SDS-PAGE凝胶电泳
蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳
一目的
掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法
二原理
SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。
基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量
三试剂和器材
试剂：1低分子量标准蛋白质
2 待测蛋白质样品（用上次测定的可溶性蛋白样液）
3 凝胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，过滤，于4°暗处贮存，一个月内使用
4 1mol/l，PH8.8 Tris-HCl 缓冲液，Tris121g溶于蒸馏水，用浓盐酸调至PH8.8，以蒸馏水定容至1000ml
5 10%(w/v)SDS
6 10%(w/v)过硫酸铵溶液（当天配）
7 四甲基乙二胺（TEMED）
8 电极缓冲液PH8.3：Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS 10g，溶于蒸馏水并定容至1000ml,使用时稀释10倍。
9 2×样品稀释液：SDS 500mg,巯基乙醇1ml ,甘油3ml, 溴酚蓝4mg，1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，用蒸馏水溶解并定容至10ml，按每份1ml分装，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。以此液制备样品时，样品若为液体，则加入与阳平等体积的原液混合即可。
10 固定液：500ml 乙醇，100ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml
11 脱色液：250ml乙醇，80ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml
12 染色液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中
器材：微量进样针，电泳仪，电泳槽
四操作步骤
1分离胶制备：
凝胶浓度5% 7.5% 10% 12.5% 15%
凝胶贮液ml 5 7.5 10 12.5 15
1mol/LPH8.8 Tris-HClml 11.2 11.2 11.2 11.2 11.2
水ml 13.7 11.2 1.2 8.7 3.7
10% SDS ml 0.3
10% 过硫酸铵ml 0.1
TEMED (μL) 20
将上述胶液配好，混匀后，迅速加入两块玻璃板间隙中，使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形
成凹槽处处平齐，而后插入“加样梳”，在室温下放置1小时左右，分离胶即可完全凝集。凝聚后，慢慢取出“加样梳”，取出时应防止把加样孔弄破，取出“加样梳”后，在形成的加样孔中加入蒸馏水，冲洗未凝集的丙烯酰胺，倒出加样孔中的蒸馏水后，在加入已稀释的电极缓冲液。
2, 样品制备：
标准蛋白质制备
待测蛋白样品制备：
液体待测样品，可取500μL，加入等体积的“2×样品稀释液”，混匀，在沸水浴中加热5min,取出，冷却至室温备用。若液体待测样品蛋白质浓度太稀可经浓缩后再制备。
3，点样
用微量进样针吸取上述蛋白质样品20μL分别加入到各个加样孔中，为了获得准确的结果，每个样品应做两次重复。
4，电泳
将电泳槽与电泳仪连结，在电泳槽中加入已经稀释的电极缓冲液，打开电源，选择合适电压，保持恒电压300V，进行电泳，直至样品中燃料迁移至离下端1cm处，停止。
5，固定，染色，脱色
将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，置摇床上缓慢震荡30min以上（染色时间需根据凝胶厚度适当调整）。取出凝胶在水中漂洗数次，再加入考马斯亮蓝脱色液、震荡。凝胶脱色至大致看清条带约需1h，完全脱色则需更换脱色液2～3次，震荡达24h以上。
凝胶脱色后可通过扫描、摄录等方法进行蛋白质定量检测。
淀粉酶活性电泳
浓缩胶（单板）：
水：1.8ml 凝胶贮液：0.5ml PH6.8缓冲液：0.78ml
10%SDS :34μL TEMED:30μL10%AP:25μL
上样要少，4μL即可；
电泳完毕后，胶用清水冲洗两遍，再用2mol/l Tris溶液浸泡1h；
蒸馏水洗干净，倒入1%淀粉溶液，震荡水浴锅中，37°反应10min；
取出，加入碘-KI（0.2%：2%）溶液显色；
灯箱观察拍照。
糖电泳
电极缓冲液
0.09 MTris
0.08M硼酸
2.6mMEDTA
胶
7.5ml凝胶贮液
15ml贮液
7.5ml水
TEMED 60 微升
10%AP 90微升
贮液
0.2 Mtris
0.2m 硼酸
2mmEDTA
进样缓冲液
4×2M蔗糖（10ml贮液)
在实验中, 对电泳缓冲系统进行了改进, 即采用pH 9.4 硼砂- 氢氧化钠缓冲液; 同时对电泳条件进行了优化探讨, 重点对多糖PAS染色方法进行研究, 得到较佳的多糖和糖蛋白电泳后的PAS染色法:即先用10%TCA 处理5 min; 再用1% 高碘酸处理15 min; 蒸馏水洗涤3 次, 每次5 min; 倒入Schiff试剂避光染色30 min; 然后用0.5% 偏重亚硫酸钠洗3 次, 每次5 min。以上各步均在室温下及转速为85 r·min-1 的脱色摇床中进行, 于7% 的醋酸溶液中保存。此法操作更加简便, 染色处理过程更加快速, 所需时间为1.8 h。
