微生物基因组DNA提取方法的比较与改进
收稿日期:2006-09-041
作者简介:刘晓侠(1978- ),女,江苏丰县人,嘉兴学院生物与化学工程学院教师,博士,研究方向为基因工程、发酵工程。
微生物基因组DNA 提取方法的比较与改进
刘晓侠1
,林建平2
,岑沛霖
2
(11嘉兴学院生物与化学工程学院,浙江嘉兴314001;21浙江大学生物工程研究所,浙江杭州310027)
摘 要:高质量的微生物基因组DNA 是基因工程的前提。目前国内外关于微生物基因组DNA 提取的方法很多,根据研究对象和目的不同而方法各异。该文就现有方法中应用最为广泛的三种提取微生物基因组
DNA 的方法进行了比较,并对它们进行一些改进,获得了针对不同细胞壁成分的微生物相应的简便、快速
且高质量基因组DNA 提取方法,并对提取的DNA 进行PCR 特异性扩增检测,获得较清晰的谱带[1],为基因克隆表达研究奠定了基础。
关键词:微生物;DNA 提取;PCR 中图分类号:Q933
Co m par ison and I m prove m en t of Extracti on M ethods for Geno m i c D NA
L I U Xiao -xia 1
,L I N J ian -p ing 2
,CE N Pei -lin
2
(11School of B i ol ogy and Che m ical Engineering,J iaxing university,J iaxing,Zhejiang 3140001;
21I nstitute of B i oengineering,Zhejiang University,Hangzhou,Zhejiang 310027)
Abstract:H igh quality genom ic DNA fr om m icr oorganis m is the p reconditi on of genetic mani pulati on .Now many methods f or the extracti on of genom ic DNA are devel oped according t o different research object and intenti on .Three kinds of methods widely app lied are compared and ref or med in is olati on of genom ic DNA fr om m icr oorganis m.And ef 2fective methods for extracting high pure genom ic DNA are established considering different cell wall components .Ge 2nom ic DNA gained by three different methods above is s pecifically a mp lified and clear band is observed by agar ose gel electr ophoresis,which is convenient t o genetic mani pulati on later .
Key words:m icr oorganis m;DNA extracti on;PCR (Poly merase Chain Reacti on )
文献标识码:A 1 文章编号:1008-6781(2007)03-0048-03
1 材料与方法111 试验材料
黄色短杆菌(B revibacteriu m helvolum AT CC11822,G -)从北京微生物所购买;放射形土壤杆菌
(Agr obacteriu m radi obacter ACCC10056,G -)从中国菌种保藏中心购买;金黄色葡萄球菌(G +),枯
草芽孢杆菌(G +
)为本实验室保藏。
112 试剂及仪器
[2]
主要试剂为10mg/m l 溶菌酶,20mg/m l 蛋白酶K,2×CT AB (十六氨基三乙基溴化铵)。引物序列为:5π-ggaattcggatccatggacttcgaggcattt (B am H I,EcoR I ),3π-ttaagcttcctcacgccaccgcacgcgc (H in d III ),由上海博亚生物技术有限公司合成。
仪器有Lengguang Tech 1Spectrum lab54型分光光度计,L I TT LE GE N I U S (Japan )基因扩增仪。113 聚合酶链式反应(PCR )
PCR 扩增的反应体系为:反应总体积20μl,含10pmole 引物,50ng 基因组DNA,2μl 10×PfuTaq
?
84?
