小球藻的培养

一、小球藻

小球藻是单细胞植物，种类较多，多数生活在淡水中，少数生活在海洋里。按植物学分类，小球藻属于小球藻纲绿藻目原球藻科生物，其体型小，直径一般为3～5μm，在显微镜下，需要放大400～600倍才能看到，我们肉眼看到的只不过是含有小球藻的绿色的水。小球藻所含的营养成分很高，其蛋白质含量达到50%～60%（相当于花生米的2倍、鸡蛋的5倍），含脂肪10%～30%，还含有多种维生素。小球藻的生物活性物质糖蛋白和多糖体的含量也相当高，这些生物活性物质具有增强人体免疫力、抗癌、降血压、抑制血糖上升、排除体内毒素和迅速恢复机体损伤等功能。因此，小球藻的培养前景广阔。

作为培养原料的小球藻，可以到较清洁的池塘、水坑中采集绿色的水，在显微镜下鉴定，然后再用。也可以向培养它的人索取。

1 容器的准备

小规模的培养可用瓶、缸等，大规模的培养可用水泥池。首先，要对所使用的容器进行消毒，一般用100mg/L的漂白粉水溶液浸泡，再用水冲刷数次。

(100mg/L的漂白粉水溶液的配制：①天平称量5g2%漂白粉澄清液；

②定量转移至容量瓶中；

③加水至1L；

④混匀。

2％漂白粉上清液的配制法：取漂白粉2克，加少量水搅匀，再加水至100毫升，充分调匀后，待澄清后取上清液使用。）

2 培养液的准备

（1）BG11液体培养基配方：

Stock1 定容100mL 柠檬酸柠檬酸铁胺 EDTANa2

Stock2 定容1000mL NaNO3 30g K2HPO4 MgSO4·7H2O

Stock3 定容100mL CaCl2·2H2O

Stock4 定容100mL Na2CO3 2g

Stock5 定容1000mL H3BO3 MnCl2·4H2O ZnSO4·7H2O Na2MnO4·2H2O CuSO4·5H2O Co(NO3)2·6H2O

Stock1 取用2mL Stock2 取用20mL Stock3 取用2mL Stock4 取用1mL Stock5 取用

1mL 总定容 1000mL

（2）购买

2000元/套，九种原液各200ml（稀释1000倍），10瓶。培养基各取1ml。

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3 藻种

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4 接种

选取生活力强、生长旺盛的藻种，在天气晴朗的上午接种。一般情况下，作为第1级培养，可按藻液与培养液1∶2的比例进行接种。接种的量大，可使藻种迅速成为培养液中的

优势种，利用生物间的拮抗作用，减少了污染机会，缩短了小球藻的培养时间。待扩大培养时，可按藻液与培养液1∶4的比例进行接种。

5 管理

搅拌由于小球藻不能游动，只能浮在水中生活，所以必须对培养液进行搅拌，让藻体

不断变换位置，使光照、养料和水温均衡，这样有利于藻体的迅速生长和繁殖。常用的搅拌

工具有玻璃棒、竹棒，每天搅拌3次，每次1分钟。

光照小球藻的培养要有充分的光照，阴雨天光线不足时，可在培养室内用人工光源进

行补充，通常用冷白荧光灯，光照强度为2000～3000Lx；但在光线强烈的夏天，要用遮阳

网等进行适当避光。

温度及pH 温度保持在25～30℃，最适宜生长温度为26℃。pH保持在6～8。

污染的防治在小球藻的培养过程中，要经常观察藻液的颜色是否正常、是否有沉淀和附壁现象、液面是否有菌膜等异常情况。造成藻种污染的多数情况是原生动物及杂藻的生长。如果显微镜下检查有原生动物生活，可用1mg/L的漂白粉灭杀。对付其他杂藻最好的办法是严格控温和经常检查培养液的pH。

6 采收

当小球藻的培养液变成绿色、用显微镜观察1mL。培养液中大约有100个小球藻时，就可以采收或扩大再培养了。采收时，用%～%的明矾粉溶解在培养液里，约1小时后，小球藻沉在了水底，除去上层的水，就能获得小球藻的浓缩液。

