生在细胞周期的 A ：分裂间期 B ：分裂期前期 C ：分裂期后期 D ：在分裂期的各个时期都有可能 请选择答案： A:B:C:D: 2 、下列基因突变叙述中正确的是[ ] ①基因突变包括自然突变和诱发突变 ②在DNA复制中，碱基排列顺序发生差异，从而改变了遗传信息，产生基因突变 ③基因突变一般对生物是有害的，但是，也有的基因突变是有利的 ④基因自由组合使生物产生新基因 A ：A．①②③④ B ：B．①②③ C ：C．①②④ D ：D．②③④ 请选择答案： A:B:C:D: 3 、在下列几种育种方法中，可以改变原有基因分子结构的育种方法是 A ：杂交育种 B ：诱变育种 C ：单倍体育种 D ：多倍体育种 请选择答案： A:B:C:D: 4 、通过人工诱变培育的新类型是 A ：无籽番茄 B ：矮秆抗锈病小麦 C ：无籽西瓜 D ：青霉素高产菌株 请选择答案： A:B:C:D: 5 、下列叙述中，不属于诱变育种优点的是 A ：可以提高变异的频率 B ：育种年限显著缩短 C ：大幅度改良某些性状 D ：需大量处理供试材料 请选择答案： A:B:C:D:
6 、下列人类疾病中不是由基因突变引起的是 A ：白化病 B ：血友病 C ：侏儒症 D ：镰刀型盆血症 请选择答案： A:B:C:D: 7 、下列各项中可能产生新基因的是 A ：用离体花药培养玉米植株 B ：用秋水仙素得到三倍体西瓜 C ：通过杂交培养抗病小麦品种 D ：用X射线处理青霉素菌种 请选择答案： A:B:C:D: 8 、若一对夫妇所生育子女中，性状差异甚多，这种变异主要来自 A ：基因突变 B ：基因重组 C ：环境影响 D ：染色体变异 请选择答案： A:B:C:D: 9 、杂交育种依据的主要遗传学原理是 A ：染色体变异 B ：基因连锁互换 C ：基因自由组合 D ：基因突变 请选择答案： A:B:C:D: 10 、进行无性生殖的生物，可遗传的变异来源是 A ：基因重组和基因突变 B ：基因重组、基因突变、染色体变异 C ：基因突变、染色体变异 D ：基因重组、染色体变异 请选择答案： A:B:C:D: 11 、在育种实验中，将纸袋套在花上的目的是 A ：保持开花的温度和水分 B ：防止花粉成熟后散失 C ：防止自花传粉 D ：防止外来花粉的干扰 请选择答案： A:B:C:D: 12 、
P53基因突变检测方法
2、试剂和耗材） GIAGEN,德国QIAamp?DNA Blood Mini Kit （）Platiinim?Taq DNA Polymerase High Fidelity （Invitrogen, 11304-102 Nuclease-Free Water （Promega,P 1195） d NTP Mix （Promega,P 151B） PCR引物：北京博迈德科技有限公司合成 DL10000 DNA Marker（TAKARA,大连宝生物）DNA分子定量标准：技术Bioer 产物回收纯化试剂盒（BioSpiii Gel Extraction kit,日本PCR有限公司）公司） Axygen, 200-1000 ul 吸头（美国110.5?10 u、2?20 u k 20-200 □、管EP、 仪.器3 ；Taimon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司）Eppendorf 5417R 高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）公司，美国）Allegra 6R离心机（Beckman-Coulter应涡旋混合器（北京北德科学仪器厂）MVS-1公司，德国） 1000 u 150 口1、200 ul、（Eppendorf^ 口1 移液器、10 U 1、NEWAIR 公司，美国）1【级生物安全柜NU425-400E （拓速冷冻离心机（BECKMAN COULTER 公司，美国）X-15R 公司德国）仪（Eppendorf Eppendorf Masteicycter PCR 公司，美国）（Bio-Rad电泳仪：Universal 024BR电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司）240全自动凝胶成像系统（中国）凝胶成像分析系统：Tocan 测序仪：GenomeLab CEQ/GeXP （BECKMAN COULTER 公司，美国）20 u k 200 ul和1000 ul加样器（吉尔森公司，法国）旋涡震荡器（Scientific Industries公司，美国） 二、实验方法 1、样品采集，送检和保存 乙二胺四乙酸（EDTA） -3K抗凝管采集HIV和HEV合并感染者外周静脉血，于24h内测定CD4+T淋巴细胞计?数，抗凝血经常规离心分离全血中间层，分装后-80°C冻存用于P53基因变异的测定。 2、血浆样本DNA的提取 取200 P1全血中间层于1.5ml无菌EP管中，加入20 口1蛋白酶K；再加入200 ul AL缓冲液，涡旋振荡15秒，56°C孵育10分钟；瞬时离心EP管，加入200 u 1 无
肿瘤基因突变检测
