酶工程实验讲义

实验一酵母蔗糖酶的提取

一、原理

酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过超声波破碎细胞、硫酸铵沉淀等步骤，分离纯化酵母蔗糖酶。

二、实验材料、仪器和试剂

1.材料活性干酵母

2.仪器

(1)高速离心机

(2)恒温水浴锅

(3)超声破碎仪

3.试剂

(1)1 mol/L醋酸溶液

三、操作步骤

1.破碎细胞

取5 g干酵母，加5 g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30 mL去离子水，研磨30 min，在冰箱中冰冻约10 min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次。将研磨液转移至大离心管中，12000 r/min离心15 min，弃去沉淀。

2.加热除杂蛋白

将上清液转入三角瓶，用1 mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入50℃的水浴中，保温30 min。在温育过程中，注意经常缓慢搅拌液体。之后在冰浴中迅速冷却之，以12000 r/min的转速离心20 min，弃去沉淀。留0.5 mL上清液为第二组分。

3.乙醇沉淀

量出上清液的体积，加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20℃低温下的时间不少于30 min)，于冰浴中温和搅拌20 min。然后以12000 r/min的转速离心25 min，小心弃去上清液，沉淀沥干。将沉淀溶解在6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH值7.3)中，搅拌(5 min以上)使其完全溶解，以12000 r/min的转速离

心25 min，取出0.5 mL上清液作为第三组分，剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步操作。

用尿糖试纸进行半定量测定：

在白瓷板每孔中分别滴3滴待测酶液，再加3滴含5％蔗糖的pH 4.6的醋酸缓冲液，搅匀，37℃放置10 min，浸入尿糖试纸，1 s后取出，60 s后比较颜色的深浅，与比色卡对照。

尿糖试纸的原理：

尿糖试纸是将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶及无色的化合物固定在纸条上，制成的测试尿糖含量的酶试纸。溶液（或尿液）中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下，形成葡萄糖酸和过氧化氢；过氧化氢在过氧化氢酶的催化作用下形成水和原子氧；原子氧可将某种无色的化合物氧化成有色的化合物。当这种酶试纸与溶液（或尿液）相遇时，很快就会因溶液（或尿液）中葡萄糖含量的由少到多而依次呈现出浅蓝、浅绿、棕或深棕色。尿糖试纸是固定化酶实际应用的范例之一。

四、结果分析

以梯度洗脱出的管数为横坐标，以吸光度A280、酶活、NaCl浓度为纵坐标，绘出层析曲线和酶活曲线图。

实验二蔗糖酶酶学性质的研究

1 pH对蔗糖酶活动性的影响

酶的生物学特性之一是它对酸碱度的敏感性，pH对酶的活性的影响极为显著，通常各种酶只在一定的pH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH值下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其它条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横座标，反应速度为纵座标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适PH。

酶溶液pH值之所以会影响酶的活性，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基团的解离状态，而酶只有处于一种特殊的解离形式时才具有活性，例如：

H＋H＋

EH2＋＋EH E－

pKa1 (有活性) pKa2

酶的活性部位有关基团的解离形式如果发生变化，都将使酶转入“无活性”状态。在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态最适合于酶与底物的作用。此外，缓冲系统的离子性质和离子强度也会对酶的催化反应产生影响。

