DB21∕T 1957-2012 海水小球藻培养技术规程

B 51

DB21

辽宁省地点标准

DB 21/ T1957—2012

（报批稿）

（本稿完成日期：2011/11/3）

海水小球藻培养技术规程

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2012 –02 –20公布

2012 –03 –20实施

辽宁省质量技术监督局公布

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。

本标准由辽宁省海洋与渔业厅归口。

本标准要紧起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本标准附录A是标准的规范性附录。

本标准首次公布。

海水小球藻培养技术规程

范畴

本标准规定了海水小球藻（Marine Chlorella）培养技术在水产育苗生产和养殖用饵料生物中的术语和定义、海水小球藻培养方式、设施、方法以及水质处理、日常治理和投喂方法等。

本标准适用于海水小球藻培养技术。其它单细胞藻类培养可参照执行。

规范性引用文件

下列文件关于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 11607 渔业水质标准。

NY5052 无公害食品海水养殖用水水质。

NY5071 无公害食品渔用药物使用准则。

术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

指数生长期

细胞迅速生长繁育。在生长条件合适的环境中，细胞体积持续扩大，所含的干物质量增加，达到一定的限度，细胞即分裂产生子细胞。子细胞又生长，分裂，周而复始。细胞以几何级数增加。

单种培养

单种培养是不排除细菌存在条件下的单一藻种的培养。

充气式培养

是在高密度培养时采纳，用充空气的方式补充培养液中的二氧化碳。

开放式培养

容器是放开的一种培养。由于有充足的光照和空气流通，一样来讲藻类的繁育比较快，然而容易被污染。

封闭式培养

是将藻类培养在封闭的玻璃瓶、透亮圆柱形容器、透亮塑料薄膜袋等容器中，容器除了充气管、加液管和藻液抽出管外，不与外界接触。封闭式培养由于污染少，培养的成功率专门高。

一次性培养

指在一定的容器中进行，按照藻类的营养需要加入特定的培养液并接种，当藻类细胞生长繁育达到较高的密度后，一次全部收成或做进一步扩大培养。是单细胞藻类中常用的培养方法。

半连续培养

指当培养的藻细胞达到一定密度时，按照藻类的生长状态和对藻类的需求量收成一部分浓藻液，并补充等量的新培养液连续培养。

连续培养

指在培养容器内持续取出达到一定密度的藻细胞培养液的同时，加入等量新的培养液。培养液的交换量按照藻类的生长情形人为操纵。一样适用于室内封闭式进行，采纳人工光源日光源、自动操纵、充气培养。

设施、设备和条件

培养水质处理及设施

海水处理设施

室外储水池、沉淀池、无阀滤池或沙滤罐、通入室内的输水管道。

保种室

用于储存和培养高浓度海生小球藻种的房间。应配备显微镜、冰箱及其他常用的仪器、工具、试剂、药品等。保种间应装有保温设施和藻种培

养架等。育苗生产和养殖应用单位如有条件可安装空调和人工光源的培养架。室内应清洁卫生，严格消毒，防止细菌侵入。

清洗消毒间

用于清洗和消毒培养容器与器材，分为清洗间与消毒间。配有清洗水槽、恒温烘箱、电炉或炉灶等，用于水、培养基、容器和工具的消毒。生产育苗应用盐酸与水配成1：1～1：5的溶液进行烧瓶等玻璃器皿的清洗（使用后的溶液可连续使用），用电炉或炉灶进行煮沸高温消毒。

扩种培养车间

海水消毒池

用于消毒经沉淀、沙滤处理后的海水。海水消毒池体积与饵料培养池体积比在1：3～5。消毒池设有活动加水管、排污阀和出水阀。出水阀高出饵料培养池表面３０㎝～５０㎝，在添加饵料用的消毒海水时便于自流。

二级培养池

为三级饵料培养提供藻种，二级饵料培养池或水槽容积为0.2m3～1.5 m3。目前在饵料培养中，为减少污染环节，多采纳保种间培养的藻种直截了当进行三级饵料培养生产。

三级培养池

三级饵料培养池，用于提供水产苗种生产及养殖所需要的海水小球藻类饵料培养，三级饵料培养池容积为5m3～20m3。形状以长方形为宜，饵料池深度80㎝～100㎝。

水质条件

水质应符合GB11607和NY5052要求。

藻种提纯和营养液配制

藻种提纯

藻种提纯又称藻种分离。第一采集生长有所需要藻种的水样，通过超滤、离心等方法收集。在显微镜下检查，发觉有所需藻种，可赶忙进行分离。采样的同时测定水样的温度和盐度，供分离、培养时参考。水产育苗和养殖生产所需藻种，也能够向专门生产藻种的保种单位购买。