嘉兴学院学报
Jou rna l of J iaxing U n iversity
第19卷第3期2007年5月
Vol .19No .32007.5
DNA 聚合酶缓冲液,015μl (215unit )PfuTaq DNA 聚合酶,015μl 10mmol/l dNTP 混合液,其余为双蒸水。
PCR 扩增的条件:95℃预变性10m in,95℃变性30s,58℃复性30s,72℃延伸2m in,循环扩增30次。
114 微生物基因组DNA 提取方法
11411 溶菌酶法
[3]
收集对数生长期的菌液5m l,置于10000r pm 离心5m in;弃上清,用500
μl TE 重悬于115m l 离心管中,加10μl 10mg/m l 溶菌酶,37℃保温20m in,再加215ul 20mg/m l 蛋白酶K 混
匀,37℃保温1h;再加等体积的酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1),置于10000r pm 离心5m in;取上清液加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的Na Ac (pH =416),于-20℃下静置10m in 后于12000r pm
离心10m in;所得的DNA 沉淀用70%的乙醇洗2次,自然风干后溶于40μl 的TE (含20ug/m l RNase ),55℃处理15m in,于-20℃保存备用。
11412 改良的CT AB
[4-5]
法 收集对数生长期的菌液5m l,置于10000r pm 离心5m in;弃上清,用
500μl TE 重悬于115m l 离心管中,加100μl 10%S DS 溶液,215μl 20mg/m l 蛋白酶K,37℃保温1h,
再加75μl NaCl 和75μl 2×CT AB 混匀,65℃保温30m in,再加等体积的酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1),置于10000r pm 离心5m in;以下步骤同溶菌酶法。
11413超声破碎提取法[6]
收集对数生长期的菌液5m l,置于10000r pm 离心5m in;弃上清,用3m l
裂解缓冲液(110mol/L NaCl,50mmol/L EDT A ,50mmol/L Tris ?Cl ),加30μl 10mg/m l 溶菌酶冰水浴30m in 后超声处理,超声条件:250W 每次工作5s,间隙5s,重复20次,再加等体积的酚、氯仿、异
戊醇(25∶24∶1),置于10000r pm 离心5m in;以下步骤同溶菌酶法。2 实验结果211 分光光度测定
将以上三种方法提取的DNA ,通过紫外分光光度计测定它们在260n m 处和280n m 的吸光值,并计算它们的比值和DNA 含量,结果见表1。
表1 三种微生物基因组提取方法的纯度和浓度比较
方法
菌种A260/A280DNA 产率(ng/mL )
溶菌酶法
黄色短杆菌
1168±010527154±1105放射形土壤杆菌1166±010731158±1165金黄色葡萄球菌1170±010292146±0195枯草芽孢杆菌1169±010583187±1125CT AB 法
黄色短杆菌1172±010361123±1145放射形土壤杆菌1178±010425145±0185金黄色葡萄球菌1176±010565142±0195枯草芽孢杆菌1175±010370143±1110超声破碎法
黄色短杆菌1191±010245138±1145放射形土壤杆菌1189±010139183±1115金黄色葡萄球菌1190±010235165±0175枯草芽孢杆菌
1195±0103
42148±1105
212 琼脂糖凝胶电泳检测
将三种方法提取的放射形土壤杆菌基因组DNA,进行018%琼脂糖凝聚电泳,见图1。
213 PCR 特异性扩增的验证
将三种方法提取的放射形土壤杆菌基因组DNA 为模板进行特异性扩增,见图2。3 讨论
通过对多种微生物基因组的提取来看,溶菌酶法较适合革兰氏阳性菌,而不适合提取革兰阴性
?
94?刘晓侠,林建平,岑沛霖:微生物基因组DNA 提取方法的比较与改进
溶菌酶法 CT AB 法 超声破碎法 M -marker;1-溶菌酶法;2-CT AB 法;3-超声破碎法
图1 放射形土壤杆菌基因组DNA 样品电泳图 图2 PCR 扩增的结果
菌的基因组DNA,原因可能与细胞壁的成分有关[7]
,溶菌酶作用于肽聚糖的N -乙酰胞壁酸的1位
碳和N -乙酰葡萄胺的4位碳之间的β-1,4糖苷键,在革兰阳性菌中约含40-90%的肽聚糖,而革兰阴性菌只含10%的肽聚糖。所以它的应用受到一定的限制。
改良的CT AB [8]
法适合于大多数微生物基因组的提取,且提取的DNA 较其他两种方法纯,但由于有些微生物的经CT AB /NaCl 处理后,经高速离心很难吸出上清液,在这种情况下,需采用改进的超声破碎法。
超声破碎法由于具有强烈的机械作用、空化作用和乳化作用,对微生物细胞的细胞壁破碎较为完全,且经酚:氯仿:异戊醇提取,可以较为完全的将DNA 和蛋白质及其他杂质分开,但由于作用条件剧烈,会造成DNA 部分降解,使DNA 回收率降低。 参考文献:
[1]L iu X 1X 1,L in J.P .,Q in G ..,Cen P .L.Exp ressi on of a ne w hemA Gene fr om Agr obacterium radi obacter in Escherichia coli f or
5-a m inolevulinate p r oducti on [J ].Chinese J.Chem.Eng .,2005,13(4):522～528.