肿瘤基因突变检测 癌症是一类难以预防的疾病，中晚期癌症治愈的可能性又很小，而早期癌症的治愈率可达65%以上，有些肿瘤可达90%以上，因此，战胜癌症的关键是早期发现癌症。由于癌症早期常无特殊症状，甚至毫无症状，故癌症的早期发现、早期诊断主要是通过定期健康体检和人群筛查完成。目前筛查癌症的方法主要是通过化验血肿瘤指标及B超、CT、MRI、PET-CT 等检查，但这些方法的敏感性和特异性均不高，发现有异常时往往已是中晚期。 17种常见高发肿瘤，包括乳腺癌（breast cancer）、结肠癌（colorectalcancer）、子宫癌（endometrial cancer）、脑胶质瘤（glioma）、白血病（leukemia）、肺癌（lungcancer）、淋巴癌（lymphoma）、成神经管细胞瘤（medulloblastoma）、黑色素癌(melanoma)、间皮瘤(mesothelioma) 、多性骨髓瘤(multiple myeloma) 、卵巢癌(ovarian cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer) 、真性红细胞增多(polycythemia vera) 、前列腺癌(prostatecancer) 、肾细胞癌(renal cell cancer)和恶性内瘤(sarcoma)，其发病机制涉及与多种肿瘤发生共同相关的肿瘤易感基因群介导的分子改变，参与了肿瘤发生的早期分子事件。系统寻找和探讨它们在肿瘤发生发展过程中的遗传学变异，对阐明肿瘤早期发生机制及寻找肿瘤早期预警、早期诊断和早期治疗的分子靶标都具有重要的现实意义。利用高通量分子测序技术平台，可同时开展多个肿瘤基因突变检测项目，如EGFR、K-RAS 、N-RAS、B-RAF、PI3K 、p53、p16、BRCA1、
基因突变的检测方法
基因突变的检测方法
基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。 突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程
基因突变的检测方法
基因突变的检测方法 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。 突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适
preMiD基因突变检测技术原理和应用
preMiD?基因突变检测技术原理和临床应用简介： 原癌基因和抑癌基因的驱动突变（driver mutation）是肿瘤特有的标记。以PreGen-Plus?筛查大肠癌4基因突变的粪便筛查被FDA批准为标志，更多突变检测肿瘤的新技术和产品处于临床开发阶段。自主创新的preMid?技术可一次检测38个基因198突变点，覆盖包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌和胃癌等14种肿瘤，国际上第一次实现多突变的血浆检测。临床验证preMid?技术可实现癌症（超）早期，疑似患者的辅助诊断和术后复发的实时监控，总体准确率可达80%。 正文： 原理： 1. 突变——肿瘤特异标志。 癌症是基因突变累积的结果。“所有癌症的发生，都源自脱氧核糖核酸（DNA）序列的异常。”国际癌症基因组联合计划参与单位之一、英国剑桥大学桑格研究所首席科学家斯特拉顿教授指出。 癌变的形成要经过8--10年甚至更长，而这漫长的时间其实就是一个多基因突变并累积的过程（图1）。肿瘤相关基因可分为原癌基因和抑癌基因，其中起主要作用的突变属于驱动型突变（driver mutation）。当抑癌基因突变失去抑制癌症作用，或原癌基因突变激活，就会诱发癌症。正常细胞在向癌细胞转化的过程中，发生多种不同原癌基因和抑癌基因突变。 图1 肿瘤是基因突变的结果 相比临床检测中常规使用的肿瘤蛋白血清标志物，突变无疑是更特异的肿瘤标记。 2009年12月，桑格研究所在《自然》杂志上刊文宣布，他们率先在世界上破译肺癌、
皮肤癌和乳腺癌等5种肿瘤全部基因密码，绘制出相应的肿瘤基因突变图谱（表1）。 表1 5种癌症基因突变相关数据 Nature.2010.8;466(7308):869-873. 2.循环DNA是检测突变的重要来源 肿瘤起源DNA存在于血液循环DNA中。循环DNA存在于血清或血浆、滑膜液和脑脊液等体液中的非细胞里面存在的片段，亦称细胞游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)。 早在1947年Mandel和Metais就发现循环核酸；30年后Leon等研究表明肿瘤患者外肿瘤患者cfDNA水平大大高于正常人1989年Stroun等发现血液游离DNA具有肿瘤细胞DNA的一些特征；5年后研究者在肿瘤患者的血浆和血清中检测到癌基因突变，与原发肿瘤一致。 图2 肿瘤cfDNA来源示意图 肿瘤细胞cfDNA如何进入血液，目前认为：1) 循环肿瘤细胞或微转移灶的裂解；2) 肿瘤细胞的凋亡；3) 肿瘤细胞坏死；4) 肿瘤细胞自发性释放。 cfDNA突变检测具有特异、实时且无创等突出特点，无疑是肿瘤早期筛查、辅助诊断、预后判断及跟踪复发等有效靶标。
基因变异的研究方法与进展
