如何用photoshop计算蛋白条带的灰度值
如何用photoshop计算蛋白条带的灰度值？
在western blot或者DNA电泳条带中，经常需要半定量统计条带的灰度值，比较常用的是用ImageJ这个软件来统计，但是如果不熟悉操作很容易得出错误的统计数据。本文从原理到操作告诉你如何用photoshop来统计灰度值首先进行实际操作之前我们先来理解下什么叫做灰度值
如上图所示，灰度值就是从黑到白渐变过程中对应的数值。0代表黑色，255代表白色。
上图所示正常western blot条带和反向之后的条带。上图的箭头分别指出了条带以及背景对应的区域。在正常条带中条带的值约为20，背景值为80；在反向图片中，条带的值约为200，背景值为130。我们习惯了条带越粗亮灰度值越大，因此我们一般是对其进行反向之后测量。
在这里一定要去掉背景，至于为什么要去掉背景，在此不多说了（视频教程里将详细介绍）请看下面图片：那么接下来开始我们今天的教程：打开图片，因为图片有点倾斜，我们需要将其摆正，有两种方法进行拉直，第一种是将图层旋转(Ctrl+T，然后旋转至其摆正)，另外一种是使用标尺工具，在左边快捷栏中安卓吸管工具不放，选择标识工具，然后在条带上面从左边点按住鼠标不放一直拖动到最右边，最后点击拉直图层即可。点击菜单栏的“窗口”，选择直方图，弹出下
面面板
用ImageJ对Western DNA和Blot图片灰度分析
用ImageJ对W estern Blot图片灰度分析 教程收集于互联网来源中生网 The good news is that even if you don't have access t o a photo editing program such as Photoshop, you can now do all the same analyses using free programs. My favorite option is the freely available ImageJ from the National Institut es of Health. The homepage for ImageJ is here: https://www.360docs.net/doc/3713761016.html,/ij/index.html wherein you can find links t o the download, document ation, additional plugins and so on. Once ImageJ is inst alled, open it up and open your scanned film file. We'll start the ImageJ section by duplicating the method outlined above for Phot oshop. 1. Open your file. 2. Under Image>Type click on 8-bit t o convert the image to grayscale. 3. Go to the menu Process>Subt ract Background. Try a rolling ball radius of 50. This removes some of the background coloration from your image. 4. Go to Analyze>Set Measurements, and click the boxes for Area, Mean Gray Value, and Int egrated D ensit y. 5. Go to Analyze>Set Scale, and ent er "pixels" in the box next t o Unit of length. 6. Go to Edit>Invert (or hit Ct rl+Shift+I) t o invert the colors on the image. Now the dark areas are light, and the light areas are dark. As outlined above, this has the benefit of making the measured values for bands increase with increasing prot ein expression. 7. Choose the F reehand Selection tool from the t ool palette. 8. Draw a line around the boundary of your first band. As above, you need to use your own judgement about
CASIO第一缓和曲线道路中边桩编程和计算
实验四 第一缓和曲线道路中边桩编程和计算 一、实验目的 1、掌握第一缓和曲线型道路的数学模型及其计算过程 2、学习和掌握用CASIO Fx-4850计算器编写计算缓和曲线型道路中边桩的计算。 二、实验原理 （一）、第一缓和曲线型道路数学模型 1、数学模型 已知点1-i JD 和i JD 的测量坐标，转角i I ，设计半径R ，缓和曲线长S l ，以及点i JD 和P 的里程，要求的P 的测量坐标。 由两已知点可以算的直线的方位角i α， )( tan 1 1 1-----=i i i i i X X Y Y α （4—1） 1 +i 1.4图示意图 右偏曲线第一缓和曲线