[2]J.萨姆布鲁克, D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南[M ].北京:科学出版社,2002
[3]乔建军,杜连祥.一种快速有效的枯草芽孢杆菌染色体的提取方法[J ].生物技术,2001,11(2):38～40.[4]李德葆,周雪平,许建平,何祖华.基因工程操作技术[M ].上海:上海科学技术出版社,1996: 1.[5]F .奥斯伯,R.布特伦,R.E .金斯顿.精编分子生物学[M ].北京:北京科学出版社,1998:7.
[6]刘小勇,田素忠,秦国夫,沈瑞祥.提取植物和微生物DNA 的S DS -CT AB 改进法[J ].北京林业大学学报,1997,
19(3):100～103.
[7]岑沛霖,蔡谨.工业微生物学[M ].北京:化学工业出版社,2000:6～40.
[8]陈颖,刘根齐,李文彬,孙勇如.三种小球藻DNA 提取方法的比较[J ].植物生理学通讯:2001,37(3):242～244.
(责任编辑 方土)
?05? 嘉兴学院学报 第19卷第3期
植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根)
植物基因组DNA提取试剂盒 1 取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分研磨。 2 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 3 加入700 μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm（~13,400×g）离心5 min。 注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。 4 小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀。 5 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。） 6 向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7 向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8 重复操作步骤7。 9 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μL，体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置 2 min，12,000 rpm （~13,400×g）离心2 min。
不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较学号
学校代码学号分类号密级 本科毕业论文 学院、系环境与资源学院 专业名称环境科学 年级2010级 学生姓名 指导教师 2014年5月
不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较 摘要 环境样品DNA的提取和纯化不仅是土壤微生物进行研究的前提条件，而且是环境宏基因组学中最关键的技术问题之一，DNA的产量和纯度对后续的一系列的分子生物学技术操作如：多聚酶链反应(PCR)扩增、核酸内切酶酶切消化、核酸分子杂交等等，都会产生很大的影响，所以后续试验有效进行，必须要先获得一定纯度、数量、有较好代表性和适当片段长度的DNA。本文针对三种典型的土壤类型（壤土、粘土和沙土），对目前应用比较广泛的三种不同的DNA 提取方法和四种不同的DNA 纯化方法的效果进行了比较。经过NanoDrop分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对从三种典型土壤中提取和纯化的DNA的浓度和纯度进行检测，结果表明：Power Soil? DNA提取试剂盒和苯酚 - 氯仿抽提，异丙醇沉淀纯化方法的结合能提供满足环境组学研究的宏基因组测序要求的DNA。关键词：土壤微生物,DNA,提取,纯化
Comparison of DNA extraction and purification methods from different soils Abstract The extraction and purification of DNA from environmental samples is not only a prerequisite for microbial research, and is one of the environmental metagenomics most critical technical issues, the yield and purity of DNA on the subsequent series of molecular biology techniques operate such as: polymerase chain reaction (PCR) amplification,restriction enzyme digestion, the nucleic acid hybridization, etc. will have a huge impact, if follow-up tests effectively, you must first obtain a certain purity, quantity, better DNA fragments representative and appropriate length. In this paper, we have compared several different methods of DNA extraction and purification for three different soil, loam, sandy clay . After a NanoDrop spectrophotometer and by agarose gel electrophoresis and purified from the extract of the soil of three DNA concentration and purity, and the results showed that: Power Soil ? DNA extraction kit and phenol-chloroform extraction and isopropanol precipitation purification methods' combined provides the right DNA for the study of environmental groups metagenomic sequencing. Keywords:Microbial soil, DNA , Extraction, Purification