基因变异广义上说就是指基因结构变化从而产生了可遗传的变异。也就是说DNA水平上的突变造成的基因改变。而这一突变过程可能有很多原因，有自发性的，比如DNA配对过程中的装配错误，也有外源性的诱导因素，如物理，化学，生物因素等造成染色体结构改变或者基因结构的直接变化。 突变的形式多种多样，常见的有：点突变，即一个或多个核苷酸发生了改变；框内突变指的是3个或是的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加1个或几个氨基酸；除此之外，还存在着DNA大片段的缺失，通常是指几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。 这其中，最常见的莫过于点突变，他是指一个或者几个核苷酸的缺失或改变，通常会形成三种类型，第一种是同义突变，即碱基替换后，虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码的兼并性），亦称静止突变，第二种是错义突变，指的是碱基替换，密码子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基酸，第三种是无义突变，即碱基替换后，使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。 基于上述的变化，常见的基因变异研究方法有如下几种 一、筛选性方法 有人将这类方法分为2类，根据电泳性质不同及其他包括化学修饰法等 1 RNase 法 该法是一种最早提出的检测DNA突变的方法口。其原理是RNase可以识别RNA：DNA或RNA：RNA杂交链中错误配对的碱基并将其切断。经聚丙烯酰胺凝胶电泳将正常链及被切断的含有突变点的链区分开来。杂交方法是将同位素或其它方法标记的正常野生型RNA 片段与相对应的待测DNA 片段混合，90"C
左右变性并在室温下复性形成杂交分子。当待测DNA 片段中存在碱基突变时，在该位点上二条链不能正常配对，便成为RNase的识别和切割位点 2 DGGE、CDGE、TGGE、TSGE法 梯度变性凝胶电泳（DGGE）原理是当双链DNA在梯度变性的聚丙烯酰胺凝胶中行进到与DNA变性温度(熔点温度)一致的凝胶变性浓度位臵时，DNA 发生解旋变性此时电泳速度迅速降低。而当解旋的DNA链中有一个碱基突变时，将会影响其电泳速度变化的程度，从而将正常与突变的DNA区别开。 CDGE(constant denatural gel electrophoresis)法通过预实验或理论计算预先精确确定待测DNA片段的熔点温度后采用单一变性浓度凝胶电泳，简化了DGGE 法的操作 类似于CDGE法，TSGE (temperature sweep gel electropnoresis)法则取消了温度梯度而代之以单一温度 这类方法的优点是：(1)检出率高，～100 (2)可用于分析突变——正常DNA 混合样品；(3)可以回收分离出的DNA 片段；(4)可以直接测定未经扩增的DNA 。这类方法的缺点也很多，如(1)分析片段较小，<500 bp；(2)需要制备昂贵的GC clamp(3)需要事先经过复杂的计算机处理计算熔点温度或预试验确定变性条件； (4)位于高度富含GC的片段中的突变可能漏检。鉴于以上不利因素，DGGE等一类方法有逐渐被SSCP(单链构象多态性)法取代的倾向。尽管如此，这类方法一经建立，应用十分方便，适于大规模样品分析 3 SSCP法 单链构象多态性(single strand conlotraation polymorphism，)是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA或RNA分子依其碱基序列不同而形成不同构象，
P53基因突变检测方法
2、试剂和耗材 QIAamp?DNA Blood Mini Kit（GIAGEN，德国) Platinum?Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen,11304-102） Nuclease-Free Water(Promega,P1195) d NTP Mix(Promega,P151B) PCR引物：北京博迈德科技有限公司合成 DNA分子定量标准：DL10000 DNA Marker(TAKARA,大连宝生物) PCR产物回收纯化试剂盒（BioSpin GelExtraction kit，日本Bioer技术有限公司） 0.5~10 μl、2~20 μl、20~200 μl、200~1000 μl吸头（美国Axygen，公司） EP管 3、仪器 Tannon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司）； Eppendorf 5417R高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国） Allegra 6R离心机（Beckman-Coulter公司，美国） MVS-1型涡旋混合器（北京北德科学仪器厂） 移液器2 μl、10 μl、50 μl、200 μl、1000μl（Eppendorf公司，德国）Ⅱ级生物安全柜NU425-400E（NEWAIR公司，美国） X-15R高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER公司，美国） Eppendorf Mastercycter PCR仪（Eppendorf 公司德国） 电泳仪：Universal 024BR（Bio-Rad公司，美国） 电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司） 凝胶成像分析系统：Tocan240全自动凝胶成像系统（中国） 测序仪：GenomeLab CEQ/GeXP（BECKMAN COULTER公司，美国）20μl、200μl和1000μl加样器（吉尔森公司，法国） 旋涡震荡器（Scientific Industries公司，美国） 二、实验方法 1、样品采集，送检和保存