由切线长1T 和i JD 的坐标即可算出ZH 的坐标， ) 180sin()180cos(11++=++=i i ZY i i ZY T Y Y T X X αα （4—2） 建立独立坐标系''ZHy x 。我们已经知道，缓和曲线上任意相对原点ZH 曲线长为P l 一点P 在独立坐标系''ZHy x 中的坐标， -+-= -+ - =5 511 337 3 '449 225 '422403366345640S P S P S P P S P S P P P l R l l R l Rl l Y l R l l R l l X （4—3） 在由已求得的ZH 和i α，通过坐标平移旋转，即可求得P 的测量坐标， ZH i P i P P ZH i P i P P Y Y X Y X Y X X ++=+-=ααααcos sin sin cos '' '' （4—4） P I 我们也可求得， π 180 2?= S P P Rl l I 由P I 和i α求得曲线在点P 处的切线的方位角，再由切线的方位角，求得边桩的方位角，如已知边桩距，就可用式（4—2）求得边桩的坐标。 2、计算步骤 （1）输入已知数据：i i i i i i i R I L Y X Y X ,,,,,,11--。 （2）坐标反算i α：J Y Y X X Pol i i i i i =----α),,(11 （3）坐标正算ZH ZH Y X ,： ①计算整个缓和曲线长902÷=÷=πR I R A L i S （在独立坐标系y x ZH ''-中） ②利用整个缓和曲线长计算HY 点坐标 563424 523422403366345640R L R L R L Y R L R L L X S S S HY S S S HY ÷÷+÷÷-÷÷='÷÷+÷÷-=' ③利用HY 点坐标计算缓和曲线切线长
用imagej进行WB定量分析
ImagJ是一款简单的图像处理与分析软件，可以用来进行WB定量分析。 一、利用ImagJ对WB条带进行灰度分析 1、File——》open 打开WB片子 2、把图片转化成灰度图片 image——》type——》8-bit 3、消除背景影响 process——》subtract background 选择50基本可以 4、设置定量参数 analyze——》set measurements，点击面积，平均密度和灰度值及Integrated Density 5、设置单位 analyze——》set scale ，在“unit of length”的方框里输入“pixels” 6、把图片转换成亮带，Edit——》invert 7、选择Freehand Selection，尽量把条带圈起来，点击键盘m，出来IntDen灰度值 当测定完所有条带，选结果中的“Edit ”的“SelectAll”，然后复制数据“IntDen”到Excel表即可进行分析 8、复制数据IntDen进行分析 二、利用ImagJ对WB条带进行密度分析 1、File——》open 打开WB片子 2、如条带不正，需修正 image——》transform——》rotate 调节angle值，直到条带水平为止 3、选中矩形选项，圈中第一个条带，然后analyze——》gels——》select first lane（快捷键ctrl+1），然后移动第一个条带上的矩形到第二个条带上，analyze——》gels——》select second lane（快捷键ctrl+2），最后analyze——》gels——》plotlanes 4、选中直线工具，将开口的波峰关闭 5、选中魔棒工具，点击波峰可以显示波峰下面积，即条带的密度值 6、以第一个数值为基数，其他数值与第一个数值的比值为相对密度 The protocol of imageJ for quantitative analysis of Western blotting: - open an image - transfer the image to 8-bits image → type: 8 bits - Process → substract background 50 - analyze → set measurements: pick area, mean gray value, integrated density. - analyze → set scale, fill “unit of length” with “pixels” - switch the image to bright bands edit → invert - freehand selection, choose the target area on the im age (e.g. a band), type a “m” for measurement, then we get the result from a new window. - after measuring all of the bands, pick the “edit” of the result window. “select all”, copy the integrated density values to excel to analyze.
道路中边桩的计算程序