蔗糖酶有两组离子化活性基团，它们均影响酶水解蔗糖的能力。其解离常数分别是pKa =7和pKa =3。

实验方法：

按下表配制7种缓冲溶液（公用）：

将两种缓冲试剂混合后总体积均为10ml，其溶液pH值以酸度计测量值为准。溶液pH 缓冲试剂体积ml 缓冲试剂体积ml

2.5 0.2mol/L磷酸氢二钠 2.00 0.2mol/L柠檬酸8.00

3.0 0.2mol/L磷酸氢二钠 3.65 0.2mol/L柠檬酸 6.35

4.0 0.2mol/L乙酸钠 1.80 0.2mol/L乙酸8.20

5.0 0.2mol/L乙酸钠7.00 0.2mol/L乙酸 3.00

6.0 0.2mol/L乙酸钠9.50 0.2mol/L乙酸0.50

7.0 0.2mol/L磷酸氢二钠 6.10 0.2mol/L磷酸二氢钠 3.90

8.0 0.2mol/L磷酸氢二钠9.47 0.2mol/L磷酸二氢钠0.53

2. 准备二组各7支试管，第一组7支试管每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，然后加入一定量的蔗糖酶（此时的蔗糖酶只能用H2O稀释，酶的稀释倍数和加入量要选择适当，以便在当时的实验条件下能得到0.6~1.0的光吸收值（A650）。另一组7支试管也是每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，但不再加酶而加入等量的去离子水，分别作为测定时的空白对照管。所有的试管都用水补足到0.8ml。

3. 所有的试管按一定时间间隔加入0.2ml蔗糖（0.2mol/L)开始反应，反应10min 后分别加入1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应，加水杨酸试剂1ml，沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mL，然后测定A540的吸光值。

4. 画出不同pH下蔗糖酶活性（ moles/min）与pH的关系曲线，注意画出pH 值相同，而离子不同的两点，观察不同离子对酶活性的影响。

2温度对酶活性的影响

对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。温度对酶的作用具有双重影响，一方面温度升高会加速酶反应速度；另一方面又会加速酶蛋白的变性速度，因此，在较低的温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。酶反应速度达到最大时的温度称为酶反应的最适温度。如果保持其它反应条件恒定，在一系列不同的温度下测定酶活力，即可得到温度～酶活性曲线，并得到酶反应的最适温度。最适温度不是一个恒定的数值，它与反应条件有关。例如反应时间延长，最适温度将降低。大多数酶在60℃以上变性失活，个别的酶可以耐100℃左右的高温。

实验方法：

本实验要测定0℃～100℃，之间7个不同温度下蔗糖酶催化和酸催化的反应速度。这7个温度是：30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。

每个温度准备1支试管，以乙酸缓冲液作为缓冲液。

1. 确定酶的稀释倍数，试管中加入0.2ml 0.2mol/L pH4.9的乙酸缓冲液，0.2ml 稀释的酶，加水至0.8ml 加入0.2ml 0.2mol/L的蔗糖开始计时，在室温下反应10min，后分别加入1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应，加水杨酸试剂1ml，沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mL，然后测定A540的吸光值。须得到0.2～1.0A的吸光度，准备一个水的空白对照管用于测定所有的样品管。

2. 测定上列各个温度下的反应速度，每次用1支试管，均加入0.2ml乙酸缓冲液均用水调至0.8ml，放入水浴温度下使反应物平衡30秒，加入0.2mol/L蔗糖0.2ml，准确反应10分钟，后分别加入1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应，加水杨酸试剂1ml，沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mL，然后测定A540的吸光值。记录每个水浴的准确温度。

3. 酶催化的各管A540值均进行酸催化的校正。画出酶催化的反应速度对温度的关系曲线。

实验三酵母蔗糖酶的固定化

一、实验原理

1.固定化酶

通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。与游离酶相比，固定化酶有以下优点：①提高酶的稳定性；②易与产物分离；③可反复利用。酶的固定化方法有：吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。本实验用壳聚糖固定化酵母蔗糖酶属共价偶联法。由于载体带电性质的不同，会引起酶与底物亲和力的变化，从而引起米氏常数Km值的改变。酶固定化后，对变性剂、抑制剂的抵抗能力增强，贮存稳定性和操作稳定性也得以提高。

2.酶活测定

蔗糖酶催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性，能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。本实验用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸（DNS）共热，DNS被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖醛酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅成比例关系。酶活定义：在540 nm光吸收处，光密度每增加0.001个光吸收值定义为1个酶活力单位。

二、实验材料、仪器和试剂

1.材料壳聚糖、实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液

2.仪器移液管、注射器、分光光度计、水浴锅、铁架台等

3.试剂

（1）1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。

（2）10%蔗糖溶液

（3）0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液

（4）1%戊二醛溶液：将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至

100mL

（5）0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液

三、实验步骤

1.壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联

（1）称取3 g壳聚糖溶于98 mL蒸馏水中，搅拌均匀，再滴加2 mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠状。