（王玉琪,巫光宏, 林先丰, 贺丽平, 黄卓烈.多糖和糖蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进.植物生理学通讯, 2009,45(2):169-172）
阿利辛蓝-硝酸银染色
1. 1 mg/ml 阿利辛蓝水溶液30min，吸走染料
2.除离子水洗涤数次，并可以在除离子水中过夜
3.胶在3.4 mM重铬酸钾-3.2 mM 硝酸中处理7min，除离子水水洗数次
4.凝胶浸泡在12 mM硝酸银(100w日光灯下30-40cm)处理25min
5.吸走硝酸银,迅速倒入0.28M碳酸钠(含有6mM甲醛),然后迅速倒掉
6.重新倒入该溶液,将胶浸没后再次倒掉
7.再次倒入该溶液, 直到显色, 加入0.1M醋酸溶液冲洗，终止反应。
硝酸银染色
PAGE+50%乙醇洗三次，15min/c i
2%硫代硫酸钠稀释50倍染12min, 水洗3次，20s
2%硝酸银稀释10倍，染20 min，水洗3次。每次10s
6%碳酸钠（50μ/100ml甲醛）显色，直到清晰，10%乙酸终止
活性物质的SDS-PAGE电泳检测（夹层胶电泳）
参照孙雪文等建立的Tricine-SDS-PAGE系统，对纯化的Fengycins进行电泳检测。具体电泳体系见（表5-1，表5-2，表5-3）：
表T ricin-SDS-PAGE电泳溶液
T able Stock sollutions for T ricine-SDS-PAGE
缓冲液Tris（mol/L）Triscine（mol/L）pH SDS（%）
+极-极凝胶0.2
0.1
3.0
/
0.1
/
8.9a
8.25b
8.45a
/
0.1
0.3
Notes：a means modified pH with HCl, b means no HCl added, natural pH is 8.25.
表5-2 丙烯酰胺储存液
T able 5-2 Acrylamide-bisacrylamide mixture
丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺含量（w/v）丙烯酰胺含量
（w/v）
甲叉双丙烯酰胺含量
（w/v）
49.5%、3%（3C）49.5%、6%（6C）
48
46.5
1.5
3.0 表5-3 凝胶的组成
T able 5-3 Composition of separating, spacer and stacking gels
组成浓缩胶夹层胶致密胶
3C凝胶储存液（mL）6C凝胶储存液（mL）凝胶缓冲液（mL）
尿素（g）
甘油（mL）
加双蒸水定溶至（mL）0.3
/
0.93
/
/
2.23
1.22
/
2
/
0.26
5.22
/
2
2
2.16
0.3
6
凝胶制作采用三层不连续胶的系统,先灌下边的致密胶和夹层胶,然后铺水层,待胶凝后,除去水层,灌上面的浓缩胶,小心插入梳子,静置30ml 加入150μl 10 %APS 和15μlTEMED
Tricine–SDS-PAGE
16 | VOL.1 NO.1 | 2006 | NATURE PROTOCOLS
Reducing sample buffers:
?Buffer A: 12% SDS (wt/vol), 6% mercaptoethanol (vol/vol), 30% glycerol (wt/vol), 0.05% Coomassie blue
G-250 (Serva), 150 mM Tris/HCl (pH 7.0)
?Buffer A/4: buffer A diluted with 3 volumes of water
?Buffer C: buffer A without glycerol
?Nonreducing sample buffers:
?Buffer B: 12% SDS (wt/vol), 30% glycerol (wt/vol), 0.05% Coomassie blue G-250 (Serva), 150 mM Tris/HCl (pH 7.0)
?Buffer B/4: buffer B diluted with 3 volumes of water
?Buffer D: buffer B without glycerol
?Electrode buffer (semidry transfer only): 300 mM Tris, 100 mM acetic acid (pH 8.6)
Electrode and gel buffers for Tricine–SDS-PAGE
缓冲液Anode buffer（10
×）Cathode buffer
（10×）
Gel buffer（3×）
Tris（M） 1.0 1.0 3.0
Triscine（M）- 1.0 -
HCL（M）0.225 - 1.0
SDS（%）- 1.0 0.3
pH8.9 ~8.25 8.45
Tricine obtained from Serva. Keep solutions at room temperature (20–25 °C). Do not correct the pH of the cathode buffer, which ideally should be close
to 8.25.