道路中边桩的计算程序 【摘要】本文通过介绍南通市开发区七号路工程中边桩计算的原理，编写一套实用的中边桩计算程序 Abstract: The article compiles a practical calculation programme by the introduction of the middle and side piles in the projects in No 7 road development area in Nan tong city. 【关键词】放样计算数学模型 Key Words: Layout, calculation, mathematics modeling 引言 我公司承建了南通市开发区七号路的道路、桥梁、雨污水的建设工程。本人担任项目的工程测量工作，七号路总长4.6Km，与老路交叉改造段长0.9Km。七号路距与老路交叉口20米处有一条通运输船的大河，设计有一座桥梁。设计老路交叉改造段加高三米，与七号路形成平面交叉口，道路拐弯弧度有大有小，形成斜坡，设计采用石驳加固。真实的开挖和坡脚桩长需在放样时根据实地高程作一些调整。设计图只提供了道路曲线元素表，交点、起终点的坐标，直、圆曲线的中边桩坐标的手工计算量特别大，因此，编写了一套中边桩的计算程序。 道路中边桩计算的原理 根据设计提供的曲线元素表，虚拟其道路设计线型，然后根据所输入的任意一点里程桩及左右边桩坐标。 2.1 直线上的中边桩坐标计算 根据直线的起终点坐标计算其方位角a，根据输入的直线上里程桩，求取相对于直线起点的距离L（I）,根据下列公式求取中桩坐标： X（I）= X0 + L（I）* cos a（1） Y（I）= Y0 + L（I）* sin a（2） 其中（X0、Y0）为直线起点坐标，X（I）、Y（I）为任意一点坐标。 直线段左右边桩计算公式如下： X（I）左= X（I）+ S左* cos（a + 3*л/2）（3）
westernblotting蛋白质印迹实验的流程
实用标准文案 细胞总蛋白的提取 （1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。 （2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。 （3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。 （4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。 2. BCA法测定蛋白质浓度 （1）配制工作液 根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。 （2）配制标准品 取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第
一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，精彩文档．实用标准文案 按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。 （3）稀释待测样品 取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔； （4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。 （5）将96孔板取出后用酶标仪测定OD570nm值。 （6）根据标准品的OD570nm值绘制标准曲线，并根据标准曲线计算得到待测样品的蛋白质浓度。 蛋白质变性 （1）根据预计将要上样的蛋白质样品质量（25μg-50μgμg，是蛋白质而定），取适量体积的蛋白质样品于预冷的EP管中，加入5×SDS上样缓冲液（体积约为蛋白质样品体积的25%），通过调节上样缓冲液的体积将各样品混合液的终体积调节至相仿。用封口膜将离心管封口，7000r/min离心点离样品混合液3s，使其混合均匀。 （2）将放置样品混合液的架子置于盛有适量dd H2O的磁盘中，用电磁炉加温至100℃，煮沸5min。点离样品，使其混合均匀。
WB灰度值测定
Image J测到了WB条带灰度值关于用Image J量化westernblot条带灰度值，在网上一直盛传着两种操作方法，然鹅～小伙伴们却一直不确定到底哪种才是正确的测量灰度方法，甚至将灰度与光密度弄混淆。今天咱们一起就这个机会学习下，请先看看你是用以下那种方法测量灰度值？以下是两种方法的具体操作。 方法一:1、打开Image J软件→左上角file→Open 选择自己的条带图片(事先把条带摆正)2、把图片转化成灰度图片：Image→type→8-bit 3、第一个矩形工具→选上所有条带 4、analyze→Gels→select first lane→Gels→plot lanes（在这第四步也可以分开选取，如：框选第一个条带→analyze→Gels→select firstlane→将第一个框拖移到余下条带→Gels→select nextlane） 5、选中直线工具，将开口波峰关闭
6、选中魔棒工具（正数第七个），点击波峰，就得出所有area值。 方法二 1、打开Image J软件→左上角file→Open 选择自己的条带图片(事先条带弄正) 2、把图片转化成灰度图片：Image→type→8-bit 3、扣除背景：Process→Subtract Background→50pixels 并勾选Light Background 5、设定参数：Analyze→set measurement→勾选Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density 6、Analyze→set scale→unit of length选项里改为pixels，确定
道路中边桩坐标计算教案资料