（2）称取8 g NaOH置大烧杯中，加入180 mL蒸馏水及20 mL甲醇。

（3）将拔出推塞的注射器架在铁架台上，倒入粘稠状的壳聚糖溶液，使壳聚糖溶液从20 cm高的注射器出口滴入大烧杯中，以制备壳聚糖微球载体。

注意：为保证适宜的流速，注射器中的壳聚糖溶液不宜超过10 mL，随着壳聚糖溶液逐滴滴入大烧杯，应随时补充壳聚糖溶液至刻度，并不断轻轻晃动大烧杯。若液体表面壳聚糖微球过于密集，应静置片刻，待微球沉入烧杯底部后继续滴加。

（4）壳聚糖溶液滴加完毕后，静止片刻，待微球完全沉入烧杯底部时，反复水洗多次至pH值中性，沥干水分。加入1%戊二醛溶液100 mL，静置2 h，使戊二醛偶联于壳聚糖载体上。

2.固定化酶的制备

（1）将静置2 h后的壳聚糖微球载体中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸馏水洗涤5次，以除去多余的戊二醛。

（2）将实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液1 mL用蒸馏水稀释至100 mL,与偶联戊二醛的壳聚糖载体混合，静置偶联过夜。

3.固定化酶的评价

分别测游离酶、固定化酶以及残留酶液的酶活力。具体如下：

比色管号 1 2 3 4 蔗糖溶液 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 醋酸buffer 1 mL 1 mL

1 mL 1 mL

游离酶/固定化酶

1 mL 游离酶液

1 g 固定化酶

1 mL 残留酶液

37℃准确反应10 min ，1 mL 1 mol/L NaOH 终止酶促反应

水杨酸试剂

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至25 mL

A 540

四、实验结果

1.固定化酶的评价 活力回收=固定化酶总活力数

溶液酶总活力数

×100%

相对活力=固定化酶总活力数

溶液酶总活力数-残留酶活力数

×100%

实验四酵母蔗糖酶活性功能基团的化学修饰

一、实验原理

1．化学修饰原理

N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）能特异地修饰蛋白质分子中色氨酸残基的吲哚基团，使吲哚基氧化成羟吲哚衍生物，从而改变吲哚基的化学性质。若色氨酸残基是酶活性中心的必需基团，那么经NBS修饰后，酶活性丧失的程度与修饰剂的浓度有化学计量关系，且在底物存在的情况下，修饰剂NBS不影响酶的活力。2．酶活测定原理（DNS法）见实验三

二、实验材料、仪器和试剂

1．材料实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液

2．仪器恒温水浴锅、分光光度计、移液枪

3．试剂

(1)1 mmol/L的N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）溶液

(2)1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

(3)10%蔗糖溶液

(4)0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液

三、操作步骤

N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）对蔗糖酶的修饰与酶活测定

取8只试管，编号，按下表操作：

比色管号 1 2 3 4 5 6 7 8

酵母蔗糖酶酶液/μL\ 100 100 100 100 100 100 100

醋酸buffer/μL200 \ 20 40 60 80 100 \

1 mmol/L的NBS/μL\ 100 80 60 40 20 \ 100

NBS终浓度/mmol/L 0 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1

37℃水浴中修饰20 min \

蔗糖溶液/μL100 100 100 100 100 100 100 100 37℃准确反应20 min，100 μL 1mol/L NaOH终止酶促反应

水杨酸试剂/μL100 100 100 100 100 100 100 100

沸水浴精确反应5 min,冷却后加入4.5 mL ddH2O

A540

相对活力%（以7号管酶活力

为100%）

四、实验结果

以NBS浓度为横坐标，相对活力为纵坐标绘制折线图，并分析不同浓度的NBS对酵母蔗糖酶活力的影响，得出结论。

五、注意事项

(1) 酶活力低时，可适当增加酶液体积，相应减少缓冲液体积。

(2) 酶活性测定的反应时间及与DNS共沸的时间一定要精准。