采样方法

水样可取自天然水域，不管是放开的水面或小港湾都能够采集。在显微镜下检查，若生物量专门少，分离困难时，必须进行预培养，待其生物量增多后再分离。

水样预备培养

用作预备培养的培养液，应使用SWM培养液见表１或ASP2培养液见表２。预备培养的营养盐浓度应低一些，通常为原配方的1/2或1/3。预备培养的容器，通常用250ml容量的三角烧瓶，在瓶中加入100ml培养液，把50ml水样接种到里面去，放在室内较弱光线下培养。培养期间，每天摇动一次容器并观看，当培养液显现淡淡的绿色，进行显微镜检查，海水小球数量占绝对优势时应赶忙进行分离。

藻种分离方法

藻种分离法要紧包括微吸管分离法、平板分离法、水滴分离法和稀释分离法。水产业常用平板分离法。

微吸管分离

用直径0.5㎝、长35㎝的一般玻璃管，在中央部分加热，拉长6㎝～10㎝，使玻璃管的直径缩小至0.06㎝～0.1㎝,把它折断后即成二个吸管。把一团棉絮塞进吸管的宽大一端,然后放入高压灭菌器中消毒，再在酒精灯上加热吸管的细端,用镊子拉成极细的微管,直径缩小至0.008㎝～0.016㎝即可（微吸管在入水的瞬时,因毛细管的作用会吸入微量的水）。将藻液水样放在凹玻片上，在显微镜下用微吸管认真地吸出单个藻体，滴在载玻片上，在显微镜下确认是所要分离的单个藻体后，移入经灭菌的培养液中培养。适于分离个体较大藻种。

平板培养分离

在培养液中加入1%的琼脂粉，加温至90℃坚持5min或达到沸腾即可，将琼脂粉溶化。加热后要加淡水补充蒸发掉的水分。按照微生物学中固体培养基的制作方法倒平板、灭菌。在无菌操作箱中,用接种环蘸取少量藻液,在固体培养基上划蛇形线，藻细胞就会散布在琼脂培养基的表面。用于所含藻种品种较少的水样。水产苗种生产饵料提纯一样采纳此方法。另一种使藻细胞散布在培养基表面的方法是用医用口腔喷雾器，将经稀释的藻液

喷在培养基的表面。将接种好的培养皿放在有适合的光照和温度的地点培养。应通过10～20d的培养就会在培养基上长出独立的藻落。通过显微镜检查,找出所要的纯的藻落，再用已消毒的接种针从培养基上挑取藻体，移入经灭菌的培养液中培养。

水滴分离

先将欲分离的藻液稀释，用微吸管将少量藻液吸出，滴在载玻片上，每张载玻片上能够滴数滴。水滴大小以在低倍显微镜下一个视野能包括整个水滴为准。在显微镜下逐个观看水样，选择水滴中只有所要分离的单个藻体，无其他生物混杂，经灭菌的培养液中培养。适用于培养液中占优势的藻种分离。

稀释分离

消毒的试管5支，在第一支试管中加蒸馏水10ml，第二至第五支试管各加蒸馏水5ml，用高压蒸汽消毒，待冷却后，在第一支试管中滴入混合藻液1滴，充分震荡,使其平均稀释。再用经消毒的吸管从第一支吸管中吸取5ml到第二支吸管中，充分震荡后再取5ml到第三支试管中，如此直至第五个试管。再取5个已装有消毒的培养基的培养皿，加热使培养基熔化,待冷却而尚未凝固时，分别滴入5个试管中的藻液各1滴，用力震荡,使藻液充分混入培养基中。在适合的条件下，培养基中显现藻落。藻落和细菌群落会充分分离，在无菌条件下将选取单个藻落接种到固体培养基的表面，再培养。重复数次，直至得到纯的藻落。