道路中边桩坐标计算 道路工程放样的主要工作包括：线路中线放样、路基施工放样、路面施工测量等内容。而线路线路中线是由直线与曲线组成的，直线的测设相对容易，故曲线测设是工程建筑物放样的重要组成部分之一。就线路而言，由于受地形、地物及社会经济发展的要求限制，线路总是不断从一个方向转到另一个方向。这时，为了使车辆平稳、安全地运行，必须使用曲线连接。这种在平面内连接不同线路方向的曲线，称为平面曲线，简称平曲线。 平面曲线按其半径的不同分为圆曲线和缓和曲线。圆曲线上任意一点的曲率半径处处相等。缓和曲线是在直线与圆曲线，圆曲线与圆曲线之前设置的曲率半径连续渐变的一段过渡曲线；缓和曲线上任意一点曲率半径处处在变化。当缓和曲线作为直线与圆曲线之间的介曲线时，其半径变化范围自无穷大至圆曲线半径R，若用以连接半径为R1和R2的圆曲线时，缓和曲线的半径便自R1向R2过渡。 按曲线的连接方式不同，可分为： a、单圆曲线，亦称为单曲线，即具有单一半径的曲线 b、复曲线，由两个或两个以上的单曲线连接而成的曲线 c、反向曲线，由两个不同方向的曲线连接而成的曲线 d、回头曲线，由于山区线路工程展现需要，其转向角接近或超过180度的曲线 e、螺旋线，线路转向角达360度曲线 f、竖曲线，连接不同坡度的曲线，竖曲线有凹形和凸形两种，顶点在曲线之上的为凸形竖曲线，反之为凹形竖曲线。 2.2 平面曲线放样数据计算基本公式
2.2.1 缓和曲线基本公式 1、缓和曲线具有的特征是曲线上任意点的曲率半径与该点至起点的曲线长成反比。如图2.1所示，设缓和曲线上任一点P 的半径为ρ，该点至起点的曲线长为l ，则回旋线的基本公式为： h L R l A l A l C ?=?== =ρρ22 （2-1） 式中，2 A 为常数，ρ为缓和曲线参数，表示缓和曲线半径的变化率。 图 2.1 带缓和曲线的圆曲线 2、切线角公式，如图2.1所示，可知切线角公式为： ?????? ?? ?? ? ? ??==?===)(1802)(2)(1802)(2200 000022 2πββπββR L rad R L RL l rad RL l C l S S S S （2-2）
后缓和曲线上任意点中、边桩坐标计算实例
曲线上任意一点中、边桩坐标计算实例 一、 平面图 JD1 JD2 二、 已知JD 1、X 1=50151，Y 1=52616；JD 2、X 2=50186，Y 2=52374；JD 3、X 3=50470， Y 3=52414；JD 2的半径R=95.78m,L 1=110, L 2=100,K JD2=K23+389.92，求后缓和曲线上K23+400的中桩坐标及左右各20米的边桩坐标。 步骤1、根据三个交点的坐标、求JD 2的转向角α。 ○ 1、JD 1→JD 2的方位角：1-2α=tg 1-2α=2121--Y Y X X =52374-5261650186-50151=-242 35 =-6.9143= 278-13-46 ○ 2、JD 2→JD 3的方位角：2-3α=tg 2-3α=3232--Y Y X X =52414-52374 50470-50186
= 40 284 = 8-01-01 ○ 3、JD 2的转向角α=（8-01-01.54）-（278-13-46.26）+360=89-47-15 步骤2、计算p 、m 、T 、 L 。 ○1、1P =2124L R =21102495.78 ?=5.264 2P =2224L R =2 1002495.78 ?=4.350 ○2、2m =3222 2240L L R -=3 2100100224095.78-?=49.546 ○3、2T =2m +(R +2P )2 tg α + 12 sin p p α -=49.546+(95.78+4.350)×8947152 tg --+ 5.264 4.350sin894715.28---=150.219 ○4、L =(L 1+L 2)÷2+180 n R π= （110+100）÷2+(894715) 3.1495.78 180 --??=255.096 步骤3、计算HZ 、YH 的里程。 ○ 1、HZ= ZH+L=K23+235.769+255.096=K23+490.865 ○ 2、YH= ZH+L-L 2=K23+235.769+255.096-100=K23+390.865 步骤4、计算K23+400的中桩坐标及左右20米边桩坐标。 (1) HZ 点的坐标计算步骤： ○ 1、JD 2→HZ 的方位角：23α-=8-01-01 ○ 2、距离D=T 2=150.219 ○ 3、HZ 点的坐标：HZ X =2JD X +232T COS α-? =50186+150.219×cos(8-01-01)
两分钟学习凝胶分析软件BandScan
两分钟学习凝胶分析软件BandScan（Step by step ） 转载请注明来自丁香园 发布日期: 2005-07-02 12:14 文章作者: palmyard 文章编辑: admin Step by step to BandScan >>By Palmyard. 按：现在有很多常用的分子生物学软件，但对于初学者，尤其是不太擅长计算机者，使用起来有相当难度。琢磨说明书，或者自己一点点试验，难免觉得头绪纷繁，乃至兴味索然。后来我发现，其实用一个实例，从头到尾示范一遍，可以在几分钟内直观地学会这个软件的基本使用方法。其他的一些情况就可以自己去摸索了，这样学起来很快。因此我打算做一个常用分子生物学软件STEP BY STEP的系列。这个想法在心里很久了，但是一直没有时间付诸实践，的确是因为没有较为空闲的时间。今天就从BandScan这个软件开始。由于不是很熟悉制作过程，奋战一整天，终于完成了第一个实例学习。 BandScan是一个很常用的凝胶图像分析软件，我们用它重要是为了分析蛋白表达量。现在，我就以我自己表达的一个蛋白图，来示范这个软件分析的过程。最后结果是得到目的蛋白占总蛋白的百分数。 1.安装软件BandScan5.0。主程序可以在网上找到（请搜索以往的帖子或用google搜索BandScan_dl.exe）。安装以后加个补丁（如果找不到补丁可以email我zhuzhang@https://www.360docs.net/doc/3713761016.html,，这有4.3、4.5和5.0的补丁，请尽量自己先找一下）。 2.安装好以后就会在桌面上出现BandScan的图标。双击打开。 3.打开后的界面如图。