二、硅藻

1. 储存液：

(1) 金属液（每升含）

EDTA二钠 - g

氯化铁晶体 - g

五水硫酸铜 - g

七水硫酸锌 - g

六水氯化钴 - g

四水氯化锰 - g

二水钼酸钠 - g

(2) 维生素液（每升含）

VB12 - g

维生素B5盐酸盐 - g

生物素 - g

2. 1L培养基配方：

硝酸钠 - g

二水合磷酸二氢钠 - g

金属液 ml

维生素液 ml

硅酸钠50mg

加水至1L。

硅藻培养温度在22℃，光照照度在3000lux（不要太阳直射）以上。

大量培养中曾出现过杂藻污染问题,主要是浮游的蓝纤维藻及部分栅藻和小球藻。我们利用藻类比重、悬浮习性不同来排除杂藻。发现杂藻时,停止搅拌数小时,使硅藻下沉,蓝纤维藻等悬浮在水中。然后将上清液倾弃,再将沉淀硅藻用蒸馏水反复清洗几次后,加入新鲜培养基,即可获得纯化。

补充：

1．藻种培养设施：藻种的培养要在保种室中进行，保种室要求通风条件好，光线条件好，温度可控性好，保种室要配有空调、冰箱、具有人工光源的培养架等。培养中常用培养仪器有显微镜、解剖镜等，容器有三角烧瓶、广口玻璃瓶等。保种室要严格消毒，防止病菌的侵入。

2．容器、工具的消毒：进行单细胞藻类的纯培养，容器、工具、培养基都要进行严格灭菌，但一般生产性的单种培养，则只须达到消毒目的就可以了。常用的消毒方法有高温消毒法和化学药品消毒法。

高温消毒法是利用高温杀死微生物的方法。不耐高温的容器如塑料和橡胶制品等不能利用高温法消毒。a、直接灼烧消毒接种环、镊子等金属小工具，试管口、瓶口等可以直接在酒精灯火焰上短暂灼烧消毒。载玻片、小刀等则最好先蘸酒精，然后在酒精灯火焰上点燃，等器具上的酒精烧完，也就完成了灭菌操作。

b、煮沸消毒把容器、工具放入锅中，加水煮沸消毒，一般煮沸10-20分钟。大型锥形瓶消毒，可在瓶口上放一普通的玻璃漏斗，再在漏斗上放一称量瓶盖，在锥形瓶内加少量淡水，置电炉上加热煮沸5-10分钟，可使整个瓶壁消毒。消毒完毕即用消毒的纸或消毒的纱布包扎瓶口。此法适合消毒小型的容器工具。

c、烘箱干燥消毒将玻璃容器、金属工具用清水洗干净后，放入烘箱。关闭烘箱门，打开通气孔，接通电源加热。当温度上升到120℃时，关闭通气孔，停止加热。如果进行纯培养，容器必须灭菌，当温度上升到105℃时，关闭通气孔，继续加热至160℃，保持温度，恒温2小时，然后停止加热。必须要等到温度下降到60℃以下，才能打开烘箱门。有棉塞和纸包扎的容器、工具灭菌，不能超过180℃，以免烘焦。

化学药品消毒主要用于生产性大量培养中，大型容器、工具、水泥池等常用化学药剂消毒。a、漂白粉消毒工业用漂白粉一般含有效氯25%~35%，消毒时按万分之1-3的含量配成水溶液，把容器、工具在溶液中浸泡半小时，再用消毒水冲洗3~4次即可。b、酒精消毒酒精消毒常用于中小形容器和工具，方法是用纱布蘸70%酒精在容器、工具的表面涂抹即可。c、高锰酸钾消毒以百分之五的比例配成溶液把要消毒的容器、工具浸泡5分钟，然后取出用消毒水冲洗2~3次，便可达到消毒目的。如果是对玻璃钢水槽、水泥池等消毒，可以用高锰酸钾溶液拨在池壁上，拨洒几遍后刷洗池底，10分钟后再用消毒水冲洗干净。d 石炭酸石炭酸消毒按3%~5%的比例配成消毒液，把要消毒的容器和工具放在其中浸泡半小时，再用消毒水冲洗2~3次。

微藻的培养液是在消毒的海水或淡水中加入各种营养盐配制而成。培养液的配制，首先按配方先后称量各种营养物质，可逐一溶解，也可以同时溶解。遇到难溶的含金属的物质可以加热或与NaEDTA一起溶解，配方中的维生素一般等水温降至60℃后再加。生产上为了方便可以将营养盐配方浓缩1000-2000倍配成母液，使用时可以根据培养水体多少量取母液的体积即可。