1_肿瘤相关突变基因检测试剂(高通量测序法)性能评价通用注册技术审查指导原则
附件1 肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是针对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 本指导原则所述肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价主要是指基于高通量测序（high-throughput sequencing）即下一代测 —1 —
序（next generation sequencing，NGS），又称为大规模平行测序（massively parallel sequencing，MPS），体外检测人体组织肿瘤细胞中的肿瘤相关基因变异。用于检测体细胞突变的NGS正在广泛用于肿瘤诊疗相关的分子检测，包括对特定基因的DNA/RNA进行测序，以寻找与肿瘤临床诊疗相关的基因变异。肿瘤基因突变类型包括点突变、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常等广义的基因突变。 基于NGS测序原理的体外诊断（In Vitro Diagnosis，IVD）检测可能包括以下步骤：样本收集、处理和保存、核酸提取及处理、文库制备、测序和碱基识别、序列比对、变异识别和过滤、变异注释和解读以及检测报告的生成。同时，某些产品还可能会包括软件部分，但上述相关步骤并不一定被全部包括，应根据产品的具体设计流程来进行判断。对于每个检测步骤，申请人需要结合产品设计和临床意义来建立特定的可接受的质量评价指标和合格判断标准。此外，为满足产品特定预期用途，申请人需通过科学和适当的检测性能研究来确定适用的试剂、消耗品、仪器和软件。基于上述考虑因素，NGS检测产品的设计和工作流程中的任何差异均可能导致结果的不同，因此申请人需要清楚地描述相关检测性能指标。 分析性能评价的初衷在于提出产品性能有效性、安全性相关问题的假设，然后通过研究进行确认。NGS在测序通量及发现未知基因变异方面具有优势，但是在NGS技术应用需求及使用中存在包括相关临床样本收集处理、NGS检测内容、测序流程、—2 —
PCR技术用于基因突变的检测
PCR技术用于基因突变的检测 PCR 技术用于基因突变的检测 基因结构的异常可引起多种疾病的发生,它包括点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩增、基因结构多态性异常等形式。许多人类遗传性疾病源于基因的突变,基因突变分析是指对单个或低拷贝基因序列等位基因改变的鉴别,对诊断和理解遗传病有非常重要的价值。 聚合酶链反应 (PCR)是一种高特异和高灵敏性的基因分析手段, PCR 操作简便, 可以在几个小时内使 DNA 段的拷贝数扩增百万倍, 使对微量 DNA 的分析鉴定成为可能,伴随着分子生物学各领域的飞速发展, PCR 及其衍生技术以其快速准确在基因突变的检测中得到了广泛的应用。 虽然特异基因序列区段的直接测序是基因突变分析最可信和最精确的手段 , 但该方法繁琐、耗时、费力。 PCR 的应用则提供了一系列比直接测序更方便、快捷的方法。 PCR 在此领域也引起了巨大的革新。 基于 PCR 技术的常用基因突变检测方法有: 1、 PCR/ASO(allele specific oligonucleotide,ASO,等位基因特异性寡核苷酸 ) PCR/ASO探针诊断点突变,系在扩增 DNA 段后,直接与相应的寡核苷酸探针杂交,来明确诊断是否有突变以及突变是纯合子还是杂合子。 2、 PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism, SSCP) PCR-SSCP 系 1989年由 Orita 首先报道的,它是一种基于单链 DNA 构象差别来检测点突变的方法。该方法操作简单、灵敏且特异性高,是目前检测点突变最简捷的方法。 3、 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism , RFLP , 限制性片段长度多态性分析 )RFLP 分析与 PCR 反应相结合, 先用 PCR 来扩增待检的片段,再进行 RFLP 来检测那些发生在酶切位点的突变简化了 RFLP 的分析过程,并使该项技术得到了广泛的应用。 4、 DNA 序列测定法 (direct sequencing, DS)