.打开一张扫描好的电泳图。BandScan可以识别TIF和JPG格式的图片，很方便。打开工具栏上的file/open tiff，jpg file format，选中待分析的图片。
分析测量图象软件Imagepro(DOC)
分析测量图象软件Imagepro-Plus教程 一、入门 Imageproplus（IPP）的主要用途是分析测量图象。本人使用该程序进行生物图象分析有一段时间，写此帖的主要目的还是与大家交流使用心得，并总结一下使用方法。 如果你是刚接触IPP，最好先从本帖看起，并同时打开你电脑上的IPP程序照着操作。学会一个软件需要花一段时间的，两分钟不可能学会。两小时也太短。但我相信，照着我这几个帖子作下来，至少是可以用IPP干一点事情了。 打开IPP后的界面是这样的，该从何处下手呢？
既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛 这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的的“量”。对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。 所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，这部分区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI（area of interest）。AOI是IPP中最有用最重要的概念。如何能够准确地选取AOI就是使用IPP的关键操作。一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。 对不同的图片，需灵活地使用各种适当的AOI工具，就这张图片来说，AOI是黄色区域，因此用颜色分类的AOI工具是最有效的。 点击measure---count/size,弹出分类测量窗口
在窗口中选中manual，再点击select color，弹出颜色选择窗口segmentation，这个工具是IPP最有特色的颜色选取工具之一。用好这个工具是使用IPP的要点。
公路缓和曲线段原理及缓和曲线计算公式
程序使用说明 Fx9750、9860系列 程序包含内容介绍:程序共有24个，分别是： 1、0XZJSCX 2、1QXJSFY 3、2GCJSFY 4、3ZDJSFY 5、4ZDGCJS 6、5SPJSFY 7、5ZDSPFY 8、5ZXSPFY 9、6ZPJSFY 10、7ZBZFS 11、8JLHFJH 12、9DBXMJJS 13、9DXPCJS 14、9SZPCJS 15、GC-PQX 16、GC-SQX 17、PQX-FS 18、PQX-ZS 19、 ZD-FS 20、ZD-PQX 21、ZD-SQX 22、ZD-ZS 23、ZDSP-SJK 24、ZXSP-SJK 其中，程序2-14为主程序，程序15-24为子程序。每个主程序都可以单独运算并得到结果，子程序不能单独运行，它是配合主程序运行所必需的程序。刷坡数据库未采用串列，因为知道了窍门，数据库看起很多，其实很少。 程序1为调度2-8程序； 程序2为交点法主线路(含不对称曲线)中边桩坐标正反计算及极坐标放样程序； 程序3为主线路中边桩高程计算及路基抄平程序； 程序4为线元法匝道中边桩坐标正反计算及极坐标放样程序； 程序5为匝道线路中边桩高程计算及路基抄平程序； 程序6为任意线型开口线及填筑边线计算放样程序； 程序7专为主线路开口线及填筑边线计算放样程序，只需测量任意一点三维数据，即可马上计算出该点相对于中桩法线上的偏移量； 程序8专为匝道线路开口线及填筑边线计算放样程序，只需测量任意一点三维数据，即可马上计算出该点相对于中桩法线上的偏移量； 程序9为桥台锥坡计算放样程序； 程序10为计算两点间的坐标正反算程序； 程序11为距离后方交会计算测站坐标程序；
westen blot 免疫蛋白印迹实验步骤
Western blot 实验步骤 ——2018.8.8 一、样品及溶液准备 1、匀浆器：上海净信科技有限公司 线虫蛋白提取：5000条线虫加300μL western及IP裂解液（10:1加入PMSF），研磨三次，（设置：研磨45s停止30s），提取蛋白量约1500-2500mg/ml。 2、溶液 ①5*电泳液：Tris-base(三甲基氨基甲烷)15.1g，甘氨酸72g，SDS 5g，加水至1L，室温保存，使用时稀释10倍。（稀释5倍，BIO-RAD电泳仪器不能维持恒压，marker很难跑全条带）。 ②5*Transfer buffer ：Tris-base 15.1g，甘氨酸72g，加800mL，使用时，稀释4倍，每800mL加200mL甲醇（就是用的时候，取200mL 5X溶液，稀释成800mL，再加200mL甲醇就可以用了）。 ③5* TBS buffer：NaCl 40g，KCl 1g，Tris base 15g，溶于750mL水，浓HCl 调整PH7.4，加水至1L。使用时稀释5倍。 ④TBST：500ml TBS中加入1mL Tween20 ⑤5%封闭液：10g脱脂奶粉加入200mLTBST。 二，电泳 (一) 制胶 不同蛋白质分子量适宜使用的分离胶浓度范围如下： 1.0mm胶一般需要5ml分离胶溶液，1.5mm一般需要7ml分离胶溶液