基因组DNA提取方法
1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE 溶液中，置4oC保存备用。 2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE （50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。 3 1) 细菌培养：细菌接种于5ml 液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP 管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O 也行)。3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7) 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。
微生物基因组DNA提取方法的比较与改进
收稿日期:2006-09-041 作者简介:刘晓侠(1978- ),女,江苏丰县人,嘉兴学院生物与化学工程学院教师,博士,研究方向为基因工程、发酵工程。 微生物基因组DNA 提取方法的比较与改进 刘晓侠1 ,林建平2 ,岑沛霖 2 (11嘉兴学院生物与化学工程学院,浙江嘉兴314001;21浙江大学生物工程研究所,浙江杭州310027) 摘 要:高质量的微生物基因组DNA 是基因工程的前提。目前国内外关于微生物基因组DNA 提取的方法很多,根据研究对象和目的不同而方法各异。该文就现有方法中应用最为广泛的三种提取微生物基因组 DNA 的方法进行了比较,并对它们进行一些改进,获得了针对不同细胞壁成分的微生物相应的简便、快速 且高质量基因组DNA 提取方法,并对提取的DNA 进行PCR 特异性扩增检测,获得较清晰的谱带[1],为基因克隆表达研究奠定了基础。 关键词:微生物;DNA 提取;PCR 中图分类号:Q933 Co m par ison and I m prove m en t of Extracti on M ethods for Geno m i c D NA L I U Xiao -xia 1 ,L I N J ian -p ing 2 ,CE N Pei -lin 2 (11School of B i ol ogy and Che m ical Engineering,J iaxing university,J iaxing,Zhejiang 3140001; 21I nstitute of B i oengineering,Zhejiang University,Hangzhou,Zhejiang 310027) Abstract:H igh quality genom ic DNA fr om m icr oorganis m is the p reconditi on of genetic mani pulati on .Now many methods f or the extracti on of genom ic DNA are devel oped according t o different research object and intenti on .Three kinds of methods widely app lied are compared and ref or med in is olati on of genom ic DNA fr om m icr oorganis m.And ef 2fective methods for extracting high pure genom ic DNA are established considering different cell wall components .Ge 2nom ic DNA gained by three different methods above is s pecifically a mp lified and clear band is observed by agar ose gel electr ophoresis,which is convenient t o genetic mani pulati on later . Key words:m icr oorganis m;DNA extracti on;PCR (Poly merase Chain Reacti on ) 文献标识码:A 1 文章编号:1008-6781(2007)03-0048-03 1 材料与方法111 试验材料 黄色短杆菌(B revibacteriu m helvolum AT CC11822,G -)从北京微生物所购买;放射形土壤杆菌 (Agr obacteriu m radi obacter ACCC10056,G -)从中国菌种保藏中心购买;金黄色葡萄球菌(G +),枯 草芽孢杆菌(G + )为本实验室保藏。 112 试剂及仪器 [2] 主要试剂为10mg/m l 溶菌酶,20mg/m l 蛋白酶K,2×CT AB (十六氨基三乙基溴化铵)。引物序列为:5π-ggaattcggatccatggacttcgaggcattt (B am H I,EcoR I ),3π-ttaagcttcctcacgccaccgcacgcgc (H in d III ),由上海博亚生物技术有限公司合成。 仪器有Lengguang Tech 1Spectrum lab54型分光光度计,L I TT LE GE N I U S (Japan )基因扩增仪。113 聚合酶链式反应(PCR ) PCR 扩增的反应体系为:反应总体积20μl,含10pmole 引物,50ng 基因组DNA,2μl 10×PfuTaq ? 84? 嘉兴学院学报 Jou rna l of J iaxing U n iversity 第19卷第3期2007年5月 Vol .19No .32007.5
磁珠法土壤基因DNA提取试剂盒
磁珠法土壤基因组DNA提取试剂盒 MagBeads Soil DNA Extraction Kit ［目录号】SMDE-5005、SMDE-5010 【运输条件】2~25 C； 【保存条件】磁珠分散液2~8 C；蛋白酶K -20 C；其它组分室温保存; 【试剂盒组成】 【注意事项】 1. 磁珠悬浮液严禁反复冻融和离心，以免磁珠受到损害，使用前务必充分混匀； 2. 使用前请检查裂解液1和裂解液2是否出现沉淀，如有沉淀请将试剂瓶置于65 C水浴中温热至 液体澄清； 3. 蛋白酶K长期不使用，请置于-20 C保存，融化后4C保存，并尽快使用； 【产品简介】 本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的干燥土壤中提取基因组DNA。试剂盒采用独特的缓冲液