AB-3 stock solution
丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺含量（w/v）丙烯酰胺含量
（w/v）
甲叉双丙烯酰胺含量
（w/v）
49.5%、3%（3C）49.5%、6%（6C）48
46.5
1.5
3.0
For the acrylamide-bisacrylamide (AB)-3 stock solution(49.5% T, 3% C mixture), which is normally used, dissolve 48 g of acrylamideand 1.5 g of bisacrylamide (each twice-crystallized; Serva) in 100 ml of water. For the AB-6 stock solution (49.5% T, 6% C mixture), which is needed only foroptimal resolution of small proteins and peptides, dissolve 46.5 g of acrylamideand 3 g of bisacrylamide in 100 ml of water. ▲CRITICAL Keep the
solutionsat 7–10 °C, because crystallization occurs at 4 °C. ! CAUTION Acrylamide andbisacrylamide are highly neurotoxic. When handling these chemicals, weargloves and use a pipetting aid.
Impact of fluroxypyr on rice
Fluroxypyr triggers oxidative damage by producing superoxide and hydrogen peroxide in rice (Oryza sativa) Ecotoxicology (2010) 19:124–132
Guo Lin Wu，Jing Cui ，Ling Tao，Hong Yang
Polyacrylamide gel electrophoresis
Three grams of tissues were homogenized with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mM2-mercaptoethanl, 0.5 mM phenlmethyl and 1 mM EDTA. The homogenate was centrifuged at 15,000g at 4C for 20 min. The supernatant was used for the detection of isoenzymes. The isoenzymes of SOD, CA T and POD were separated on discontinuous polyacrylamide gels (PAGE) under the non-denaturing conditions. The stacking and separating gels contained 4.5 and 10% polyacrylamide, respectively. Proteins were electrophoretically separated at4C and 80 V in the stacking gel followed by 120 V in the separating gel (Zhou et al. 2007).
Superoxide dismutase activity was determined on gels as described by Wang and Y ang (2005). The gels were rinsed in water and incubated in the dark for 30 min in theassay mixture containing 50 mM potassium phosphatebuffer (pH 7.8), 1 mM EDTA, 0.05 mM riboflavin,0.1 mM nitroblue tetrazolium and 0.3% N,N,N0,N0-tetramethylethylenediamine(TEMED). After that, the gels were rinsed with water and exposed on a light box for 10 min until the colorless bands of SOD activity in a purple background gel were visible. For peroxidase isoforms, the gels were stained for 20 min in 0.2 M acetate buffer（醋酸）(pH5.5) with 5 mM benzidine联苯胺and 5 mM H2O2 (Zhou et al.2007).