（加入TEMED后容易凝固，可以加大量2-3倍，以加速凝固） 加入到玻璃板之间距离上缘1cm处，水封闭上层液体，达到除气泡和压胶目的。肉眼确定水和分离胶之间出现明显的分离后，确定分离胶已完全凝结，倒掉水，并用滤纸吸掉残留在分离胶上的溶液。 将配制好的浓缩胶加到分离胶上层，加满，插入梳子。 待胶干后，保鲜膜包好（保留梳子）。胶可提前一天制好，室温放置以便充分交联，也可现用现制。 (二）电泳 1，BCA测定的蛋白浓度，并定量到同一浓度后，5*SDS loading buffer按1:5加入到样品中，100℃加热10min 蛋白变性，12000rpm离心1min 取上清。（可以将样品全部变性后-80℃保存，更方便使用） 2，将制好的胶板,固定于电泳仪器中，并倒入0.5* Running buffer直至浸没整个胶版(内层高于外层)，在电泳缓冲液的浸润下慢慢拔去插槽，形成上样孔。 拔出梳子，marker 5ul/孔，样品一般20ul/孔（最大容纳量35u），浓缩胶60 V（约
缓和曲线计算原理
1.2道路线形的基本介绍 道路运输在整个国民经济生活中起着重要作用。道路的新建和改建，测量工作必须先行，所以公路施工测量所承担的任务也是非常大的，为了更好的进行道路施工工作，下面就道路线形进行一下简单的介绍。 一般所说的路线，是指道路中线的空间位置。中线在水平面上的投影称作路线的平面；沿中线竖直剖切再行展开则是路线的纵断面；中线上任一点法向切面是道路在该点的横断面。 无论是铁路、公路还是地铁隧道和轻轨，由于受到地形、地物、地质及其他因素的限制，经常要改变线路前进的方向。当线路方向改变时，在转向处需用曲线将两直线连接起来。因此，线路工程总是由直线和曲线所组成。曲线按其线形可分为：圆曲线、缓和曲线、复曲线和竖曲线等。 公路中线应满足的几何条件是：线形连续平滑；线形曲率连续（中线上任一点不出现两个曲率值）；线形曲率变化率连续（中线上任一点不出现两个曲率变化值）。考虑上述几何条件，顾及计算与敷设方便，现代公路平面线形要素由直线、圆曲线和缓和曲线构成，称之为平面线形三要素。其中缓和曲线的曲率半径是从∞逐渐变到圆曲线半径R的变量。在与直线连接处半径为∞，与圆曲线连接处半径为R，曲线上任一点的曲率半径与该点至起点的曲线长成反比。 目前公路线形设计已开始使用非对称线形（成为非对称平曲线）设计，特别是在互通立交匝道和山区高速高速公路线形设计中，这种线形设计使用得较多。非对称线形分为完全非对称线形和非对称非完整线形两种，所谓“完全非对称曲线”的含义就是第一缓和曲线和第二缓和曲线起点处（ZH或HZ）的半径为∞，圆半径为R，第一缓和曲线
长1s l ，第二缓和曲线长为2s l ，12s s l l ≠。所谓“非完整”的含义是第一缓和曲线和第二缓和曲线的半径不是∞，而是1 R 、2 R 。而坐标法成为高速公路放样的主要方法，坐标法放样 线路中线的这个操作过程中，最重要的一部就是计算线路放样点的坐标。 2 路线中桩坐标计算原理 在实际工程中，线路的设计由专门的设计方完成，在线路完成设计得到审批后设计方便把所设计线路的线路要素（或者称为曲线要素）提供给施工方。所提供的曲线要素一般包括：线路中各曲线段的起点坐标、起点里程、起点半径、终点坐标、终点里程、终点半径、交点坐标、曲线参数、转角（包括用一定的符号表示左右转）、两条切线长（起点与终点各所对应的两条切线）、曲线长。当然不同的工程项目所提供的曲线要素也不一样，以上所述的要素是大多数设计方会提供的，有的设计方在提供上述要素的前提下，还提供曲线段的外距、中点坐标、弦长或者走向方位角等要素，供施工方在计算施工坐标时予以相互检核。 所以，为了保证原理的通用性，我们需要用最少的、最通用的、最有利于使用、最有利于推算的条件来讲解。通过对多份实际工程中用到的曲线元素的分析，得出了计算最复杂曲线（非完整缓和曲线）的中、边桩坐标及中桩→边桩坐标方位角的最少条件。 中桩，指的是为表示中线位置和线形等，沿路线中线所设置的编有桩号的桩或标志。中桩测设是指沿着直线或曲线详细测设中桩，是工程中放样测量的重要组成部分。中桩的放样方法有多种，但随着测量仪器的日益先进，测量手段也开始发生变化且趋向于简单，测量的结果也日益精确，当然所要求的放样元素也由所变化。现在工程中实际用到的放样仪器主要是全站仪、GPS-RTK ，这就决定我们在计算线路的放样元素时，得出的主要对象是桩位在总体坐标系中的二维坐标（高程放样是在其单独的高程坐标系中单独进行的）。
蛋白灰度分析总结-sssholy
蛋白灰度分析总结 By sssholy 2012-08-26 （stejun@https://www.360docs.net/doc/3713761016.html,） 蛋白灰度分析软件有：Image-Pro Plus，Quantity One，Image J等~~ 但总的来说： （1 能准确反应蛋白灰度~~ 但需要靠魔棒或轨迹法选取目的蛋白区域，有一定的主观性，不过蛋白灰度测定本身就是半定量分析-----测量值本身就没有一定标准，不同软件测量值不同，即使相同软件重复测量数值也不一定相同，因此只要测定数值能反应目的蛋白变化趋势，测量值相对偏差不大即可~~~ （2）Quantity One 有泳道-轨迹测定法，等高线/手绘选取目的区域测定法等方法。ⅰ.泳道-轨迹测定法： 过程：先剔除一系列背景，再选择泳道（lane），然后分析条带（band）,最后使用高斯建模得出灰度分析值（Gauss Model trace） 特点：感觉比较科学，重复性好，但十分繁琐，而且有时不能正确反应灰度（我亲测过，亲~~）。 ⅱ.等高线-手绘选取目的区域测定法：通过等高线或手绘选取目的蛋白区域，最简便，但重复性不太好。 （3）Image J 最坑爹~~~，它用魔棒选取区域测定灰度，可是有时很难选中所需区域，而且方法繁琐，不推荐！！ 在此，只总结综合性能最好的Image-Pro Plus（IPP）蛋白灰度分析方法~~~~