体系，在裂解液环境中基因组DNA与磁珠高效结合，经过清洗和洗脱等步骤之后，可去除土壤中的杂质与腐植酸，获得高质量基因组DNA产物，OD260/OD280比值一般在1.7~1.9之间, 可直接用于酶切、PCR、电泳、Southern Blot、分子标记等下游分子生物学实验。 【试剂盒说明】 【自备仪器、耗材和试剂】 手动普通版：涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、EP管（2.0mL ）、EP管配套用磁力架、异丙醇、无水乙醇、RNase A 溶液（100mg/mL，分散液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH值8.0）。 手动高通量版：涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、48孔尖底板、48孔板配套专用磁力架、超强 磁板架48孔板专用硅胶盖、异丙醇、无水乙醇、RNase A溶液（100mg/mL，分散液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 值8.0 ）。 【手动普通版】 本操作方法在2.0mL EP管中进行操作。 1. 释放土壤微生物 称取100~500mg 土壤样本至2.0mL EP管中，依次加入1.0mL裂解液1和20卩蛋白酶K， 涡旋振荡1~3min，将土壤样本分散均匀，58 C温浴10min，期间每隔5min颠倒3次混匀内容物。 注：1）如需去除RNA，请额外加入5 RNase A溶液；2）干燥的土壤样本请研磨至均一细小颗粒，有助于微生物的高效释放。 2. 获得土壤基因组DNA粗液 室温、12000rpm将EP管离心5min，然后转移全部上清液至新的 2.0mL EP管中。加入 400卩裂解液2，颠倒混匀，再次室温、12000rpm将EP管离心5min。 3. 核酸结合 转移全部上清液至另一只2.0mLEP管，依次加入400卩屏丙醇和50卩磁珠悬浮液（提前摇晃均匀），涡旋振荡5min。 4. 磁性分离 将EP管置于磁力架上静置约20s至磁珠吸附完全，如EP管内盖有残留磁珠，可保持EP管
DNA提取方法和试剂作用
1试剂的作用 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 2 DNA提取分为三个基本步骤 每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。 .细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。 加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA 结合的组蛋白。将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA 的商业化试剂盒。 DNA提取的几种方法 (1).浓盐法 A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中
土壤DNA提取
1 试验材料 吉林省松江河镇人参栽培土壤。每份土壤样品经多点取样后充分混匀，用前过10 目筛，去除土壤中的须根、枯枝等杂物[2]。 1 . 2 仪器设备及药品 电子分析天平、恒温水浴锅、紫外凝胶成像系统、电泳槽、 电泳仪、高速冷冻离心机、微量加样器、PCR 仪等。 TENP 缓冲液（50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100mmol/L Na Cl，1% PVP，pH 10.0）、CTAB 提取缓冲液（100mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Na3PO4，1.5mol/L Na Cl，1%CTAB，pH 8.0）、 SDS 提取缓冲液（100 mmol/LTris，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L Na Cl，pH8.0，灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L）、 异丙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、琼脂糖、EB、Taq DNA 聚合酶、d NTP、6×凝胶上样缓冲液、DNAMarker 等。 主要试剂有十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）、异硫氰酸胍，均为分析纯级。 1 .3 试验方法 1.3.1 土壤微生物的洗涤取土壤样品2g，置于50m L 灭菌的离心管中；加入10m L TENP 缓冲液[3]悬浮土样，磁力搅拌器搅拌15 min；10000r/min 离心5min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本无色；最后将沉淀收集至1.5ml 离心管中。 1.3.2 DNA 的提取 1.3. 2.1 CTAB 法按照李钧敏[4]的方法略作改动。将沉淀重悬于500μl CTAB 提取缓冲液→65℃水浴2h→8000r/min，室温离心15 min，取上清→加入等体积氯仿：异戊醇（24∶1），12,000r/min 离心10 min，取上清→加入0.6 倍体积的异丙醇，4℃淀过夜→12000 r/min 4℃离心20min 收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100 μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。 1.3. 2.2 SDS 法按照焦晓丹[5]的方法略作改动。取沉淀，重悬于500μl SDS 提取缓冲液，轻轻混匀→向管中加入50μL 20%SDS 溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA 断裂→65℃保温2h，每隔20min 轻轻摇匀1 次→加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇（24∶1），混匀后12000r/min 离心10min，取上清→加入2 倍体积的无水乙醇，静止于室温下2h →以12000r/min 离心20min，收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。