培养液配制

预备培养液

使用海水小球藻SWM培养液配方,见表1和表2。

表1 海水小球藻SWM培养液配方

表2 海水小球藻SWM培养液A5配方

续表2

保种室用培养液配制

使用康威液营养盐标准溶液，见表3。表3 康威试验站营养盐标准溶液配方

二、三级饵料培养液

使用《常用小球藻培养液配方》配制培养液见表4。

表4 常用海水小球藻培养液配方

储存与培养

低温储存

条件

分离后的海生小球藻种,采纳可控温度、光照培养箱,温度应操纵在4℃～8℃，光照强度应操纵在50lx～300lx,静止。

要求

用试管或150ml～250ml三角烧瓶储存.储存3管（瓶）以上。

常温储存

条件

采纳恒温光照培养箱培养。控温在18℃～22℃,光照强度为2000l x～3000lx。

要求

培养容器为500ml～3000ml三角烧瓶.每天摇瓶2～3次。封闭式培养（水产育苗培养海水小球藻种可在保种室培养架上培养）。

培养

工具消毒

高温消毒

采纳高温杀死微生物，不耐高温的容器如塑料和橡胶制品等不应采纳此方法。直截了当灼烧灭菌接种环、镊子等金属小工具，试管口、

瓶口等能够直截了当在酒精灯火焰上灼烧灭菌。载玻片、小刀等则应先蘸酒精，然后在酒精灯火焰上点燃。

煮沸消毒

把容器、工具放入锅中，加水煮沸消毒，煮沸5～10min。大型锥形瓶消毒，应在瓶口上放一一般的玻璃漏斗，再在漏斗上放一称量瓶盖，在锥形瓶内加少量淡水，置电炉上加热煮沸5～10min，可使整个瓶壁消毒。消毒完毕即用消毒的纸或消毒的纱布包扎瓶口。此法适合消毒小型的容器工具。在水中加1%的碳酸钠成效更好。

烘箱干燥消毒

将玻璃容器、金属工具用清水洗洁净后，放入烘箱。关闭烘箱门，打开箱顶上的通气孔，接通电源加热。当温度上升到120℃时，关闭通气孔，停止加热。进行纯培养，容器必须灭菌，当温度上升到105℃时，关闭通气孔，连续加热至160℃，保持温度，恒温2h，停止加热。必须要等到温度下降到60℃以下，才能打开烘箱门。

化学药品消毒

在苗种和养殖生产中大量培养海生小球藻时,大型容器、工具、水泥池常用化学药品消毒。化学药品应符合NY5071 无公害食品渔用药物使用准则要求。

酒精（C2H5OH）消毒

能使蛋白质凝固而起杀菌作用。浓度为70%时，酒精的杀菌能力最强。酒精消毒常用于中小形容器和工具，方法是用纱布蘸酒精在容器、工具的表面涂抹，几分钟后用消毒水冲洗。

高锰酸钾（KMnO4）消毒

高锰酸钾溶液要现用现配。消毒时将容器、工具等浸泡在新配的3 00×10－6g/ml浓度的高锰酸钾溶液中5min，然后取出用消毒水冲洗2～3次。如果是对玻璃钢水槽、水泥池等消毒，能够用0.05%浓度的高锰酸钾溶液泼在池壁上，泼洒几遍后刷洗池底，10min后再用消毒水冲洗洁净。

盐酸（HCl）消毒

取工业盐酸1份，加淡水9份，配成10%的盐酸溶液。容器、工具放入盐酸溶液中浸泡5min，取出用消毒水冲洗2次。

漂白粉（Ca（ClO）2）消毒

工业上用的漂白粉一样含有效氯28%～30%，消毒时配成含有效氯为0.02%～0.04%的溶液，把容器、工具在溶液中浸泡半小时再用消毒水冲洗3～4次即可。

海水消毒

加热消毒法

经沉淀、过滤的海水，加温至90℃左右坚持5min或达到沸腾即可。由于海水中的一些对藻类生长有促进作用的有机物在高温时易遭破坏，因此加温时刻不宜太长。

过滤除菌法

把经沉淀的海水先经砂滤，把大型生物和非生物杂质去除，再用陶瓷过滤罐过滤，除去微小生物。

次氯酸钠（NaOCl）消毒

按每立方米海水20mg有效氯的量加入次氯酸钠溶液，充气10mi n后停气，经6h～7h消毒后，按每立方米水体25g的量加入硫代硫酸钠（N a2S2O3），强充气4～6h，用淀粉碘化钾溶液（100ml蒸馏水加2g碘化钾和1g淀粉）测试，若无余氯即可使用。

紫外线消毒

有成型的紫外线消毒器可供选用。但此法不易杀灭较大的浮游动物。最好和过滤法结合使用。

一级培养

条件

温度10℃～36℃，最适温度25℃左右,结合控温设施调控所需温度。用窗帘结合人工光源调控所需光照，pH6-8。

要求

5000ml～10000ml三角烧瓶或其他容器,每天摇瓶2～3次,培养液用康威试验站营养盐标准溶液，1000ml海水加1ml标准液。也可用其它小球藻培养液。按照自身保种条件而定。适时加入配制好的培养液。采纳封闭式单种培养.