Image-Pro Plus 分析蛋白灰度教程 说明：目的蛋白的灰度=目的蛋白IOD值/ 相应内参IOD值 1.使用Photoshop剪切出目的区域（只含western bolt条带，如图），保存为 TIFF格式文件。 2.Image-Pro Plus打开文件，剔除背景： （1）放大镜放大目的区域 （2）M easure---calibration---intensity---options----image, 选择背景最大value值------ok-------ok----system----close (3) Measure---count/size---measure---select measurements，选择IOD为测量值，调整结果显示方式：Options-label style改为mesurement，选择IOD为显示值。（4）接下来有2种方法选择目的蛋白区域（即找出AOI，area of interest, IPP核心元件）：魔棒和手绘轨迹法。 魔棒：首选方法，客观科学，适合于蛋白条带轮廓清楚且各蛋白条带不融合 目的蛋白区域）。 手绘轨迹法：主观性较强，当魔棒无法选择单一条带时才使用。 （5）count/size---edit-----convert AOI to object---得出IOD值 （6）若测下一条带，则点NEW AOI按钮，再按以上方法选择AOI (7) 可以count/size---view---measurement data显示或输出测量值 图示过程如下：
Image-J-对Western-Blot进行灰度分析
Image J 对Western blot 条带进行灰度分析 Image J软件：Windows 版本 第一步：软件安装 1.下载地址：https://www.360docs.net/doc/3713761016.html,/ij/download.html 2.下载windows 32位带Java版本，双击软件安装。 第二步：界面介绍 1.软件界面 第三步：图片分析 1.下图为样板图片 2.导入图片：File> Open> Sample1.jpg 图片导入后，Sample1.jpg在新的窗口中打开
3.图片类型设置：Image> Type> 8 bit 4.去除图片背景：Process> Subtract Background> …
4.1Subtract Background 窗口：Rolling ball radius 设为50 pixels， 勾选light background，可选preview，点击“OK”确定 5.工具栏:选择“矩形选框”
6.最大化“Sample1.jpg”窗口，便于矩形选择，矩形选择第一个泳道 7.标记“矩形选框”为1：矩形选择后，调整矩形至合适大小，按下数字键 “1”，或者Analyze> Gels> Select Fist Lane。 8.选择“泳道2”：拖动“1”的矩形框，会出现两个矩形选框，拖动矩形框 至泳道2，调整位置，并按下数字键“2”，Image J 会自动调整大小使“矩形框2”与“矩形框1”保持同一水平。 9.继续拖动，会出项新的“矩形选框”，调增至泳道3，并按下数字键“2” （注意：是按下数字键“2”），重复9至6个泳道全部选择。 10.所有泳道选择后，按下数字键“3”，出现分析图谱。
蛋白免疫印迹半定量分析在药理学研究中的影响因素
基金项目：国家自然科学基金委优秀青年科学基金资助项目（81322050）；教育部新世纪优秀人才项目（NCET-12-0072）；北京市科技新星项目（2010B072） 作者简介：姜晨晨，女，硕士研究生研究方向：抗病毒药物药理学 * 通讯作者：彭宗根，男，研究员，博士生导师研究方向：抗病毒药 物分子药理学Tel ：（010）63166129 E-mail ：pumcpzg@https://www.360docs.net/doc/3713761016.html, 蛋白免疫印迹半定量分析在药理学研究中的影响因素 姜晨晨1，程军军2，黄梦昊1，吴舟一1，李健蕊1，李文静1，彭宗根 1* （1.中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究 所，北京100050；2．中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京100050） 摘要：目的探讨蛋白免疫印迹半定量分析的影响因素，为在蛋白水平上研究药物的药理作用提供指导。方法提取丙型肝 炎病毒（HCV ）感染的Huh7.5细胞内总蛋白，蛋白定量后，以丙型肝炎病毒编码的核心蛋白为目的蛋白，以管家基因编码的蛋白Tubulin 或Gapdh 为内参对照，分析蛋白上样量、抗体浓度及孵育时间、发光液浓度等可变因素对蛋白免疫印迹半定量分析结果的影响。结果 蛋白免疫印迹半定量结果中目的蛋白相对强度与蛋白总上样量之间只在一定上样量范围内有线性关 系，超出线性范围会导致相对蛋白强度变化幅度减少，甚至无变化；上样体积、内参的选择不影响实验结果；在条带质量较好的前提下，一抗浓度及其孵育时间和发光液浓度也不改变实验结果；但是半定量有一定的缺陷，实验结果有一定的误差，应在15%以内。结论 影响蛋白免疫印迹半定量结果的主要因素为目的蛋白的上样量；在能获得条带质量较好的前提下，改变上 样体积和抗体孵育时间、 适当稀释抗体和发光液浓度有利于实验进展而不影响实验结果。关键词：蛋白免疫印迹；半定量；影响因素；蛋白浓度doi ：10.11669/cpj.2015.09.006 中图分类号：Ｒ965 文献标志码：A 文章编号：1001－2494（2015）09－0758－05 Impact Factors on Ｒesults of Semi-Quantitative Western Blot in Pharmacological Ｒesearch JIANG Chen-chen 1，CHENG Jun-jun 2，HUANG Meng-hao 1，WU Zhou-yi 1，LI Jian-rui 1，LI Wen-jing 1，PENG Zong-gen 1*（1．