植物基因组DNA提取
植物基因组DNA提取 一、实验目的 1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。 2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验仪器及试剂 实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。 实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。 四、实验步骤 1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。 2.将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。 3.加入700 l的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。 4.置于65℃的水浴中，每隔10 min轻轻摇动，30 min后取出。
5.加入200 μl KAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30 min。 6.10000 rpm离心5 min，上清移至新离心管中，12000 rpm离心5 min。 7.上清移至新离心管中，加入700 μl异丙醇，-20℃冰箱30 min。 8.10000 rpm离心5 min，弃上清，加入500 μl 70%乙醇漂洗。 9.弃液体，晾干。 10. DNA纯度与浓度测定（使用nanodrop）。 （1）DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。 OD260/OD280 ≈ 1.8：说明较纯； OD260/OD280 > 1.8：说明可能有RNA污染； OD260/OD280 < 1.8：说明可能有蛋白质污染。 五、注意事项 1. 叶片磨得越细越好。 2. 注意移液器的正确使用。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 六、结果与分析 1.植物DNA提取所用试剂的作用？ 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些？ 3.植物DNA提取后的用途有哪些？ 4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。
DNA提取方法和试剂作用详解
1 试剂的作用 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA 时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或 NaAc，Na+中和DNA 分子上的负电荷，减少DNA 分子之间的同性电荷相斥力， 而易于聚集沉淀。 2 DNA 提取分为三个基本步骤 每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而 有区别。 .细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS 处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。 加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA 结合的组蛋白。将DNA 在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA 在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA 的商业化试剂盒。 DNA 提取的几种方法 (1).浓盐法 A.利用RNA 和DNA 在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA 粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA 位于上层水相中,用2 倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. B.也可用0.15 MNaCL 液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧 核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.
土壤总DNA的几种提取方法
土壤总DNA的几种提取方法 SDS 高盐法(方案1) 具体步骤: 称取1 g 土壤,放入研钵中,倒入适量的液氮,立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨,重复3 次,使土壤颗粒研成粉末; 将13.5 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸盐[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl 蛋白酶K(10 g/L ) 与5 g 土壤置于50 ml 的离心管中,放入37 ℃恒温摇床上,225 r·min - 1振荡30 min ; 加入1.5 ml20 % SDS ,轻轻混匀,65 ℃水浴加热2 h ,每隔15～30 min 轻轻摇匀1 次;5 000 r·min - 1离心10 min ,将上清液转入新的50 ml 离心管中;取4.5 ml 提取缓冲液加入原离心管,摇匀泥浆,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同样的离心速度离心10 min ,将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1 次; 用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000 r·min - 1离心20 min ;收集上清液,并加入0.6 倍体积的异丙醇,室温静置1 h ;25 ℃下12 000 r·min - 1离心20 min ,倒出上清液,干燥后加入500μl 去离子水,溶解粘附于离心管壁的DNA 及其杂质,并收集于1.5 ml 的微型离心管中. 