3．培养液的制备和消毒：保种培养液的消毒一般采用加热消毒法，经沉淀、过滤的海水，一般加温至90℃左右维持5分钟或达到沸腾即可。由于海水中的一些对藻类生长有促进作用的有机物在高温时易遭破坏，所以加温时间不宜太长。

4．接种：接种就是把作为藻种的藻液接入新配好的培养液中，进行丰富培养。选择无污染、生长旺盛、颜色正常、藻液中无沉淀、细胞无附壁的藻种进行接种。一般来说藻种液和新培养液的比例为1:2。接种的时间最好在上午的8~10时，这个时间是藻类细胞代谢最旺盛的时候。培养条件:保种的条件最好保证在藻种的最适生长条件，要保证藻种不受污染。

5．藻种培养：

温度保持在25 ～30 ℃。pH 保持在6～8 。

6．日常培养管理:1）注意保种室的卫生，定时打扫，谢绝无关人员的进入等；2）外观检查。检查藻液颜

色是否不再浅变浓，或是出现浑浊或沉降等反映藻体生长不正常，处于老化时期受到病虫侵染的现象。3）镜检检查是否发生污染，是否老化，以确保试验的顺利进行。4）控制温度。通过暖气控温装置控制温度，使试验藻细胞在适宜的温度环境中。5）摇瓶。在培养过程中每天摇瓶1-3次,使藻均匀分布。6) 调节光强。保持合适的光强，白天避免阳光直射。

7．藻种保藏方法：存藻种时可以根据保种目的和保种条件的不同分别采取不同的保种方法。1）固体培养基保存法。保种用的固体培养基的营养浓度应比正常的液体培养液的高，一般增加一倍。琼脂量为%。固体培养基分装灭菌后，冷却待用。将无污染的藻种用喷雾法或划线法接种到固体培养基上。常用固体培养基保种方法有两种，一种通常把藻种接种在固体培养基上，在弱光低温条件下慢慢培养保存，接种一次可以保存半年到一年。另一种方法，接种后首先放在光线充足的地方（防止直射光照射），使藻类细胞较快速地繁殖起来，直到培养基上出现颜色，即可放入冰箱或冷库中，一般在5℃左右的低温下保存。每天给藻种几个小时的弱光照。此法保存的时间可长达2至3年。2）液体培养基保存法。低温、弱光下培养。一般两个月更换一次培养液。

淡水小球藻在国内的培养有几十年的历史，因为培养方式简单，生长速度快，被誉为罐装的太阳，一度被大力推广。小球藻是培育淡水轮虫的有效饵料之一。

淡水小球藻的培养，无非几个要素，光照、适宜的温度、营养液。首先说一下光照，一般是大于4500lx，温度以25℃为最佳，在25-30度间都能够很好的生长，每20个小时就能分裂成4个细胞。那么第三个要素是营养液，而营养液无非就是氮源、磷源、碳源及一些微量元素，目前使用较多的营养液配方有BG-11、F/2、SE培养基等，同时强调一点，实验表明，适当补充尿素是促进小球藻生长的一个很好的方式，同时小球藻可以异养，适当添加葡萄糖可以缩短培养时间。

藻种的获得很容易，但是建议用纯种的规范操作的藻种，好的种源是开口的第一步，现在藻种获得可以通过某宝直接搜索小球藻藻种购买，也可以通过向水生所采购，但是那里藻种普遍较贵，差不多1000大洋10ml左右，如果不是科研要求，不建议如此购买，还有就是通过科研院校索要。

首先我们要获得小球藻藻种，这个某宝上有出售，也可以向科研院所购买，这个在此就不详述，一般藻种浓度在百万 -千万个 /ML，接种藻种时，将 200-300ml 的藻种倒入到 1L 培养液中（推荐比例在 1：3-5 之间为宜），在瓶口加多层纱布培养，光照大于 2000-4500 勒克斯，光强可以加大，温度在 25℃-30°为宜。一般我们15 天左右需要继续扩培（如果是育苗急用的话，可以每 L 水中添加尿素，10g/L 的葡萄糖，光照在 4500LX ）。其中的营养液可以是BG11、F/2、SE培养基等