Institute of Medicinal Biotechnology ，Chinese Academy of Medical Sciences ＆Peking Union Medical College ，Beijing 100050，China ；2．Institute of Materia Medica ，Chinese Academy of Medical Sciences ＆Peking Union Medical College ，Beijing 100050，China ） ABSTＲACT ：OBJECTIVE To investigate the impact factors of the semi-quantitative Western blot （WB ），offering a guidance on re-search of pharmacological effects of drugs at the level of proteins.METHODS Total proteins were extracted from the Huh7.5cells infected with hepatitis C virus and quantified with BCA kit ，HCV Core protein was chose as target protein ，and protein Tubulin or Gap-dh ，which was encoded by housekeeping gene ，as the internal control.By controlling the experimental factors ，such as loading sample amount ，concentration and the incubation time of first antibodies ，and dilutions of chemiluminescent fluid as well ，we analyzed those factors how to impact the semi-quantitative results.ＲESULTS The semi-quantitative results showed that there is a linear relationship between relative intensity of target protein and the amount of total protein at must protein concentration range ，beyond which ，the range-ability of relative intensity of target protein reduced ，even no changes.However ，sample volume loaded ，or protein selected as internal reference has little influence on the result of semi-quantitative WB.In the context of obtaining high-quality band ，concentration and in-cubation time of antibodies or dilution of chemiluminescent fluid also has no influence on it.Yet ，the semi-quantitative WB has certain defects and our results show that the permissible error of semi-quantitative result should be controlled within 15%.CONCLUSION The key impact factor on the result of semi-quantitative WB is the target protein amount of loading.On the premise of obtaining clear and high-quality bands ，appropriately selecting loading volume of samples ，concentration and incubation time of first antibodies ，and dilutions of chemiluminescent fluid is conducive to accomplish experiments without affecting the final results of semi-quantitative WB.KEY WOＲDS ：Western blot ；semi-quantitative ；impact factor ；protein concentration 蛋白免疫印迹（Western blot ）是当前蛋白分析的一种常规技术，它结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，用于检测样品中特异 蛋白存在与否、 细胞中特异蛋白的半定量分析和蛋白质分子相互作用的研究［1］ 。在药理学研究中，使用蛋白免疫印迹分析通常都是为了半定量检测某种