For the detection of CA T isoenzyme activity, gels weresoaked in deionized water for 15 min. Subsequently, thegel was incubated in 0.03% H2O2 for 25 min and then carefully washed with deionized water to remove the residual H2O2. After that, the gel was stained in the solution of 1% (w/v) potassium ferricyanide铁氰化钾and 1% (w/v) ferric chloride氯化铁(Woodbury et al. 1971). This caused the gel to turn blue except at positions exhibiting CA T activity.When maximum contrast was achieved, the reaction wasstopped by rinsing the gel with deionized water. 铁氰化钾氯化铁
组织研磨，50 mM pH 7.0 磷酸钾缓冲液，包含1 mM巯基乙醇，0.5 mM 苯甲基 1 mM EDTA 匀浆液15000g 4°离心20min, 上清用来酶测定。SOD, CA T and POD酶在PAGE分离在非变性条件下。浓缩胶分离胶分别为4.5%，10%胶。
SDSPAGE电泳常见问题分析
SDS PAGE 电泳常见问题分析 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的 Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统， TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；
SDS-PAGE电泳标准操作流程
SDS-PAG电泳标准操作规程（网上） 3. 程序: 端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。 3.1.2分离胶的配置 3.122 灌胶混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内（胶高度距样品模板 梳齿下缘约1cm）。 3.1 . 2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面 变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸 吸干残留的水液。 3.1.3浓缩胶的配置 混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内（分离胶上方），轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。 3.2.1安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%勺凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹 形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与 贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X tris-gly 电泳缓冲液。 3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80 pl的样品，依次加上20Q 5x buffer （加了B-巯基乙醇），混匀。 对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer （加了B-巯基乙醇）煮沸10分钟。 3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10 p l，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker加 入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。 3.2.4电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移 动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。 3.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。 3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时, 完成后染液倒掉并用水洗掉染液。 3.4. 脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间 约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。 3.5. 拍照将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到 扫描仪上，拍照。 4. 注意事项 4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD选用10%交；50KD-30KD选用12%胶； 30KD-10KD选用15%交。4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作.4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。 4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。 4.6 分离胶高度控制得当，确保 有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。 4.7 电泳染色液注意进行回收再利用， 一般可重复使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实 验原理和操作步骤 实验原理： SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。 SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。 试剂和器材： 试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。 2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，
加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH 6.7，定容至100ml，4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液 6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制） 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。 8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。 器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。 实验操作
SDSPAGE电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂 1) 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH 2 O， 37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C； 2) 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH 2 O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100mL； 3) 1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11g加ddH 2 O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100 mL； 4) 4?分离胶缓冲液： 0.4gSDS溶于1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，定容至100mL； 5) 4?浓缩胶缓冲液： 0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6.8)，定容至100mL； 6) 10?