变性剂加SDS 高盐法(方案2) 具体步骤： 取1 g 土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合,加入1 ml 变性剂(4 mol/L异硫青酸胍,10mmol/L Tris-HCl [pH 7.0 ] ,1 mmol/L EDTA[pH 8.0 ] ,0.5 % 2-巯基乙醇) ;液氮冰冻,研磨至溶解,重复3 次; 转入50 ml 离心管中,加入9 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸钠[pH 7.0 ] , Tris-HCl [ pH 7.0 ] , 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴1 h ,每10 min 轻轻混匀1 次;5 000 r·min - 1 离心10 min ,取上清; 在原管中加入5 ml 提取缓冲液,混合后,65 ℃水浴10min ,离心,取上清,合入上述上清液;重复一次;加入等体积的氯仿混合,5 000 r·min - 1离心20 min ,取上清;加入0.6 倍体积的异丙醇,室温沉淀1 h ;20～25 ℃,12 000 r·min - 1离心20 min ,TE 溶解沉淀. SDS-酚氯仿抽提法（方案3） 称取1g土壤样品，加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸缓冲液，玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg，使终浓度为 2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min，加125ul 20%SDS振荡处理15min，离心，分装EP管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h,离心，70%乙醇清洗，200Ul TE 溶解。 冻融溶菌酶SDS裂解法（方案4） 取1g土壤样品，加如0.5ml灭菌的抽提缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl , 100 mmol/L EDTA, 200 mmol/L NaCl, 1.0% PVP, 2.0%CTAB , PH8.0）, 加玻
基因组DNA提取步骤
基因组DNA提取步骤 1.从无水乙醇中取出少许组织（约50mg）加入干净灭菌的EP管中， 剪碎； 2.加入400ul 1％的SDS，8ul（20mg/ml）的蛋白酶K，充分浸润， 入55℃摇床（100转/分），期间振荡助溶至澄清（5-6h）； 3.取出消化液，加入6mol/L的NaCl300ul，氯仿200ul，轻柔正反 颠倒，使其充分乳化，4℃13000转/分离心30min； 4.取出上清（约400ul），加入等体积氯仿抽提一次，轻柔颠倒后， 4℃13000转/分离心10min； 5.上清加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一 般无影响，可省略该步骤）。 6.取上清加入等体积异丙醇，轻柔混匀后-20℃沉淀10min； 7.4℃13000转/分离心15min，弃上清； 8.用75％乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心2min），弃上 清； 9.冰冻无水乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心4min）弃上 清，自然晾干或烘干，DDW溶解，30-50ul。 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，
基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 从植物组织提取基因组DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和 1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、RnaseA母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下5000rpm离心5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转
湿地土壤微生物DNA提取及其脱腐技术
微生物学通报 AUG 20, 2010, 37(8): 1130?1137 Microbiology China ? 2010 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@https://www.360docs.net/doc/077191846.html, 基金项目：国家973计划前期研究专项项目(No. 2009CB125909) *通讯作者：Tel: 86-471-4991676; : ndzj@https://www.360docs.net/doc/077191846.html, 收稿日期：2010-01-25; 接受日期：2010-05-24 摘 要: DNA 分子生物学技术的广泛应用, 为全面了解微生物群落提供了有力的工具。本文建立了一种新的从湿地土壤中提取微生物总DNA 的方法, 即氯化钙-SDS-酶法。在直接提取DNA 过程中采用氯化钙去除腐殖酸, DNA 提取缓冲液中不使用EDTA 螯合剂, 提取过程用时4 h 左右。与其他两种方法相比, 该方法高效去除湿地土壤腐殖酸, 纯度较高, 满足PCR 扩增, 为微生物生态学研究提供了一种高效的湿地土壤微生物总DNA 提取和纯化技术。 