二级培养

条件

温度，按海水小球藻种要求调控室温。光照采纳自然光照结合人工光源，按小球藻适宜光照要求，用调光帘调剂光照度。

要求

培养容器为0.2m3～1.5 m3水泥池或白色塑料水槽。培养液用海水，采纳次氯酸钠消毒法或高温消毒法处理。培养期采纳搅拌耙搅动藻液，每天2～3次。

接种

接种时刻为上午8～10时，天气状况为晴天。

营养盐添加

使用《常用小球藻培养液配方》配制培养液，见附表3。

培养方式

开放式，一次性培养或半连续培养。

三级培养

培养条件

温度按藻种要求调控培养室温。光照为自然光照结合人工光源，按藻种适宜光照要求，用调光帘调剂光照度。通气用气泵供应量按培养容器的1%提供。供给气体需经空气过滤器过滤后，接入培养容器底部，保持培养藻液平均悬浮，或用搅拌耙每天搅动藻液2～3次。

要求

三级培养池或其他容器为5m3～20 m3。培养池或容器在接种前应进行消毒处理，采纳次氯酸钠或漂白粉进行消毒，再用消毒水冲洗后，将未经中和的次氯酸钠消毒海水，从消毒池放入三级培养池内，接种前1h～2

h进行中和。用淀粉碘化钾溶液（200ml蒸馏水，碘化钾2g，淀粉1g）检测无余氯后，方可进行海水小球藻接种。

接种

把选为海水小球藻种的藻液接入三级培养池的培养液中，要保证藻种的质量和数量，选取无敌害生物污染、生活力强、生长旺盛的藻种。外观藻液颜色正常、无大量沉淀和明显附壁现象。加入藻种与培养液的比例为1:10～1:20。

接种时刻

接种时刻:上午8～10时。小球藻细胞在水层中分布平均，接种温差不大，光照适合，接种时刻可放宽。

营养盐添加

使用《常用小球藻培养液配方》配制培养液，见附表3。

培养方式

开放式，一次性培养或半连续培养。

日常治理

观看与处理

海水小球藻种培养期间，注意观看藻液出现的颜色，是否有无附壁、沉淀、菌膜和敌害生物现象，如发觉专门，赶忙取出、去除，及时接种培养补充空缺的藻种。

显微镜检查

除了日常观看外，还要进行显微镜检查，从藻细胞的形状、悬浮、污染情形等，了解细胞生长是否正常。即检查如下：检查细胞增殖情形、计数。计数方法见附录A。检查被污染情形。藻种取样时，无菌操作。

记录

对每次检查、接种和营养盐添加以及日常操作和观看结果进行记录。

搅拌和充气

在二、三级藻培养时,搅拌或充气使空气中的二氧化碳溶解到培养液中，促进藻类细胞的光合作用，使沉底的细胞上浮获得光照，每天搅拌2～3次。生产培养其充气成效更好。

调解光照

在保种室和二、三级培养中，按照海水小球藻的适宜光照范畴进行调剂。

温度操纵

海水小球藻培期间，利用控温设施，将室温调控至其生长的适宜温度范畴。

pH值调解

当pH值超出适宜范内，能够用1个当量浓度的盐酸溶液或氢氧化钠溶液来调解培养液的pH值。

预防污染

在海水小球藻培养期间，定期进行室内消毒，严格禁止非饵料培养人员进入培养室，按照饵料培养操作规程或制度操作。

收成

投喂

海水小球藻经各培养时期，最终达到苗种及养殖生产单位所要求的藻种浓度和质量，投喂的藻种时期以海水小球藻的指数生长期为宜，浓度（藻种密度）不低于500×104cell/ml。

储存

培养出来的海水小球藻液临时不能投喂时，通过离心、浓缩设备（有离心、浓缩条件的）制成小球藻膏,放入冷冻间，冷冻储存。冷冻温度不低于零下18℃，以备随时投喂使用。

（规范性附录）

海生小球藻类细胞计数方法

器材

医用血球计数板一个，计数器一个，载玻片、盖玻片若干，微细管一只，光学显微镜一台。

操作

医用血球计数板及盖玻片清洁、控干，平放桌上，盖好盖玻片。

待测海生小球藻液样品摇匀，赶忙用一支洁净的微吸管吸取样品，快速把吸管口放于盖玻片边缘，使藻液流入盖玻片内，并覆盖满划线方格及其周围。

稍停1min，显微镜下计数。

计数

医用血球计数板上计数区的划线方格有大格、中格、小格之分，只计数分布于中间的25个中格的海生小球藻细胞数，计数2～3次，取平均数。藻细胞密度（104/ml）=25个中格的海生小球藻细胞数的总和。

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