电泳缓冲液(pH 8.3)： Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH 2 O溶解,定容至100mL； 7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH 2 O至10mL； 8) 2?SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)2.5mL，?-巯基乙醇1.0mL，SDS 0.6g， 甘油2.0 mL，0.1%溴酚兰 1.0 mL，ddH 2 O 3.5mL； 9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R 2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH 2 O 225mL； 10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH 2 O以2∶1∶7配制而成； 11) 分离胶(12.5%): ddH 2 O 4mL，30%储备胶5 mL， 4?分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL； 12) 浓缩胶（5％）：ddH 2 O 2.65mL，30%储备胶0.85mL，4?浓缩胶缓冲液1.25mL， 10%Aps 50μL，TEMED 5μL。 Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳 1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒
SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒 简介： 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ， SDS-PAGE)，其原理在于聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开，主要用于分离蛋白质和寡核苷酸。 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒不仅可用于配制SDS-PAGE 凝胶，也可配制非变性(native)PAGE 凝胶，具体配制的量应根据器具大小决定。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 配制10%过硫酸铵：直接在Ammonium Persulfate 中加入蒸馏水，充分溶解，分装 成小份储存于-20℃或4℃。注意：一般用1.5mlEP 管分装成0.5-1ml 每支，-20℃保存，每支使用2-3次即弃用。短期使用时，可保存于4℃，1周有效。 2、 根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，按照下表配制分离胶(下层胶)： 不同浓度的SDS-PAGE 分离胶的最佳分离范围： SDS-PAGE 分离胶浓度 最佳分离范围 6%胶 50-150kD 8%胶 30-90kD 10%胶 20-80kD 12%胶 12-60kD 15%胶 10-40kD 成分 配制不同体积SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积(ml) 编号 名称 PE0018 30T Storage 试剂(A): 30% Acr-Bis(29:1) 100ml 4℃ 避光 试剂(B): 1.5M Tris-HCl(pH8.8) 100ml RT 试剂(C): 10% SDS 5ml RT 试剂(D): Ammonium Persulfate 0.5g RT 试剂(E): TEMED 2×1ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理
SDS-PAGE电泳原理： 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯 酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。 SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。 TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。 SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 1.蛋白样品浓缩效应 在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓 冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1—速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1—很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly 离子加快移动，结 果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。 2.分子筛效应 蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其pH 升高(电泳进行时 常超过9.0)，使Gly 解 离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使Gly 的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复 存在，蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。
SDS-PAGE试剂配方
SDS-PAGE电泳所用溶液： 30 %聚丙烯酰胺溶液(100 mL) 丙烯酰胺(Arc) 29 g N,N’-亚甲双丙烯酰胺(Bis) 1 g 用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放 丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。 5×Tris-甘氨酸缓冲液(1 L) Tris碱15.1 g 甘氨酸(电泳级) 94 g 10 %SDS 50 mL 使用时稀释5倍使用 2×SDS凝胶加样缓冲液(10mL) 0.5 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 2 mL 10％(W/V)SDS 4 mL 甘油 2 mL β-巯基乙醇 1.0 mL (DTT（二硫苏糖醇）0.31g) 溴酚兰0.02g 双蒸水0.5 mL 室温存放备用 考马斯亮蓝染色液 考马斯亮蓝R-250 （G-250） 1.0 g 甲醇450 mL 冰醋酸100 mL ddH2O 450 mL 0.2g考马斯亮蓝R250+84mL 95％乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用 考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性） 甲醇100 mL 冰醋酸100 mL ddH2O 800 mL 医用酒精：冰醋酸：水=4.5：0.5：5(V：V：V)
SDS-PAGE所需溶液: A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。 B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约 3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。 C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。 D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶于去离子水中，定容至100mL(20mL)，加热至68℃助溶。 E液——10％过硫酸铵：5g(0.5g)过硫酸铵，溶于50mL(5mL)去离子水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。 F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存。
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m ， 式中M r ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； R m ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE 一. 实验原理 SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。 二. 试剂器材 30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制； 注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。 分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；
SDSPE电泳试剂配制