关键词: 湿地土壤, DNA 提取, 腐殖酸, PCR 扩增, 氯化钙-SDS-酶法 DNA Extraction and Removing Humic Substance from Wetland Soil LI Jing-Yu 1 ZHAO Ji 2* BIAN Yu 2 WU Lin-Hui 2 YU Jing-Li 2 (1. College of Life Sciences , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) (2. College of Environment & Resources , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) Abstract: DNA-based molecular biology techniques have widely been used as a powerful tool to un-derstand the microbial community. In this paper, a new method to extract microbial genomic DNA from wetland soil was established, namely Calcium Chloride-SDS-Enzymatic. Calcium chloride rather than EDTA chelating agent was used to remove humic acids in the process of direct DNA extraction. The extracting time is less than 4 hours. In comparing with other two methods, this method is more efficient in removing humic acids from wetland soil, and the purity of extracted DNA is higher which can be ap-plied to PCR amplification. It provides an efficient technology to extract and purify microbial genome DNA from soil for microbial ecological studies. Keywords: Wetland soil, DNA extraction, Humic acid, PCR amplification, Calcium chloride- SDS-enzymatic 从土壤和沉积物样品中提取微生物总DNA 是研究微生物多样性的前提和基础, 方法大致可以分为直接提取和间接提取两大类[1]。直接提取法获得DNA 的量较大, 但腐殖酸的存在会影响到下游的分 析[2]。为了获得纯度较高的微生物总DNA, 需要对其进行纯化处理。纯化处理的方法有硫酸铝捕获腐殖酸法[3]、PVPP 纯化法[4]、CTAB 法[5]、氯化铯密度梯度离心法[6]、交联葡聚糖和琼脂糖凝胶过滤树
DNA提取方法
一、移液器使用 移液器（也称作“枪”）是所有分子实验操作不可或缺的工具，其正确使用是顺利开展各项实验的先决条件。为保证实验结果的准确性和稳定性，同时延长移液器的使用寿命，请大家细心操作并遵守以下使用规则和注意事项： 1.从未使用移液器或刚进入实验室的研究生，只有完全准确掌握移液器使用 规则后方可独立使用移液器。 2.按需要选用合适量程的移液器，调整刻度时，注意看移液器刻度表，不要 超过最大刻度。 3.装配吸头时，用力不要过猛，以免吸头难以脱卸，同时损坏移液器。 4.吸取液体时，注意要慢慢向上释放控制按钮以免吸入速度过快导致液体进 入移液器内。 5.切忌平放带有残液的吸头的移液器，更不能倒放。 6.使用移液器清洗或溶解固体物质等需反复吸打时，请装配多个叠加的吸 头，且调整刻度不超过移液器最大量程的一半。 7.移液器使用完毕，务必调到最大刻度，并稳妥地放回对应的移液器架上。 8.细心操作，如不小心使移液器表面沾到液体，请及时清洗干净；如不小心 将液体吸入移液器内，应及时清洗。 9.严禁用沾有放射性或腐蚀性物质的手套触摸移液器表面；严禁不熟悉移液 器构造者私自校对移液器刻度。 第一节叶片总DNA的提取 一、取样须知 1. 取样之前一般要先编号（牌子和离心管的编号）和挂牌，务必保证离心管中 的叶片是来自于同一编号单株，编号切勿混淆； 2. 为保证质量，所取样品尽量为幼嫩叶片组织，并尽量保证全程低温（使用冰 袋或碎冰）； 3. 取样时间最好在晴天或阴天上午叶面露水干后进行，尽量使样品不沾水及泥 土。 4. 如使用塑料袋装样品，切记将袋内空气排尽，以免在–70℃保存时塑料袋破裂导致样品混合。 二、试剂的配制 1. Tris-HCl ( 1.0 M/L, pH8.0 ) 121.16g Tris-HCl 和43ml HCl 加dd H2O 定容至1 L. 2. EDTA ( 0.5M/L, pH8.0 ) 186g EDTA和25g NaOH加dd H2O 定容至1 L. 3. 2％CTAB 81.9g NaCl 100ml 1.0 M/L Tris-HCl ( pH8.0 )
实验室土壤DNA提取方法
改良CTAB-SDS法 1、称取1 g土壤样品，加1ml DNA提取液（0.1 mol/L Tris-Hcl；0.1 mol/L EDTA； 0.1 mol/L 磷酸钠；1.5 mol/L Nacl；1％CTAB；pH 8.0,将各种试剂按配置的体积数称量混合即可。），在漩涡震荡仪上混匀。 2、加入100ul溶菌酶温和37℃裂解30min,液氮冷冻10 min，65℃水浴10 min，反复冻融3次。 3、加入20％ SDS缓冲液溶液100μl，65℃水浴2h，每20 min轻轻颠倒几次。8000 r/min离心10 min，取上清。 4、剩余残渣中再加500μl DNA提取液和100μl SDS 缓冲液，65℃水浴30 min，8000 r/min室温离心10 min，取上清，合并两次的上清液。 5、等体积的氛-氯仿-异戊醇（25：24：1）抽提2至3次(氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次)，静置10min，12000rpm，10min取上清。 6、加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的无水乙醇混匀，4℃沉淀过夜。 7、13000 r/min离心5 min，70%乙醇清洗2次，30μl ddH 2 O溶解。 8、提取粗DNA在0.6%（1%）的Agrose，70 V（100V）电压下电泳1.5 h（40min）。注意事项：这个千万不要4℃过夜啊，4℃过夜你会发现很多的絮状悬浮物，我之前犯过类似错误，这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。室温放置1－2h就好。 提取土壤微生物总DNA的纯度和浓度检测 对提取的土壤微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,同时采用紫外分光光度计分别测定提取土壤微生物总DNA稀释液在230 nm，260 nm，280 nm处的光 密度值。以OD 260/OD 280 （DNA/蛋白质），OD 260 /OD 230 （DNA/腐植酸）比值检测DNA纯 度。 DNA浓度=OD 260 值×50μg／ml×80×DNA 溶液体积／干土质量[68]