S D S P E电泳试剂配制集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
SDS-PAGE电泳试剂 1) 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀 O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C； 后加ddH 2 O溶解,浓盐酸调pH至,定容至 2) 1.5M Tris-HCl(pH ：Tris 18.17g加ddH 2 100mL； O溶解,浓盐酸调pH至,定容至100 3) 1M Tris-HCl(pH ：Tris 12.11g加ddH 2 mL； 4) 4分离胶缓冲液：溶于1.5M Tris-HCl(pH ，定容至100mL； 5) 4浓缩胶缓冲液：溶于1M Tris-HCl(pH ，定容至100mL； O溶解, 6) 10电泳缓冲液(pH ： Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH 2 定容至100mL； O至10mL； 7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH 2 8) 2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH ，-巯基乙醇，SDS 0.6g，甘油mL，%溴酚兰 mL，ddH O ； 2 1.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R 250 ddH O 225mL； 2 O以2∶1∶7配制而成； 10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH 2 11) 分离胶%): ddH O 4mL，30%储备胶5 mL， 4分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 2 (现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL； O ，30%储备胶，4浓缩胶缓冲液， 10%Aps 50μL，12) 浓缩胶（5％）：ddH 2 TEMED 5μL。 Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳 1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备
SDS-PAGE凝胶电泳
蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳 一目的 掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法 二原理 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。 基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量 三试剂和器材 试剂：1低分子量标准蛋白质 2 待测蛋白质样品（用上次测定的可溶性蛋白样液） 3 凝胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，过滤，于4°暗处贮存，一个月内使用 4 1mol/l，PH8.8 Tris-HCl 缓冲液，Tris121g溶于蒸馏水，用浓盐酸调至PH8.8，以蒸馏水定容至1000ml 5 10%(w/v)SDS 6 10%(w/v)过硫酸铵溶液（当天配） 7 四甲基乙二胺（TEMED） 8 电极缓冲液PH8.3：Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS 10g，溶于蒸馏水并定容至1000ml,使用时稀释10倍。 9 2×样品稀释液：SDS 500mg,巯基乙醇1ml ,甘油3ml, 溴酚蓝4mg，1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，用蒸馏水溶解并定容至10ml，按每份1ml分装，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。以此液制备样品时，样品若为液体，则加入与阳平等体积的原液混合即可。 10 固定液：500ml 乙醇，100ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 11 脱色液：250ml乙醇，80ml冰醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 12 染色液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中 器材：微量进样针，电泳仪，电泳槽 四操作步骤 1分离胶制备： 凝胶浓度5% 7.5% 10% 12.5% 15% 凝胶贮液ml 5 7.5 10 12.5 15 1mol/LPH8.8 Tris-HClml 11.2 11.2 11.2 11.2 11.2 水ml 13.7 11.2 1.2 8.7 3.7 10% SDS ml 0.3 10% 过硫酸铵ml 0.1 TEMED (μL) 20 将上述胶液配好，混匀后，迅速加入两块玻璃板间隙中，使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形
SDS-PAGE电泳注意事项
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。 强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。 在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS 结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。 聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS 电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。 注意问题 1.样品处理 上样缓冲液的作用：形成SDS-蛋白复合物，使其带负电；SDS和巯基乙醇使蛋白质解离，综上两点为了在电泳中，只根据分子量来分离。 SDS作用：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠，还有助溶剂的作用。 2. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用 （1）浓缩与分离胶凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。 3. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径 待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 4. .“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 5. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 6. 带出现拖尾现象 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 7. 带出现纹理现象 主要是样品不溶性颗粒引起的。
sdspage电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂 1)30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C； 2) 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0, 定容至100mL； 3) 1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100 mL； 4) 4?分离胶缓冲液：0.4gSDS溶于1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，定容至100mL； 5) 4?浓缩胶缓冲液：0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6.8)，定容至100mL； 6) 10?电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O 溶解,定容至100mL； 7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH2O至10mL； 8) 2?SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)2.5mL，β-巯基乙醇1.0mL，SDS 0.6g，甘油2.0 mL，0.1%溴酚兰1.0 mL，ddH2O 3.5mL； 9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL； 10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成； 11) 分离胶(12.5%): ddH2O 4mL，30%储备胶5 mL，4?分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL； 12) 浓缩胶（5％）：ddH2O 2.65mL，30%储备胶0.85mL，4?浓缩胶缓冲液1.25mL，10%Aps 50μL，TEMED 5μL。 Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳 1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备 1）正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ,定容至500mL。 2）负极缓冲液(10 ×)：将60. 55g Tris ,89. 58g Tricine 及5g SDS 溶于400ml 重蒸水中,加水至终体积为500mL。 3）凝胶缓冲液(3 ×)：将181. 5g Tris ,1. 5g SDS 溶于400mL 重蒸水中,用1M
SDS-PAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理
SDS－PAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS-PAGE电泳成功的关键是什么？ ①溶液中SDS单体的浓度 SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存在，能与蛋白质分子结合的是单体。为了保证蛋白质
与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1∶4或1∶3。②样品缓冲液的离子强度因为SDS结合到蛋白质上的量仅仅取决于平衡时SDS单体的浓度，不是总浓度，而只有在低离子强度的溶液中，SDS 单体才具有较高的平衡浓度。所以，SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10-100 mM。③二硫键是否完全被还原只有二硫键被完全还原以后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上从而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。Sample buffer 中的β-巯基乙醇的浓度常为4-5%，二硫苏糖醇的浓度常为2-3%。前者有挥发性，最好使用前加入。 SDS-PAGE缓冲液系统的选择，Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸盐或者其他？ 一般来说，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键的。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸盐缓冲系统，对于分子质量小于15 kDa的蛋白样品，可以使用SDS-尿素系统，也可以采用Tris-tricine缓冲系统。 积层胶（或称浓缩胶）的作用原理？
SDS-PAGE电泳操作规范
聚丙烯酰氨凝胶电泳 一简介 作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro 于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。 二作用 SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选
TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 三电泳过程 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A(1A=10的负十次方米），这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上
SDS-PAGE所有详细试剂配方
S D S-P A G E 30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide 【组分浓度】 各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g) 30%Acr-Bis(29:1) 1000ml 100ml 29%Acrylamide(丙烯酰胺) 290g 29g 1%BIS(N,N’-亚甲丙烯酰胺) 10g 1g 【配制方法】 将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 【保存条件】 4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存 【注意事项】 丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer) 【组分浓度】1MTris-HCL 名称用量备注 Tris 12.1g 去离子水80ml 浓盐酸9ml (36%的浓盐酸)预实验已确定 去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存 【配制方法】 称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH 值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 【保存条件】 室温保存。 【注意事项】 对人体有刺激性，请注意适当防护。 1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer) 【组分浓度】1.5MTris-HCL 名称用量备注 Tris 18.17g 去离子水80ml 浓盐酸3ml (36%的浓盐酸)预实验已确定 去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存 【配制方法】1L
SDSPAGE蛋白电泳手册
蛋白电泳手册 SDS-PAGE及Westernblot 蛋白电泳 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg)，分辨率高，凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用。 PAGE原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。 SDS-PAGE原理 SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。实验使用过程中，还加入DTT或者***，以打开蛋白间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。SDS—PAGE最常采用垂直板不连续系统（分离胶与浓缩胶）。
索引 蛋白电泳（SDS-PAGE）…………………… 电泳试剂总表……………………………………………………制胶……………………………… 上样及电泳…………………… 染色 蛋白提取 蛋白定量 Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明 BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明 Lowry蛋白浓度测定试剂盒使用说明 蛋白分子量标准（图） 考马斯蛋白胶快速染色液 Westernblot WesternblottingDAB检测试剂盒 WesternblottingECL化学发光检测试剂盒
SDS-PAGE电泳注意事项
SDS-PAGE电泳的操作规程 一、样品处理 取适量体积的样品溶液（样品含约为0.5-5ug），加入5×样品缓冲液，用振荡器混匀，于95℃水浴中煮5分钟，并于离心机中12000r/min离心5分钟待上样用，煮完后室温冷却。非还原不用煮。 二、配制凝胶溶液和灌胶 A、预先计算好所需浓度胶的体积及配胶所需要的各种试剂的体积，按这些数据依次加 入试剂并混匀，然后灌入预先装好并且用双蒸水试漏过的板层中（先是分离胶）， 在胶的上面加一小层水饱和的异丁醇，置于平整的桌面让其自然凝固。 B、待分离胶凝固后（以胶与异丁醇界面有折射为准），到掉上层的异丁醇，用双蒸水 冲洗三次并用吸水纸吸干。然后灌入预定浓度的、按步骤A配制的浓缩胶，插入加 样梳（注意赶走气泡），平置于水平桌面，自然凝固。 C、待凝固后，放置1小时使胶充分交联凝固。 三、电泳 1、拔掉梳子，用双蒸水冲洗加样孔，去除杂质及未凝固的胶溶液，然后装好电泳装置， 加入电泳缓冲液（如阴阳极缓冲液不同，需要分别加入相应的缓冲液，另外，阴阳极电泳缓冲液不要混在一起） 2、用20ul的微量加样枪上样。 3、电泳开始时，恒压模式下用80V的电压电泳，待指示剂溴酚蓝进入分离胶时，把 电压提高到130-150V左右，直到溴酚蓝快走出分离胶时，终止电泳，切断电源，拆下凝胶分别切下上、下角标记胶的方向及区别是哪一块胶。 4、清洗胶架、玻璃及其他附件。 四、染色、脱色及结果的分析与保存 1、把剥下的胶浸入染色液中，放在脱色摇床上摇1小时。 2、取出凝胶块，用蒸馏水冲洗干净，然后置于脱色液中脱色，摇荡脱色直到底色基本 脱完。 3、脱完色的胶用凝胶成像系统照相并进行数据分析处理。