南师大蛋清中提取溶菌酶实验
蛋清中提取溶菌酶
南京师范大学生命科学学院姓名：穆旭学号：09130333
摘要：本实验通过离子交换层析提取蛋清中的溶菌酶，掌握静态和动态离子交换的方法；
和从生物材料中提取活性蛋白质方法，并用超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶，掌握超滤分离技术的原理和操作。并且用SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量，从而掌握SDS－PAGE的原理和操作。
关键词：溶菌酶，柱层析，离子交换树脂，超滤，盐析，SDS-PAGE
研究材料与实验方法
1.柱层析前的准备工作
实验材料：
树脂：724型阳离子交换树脂、层析柱：φ1.6cm×30cm、溶液：0.1M NaOH，0.1M HCl、其他材料：布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等。1.1预处理724型阳离子交换树脂
碱－酸－碱的方法（Na型），每次用0.1N NaOH或者0.1N HCl溶液（体积约为树脂的2—3倍）浸泡树脂10—15min后，都要用蒸馏水将碱液、酸液冲洗掉。
1.2装填离子交换层析柱（重力沉降法）
固定层析柱，保持层析柱垂直；将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂自然沉降，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约2cm。
1.3配制0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0
先配制 1M Na2HPO4 57.7mL，1M NaH2PO4 42.3mL将两者混合后稀释至1000mL，装于试剂瓶中。
1.4平衡离子交换树脂
0.1M磷酸钠缓冲液恒速缓慢流经树脂，直至流出液的pH值与缓冲液相同，平衡结束。
2.柱层析法提取溶菌酶
实验材料：
起始缓冲液：0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）
洗脱液：50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液）、500mM NaCl溶液150mL （溶剂：起始缓冲液）
再生溶液：0.5M NaOH溶液
仪器：磁力搅拌器等
其他材料：新鲜鸡蛋
2.1样品的预处理
取2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.5倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用4层纱布过滤除去不溶性物质，检查其pH值是否为7.0，否则用0.5M酸、碱调节。
2.2静态吸附和洗涤
①静态吸附溶菌酶：倾出层析柱中平衡好的树脂，倾去多余平衡缓冲液，将蛋清溶液倒入树脂中，在磁力搅拌器上轻轻搅拌，室温下搅拌吸附约45min，注意搅拌速度（勿起大量泡沫、勿打破树脂）。吸附结束，吸取 200μL上清于dorf 管中、4度保存备用（标记“1”），倾倒上清。
②洗涤杂质：取与树脂体积相当的起始缓冲液搅拌洗涤树脂约5min，重复2次，每次洗涤后，吸取 200μL 洗涤液于 dorf管中、4度保存备用（标记“2”“3”），倾去洗涤液。
2.3动态洗脱
①用少量起始缓冲液将树脂调匀，重新装填层析柱，装填结束后，用起始缓冲液（用滴管沿层析柱内壁缓缓加入，勿冲击树脂面，高度约2cm即可）封闭树脂面，将层析系统组装好，核酸蛋白检测仪调基线（T档调“100”，A档调“0”），开始用 50mM NaCl洗脱液恒速洗脱杂质。（流速约2~3mL/min)。
②洗脱杂蛋白：洗脱开始，即计时，然后每隔2min，记录下吸光值和电导率值（使用LP层析系统的同学记录电导率值），当洗脱峰结束（流出液的吸光值从开始上升到下降，直至平稳），洗脱完成。在洗脱峰吸光值最大处收集少量洗脱液于 dorf管中，标记“4”）
③收集溶菌酶：更换 500mM NaCl洗脱液，同样记录，同样在吸光值最大处收集少量洗脱液于dorf管中，标记“5”），不同的是，此时是溶菌酶的洗脱峰，所以整个洗脱峰要收集于烧杯中，4度保存。
2.4再生树脂、洗涤管道、绘制层析图谱
用0.5M NaOH溶液（约1倍柱床体积）洗涤树脂，然后用蒸馏水将碱液冲洗干净，树脂回收于烧杯中，浸泡于蒸馏水中，保鲜膜蒙好，室温放置。
管道系统连接好，用约100mL 70%乙醇冲洗管道，冲洗层析柱。
以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制层析图谱，使用LP层析系统的同学，分别以吸光值和电导率为纵坐标。
3.超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶
实验材料：
溶液：0.5M NaOH溶液
透析缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）
其他材料：透析袋（8000~10000Da），超滤膜（30kD），固体硫酸铵，研钵，捣杵等。
3.1超滤分离（四组同学的溶菌酶洗脱液合并超滤）
将溶菌酶洗脱液以合适的流速经过超滤膜（进口压力不超过2.0bar），收集透过液，回流液（吸取200μL于dorf管中，标记为“6”），当透过液与回流液体积比约为3:1时，超滤可结束。
3.2盐析
在透过液中加入研细的固体硫酸铵粉末（边搅拌边加入），硫酸铵的终浓度为35％（即100mL 溶液中 35g 硫酸铵），室温下静置约20~30min，4度、10000rpm、20min。
3.3透析除盐
取少量 0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）溶解沉淀，装入透析袋中，置于适量的0.1M 磷酸钠缓冲液室温下搅拌透析过夜，次日更换缓冲液继续透析24h。透析结束后，将透析袋内的溶菌酶样品装入离心管中，4度保存备用（标记“7”）。
4.SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量
实验材料：
制胶的试剂：30％胶贮存液：丙烯酰胺（Acr）：甲叉双丙烯酰胺（Bis)＝ 29：1
避光保存神经毒
加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）剧毒
催化剂：10％过硫酸铵（AP ）新鲜配制
变性剂：10％SDS 室温保存
缓冲液：2×样品缓冲液： 100mmol/L Tris-HCl 4%SDS 0.2%溴酚蓝 20%甘油200 mmol/Lβ-巯基乙醇 pH6.8
凝胶缓冲液：1.5M Tris-HCl pH 8.8，0.5M Tris-HCl pH6.8
10×电泳缓冲液：250mmol/L Tris-HCl 2.5 mmol/L 甘氨酸 1% SDS pH8.3 4度保存
染色液：考马氏亮蓝 R250 染色液
仪器：垂直电泳系统
4.1配制分离胶12％
各种溶液在洁净干燥的烧杯中混合均匀，勿使胶液产生大量气泡，迅速沿玻璃板边缘加入胶液，至短板约2/3高处，灌注胶液时避免混入气泡，迅速加入去离子水至短板顶端，覆盖住胶面，待凝胶聚合，倒去水层，并用滤纸将水分吸干。
4.2配制浓缩胶5％
迅速沿玻璃板边缘加入胶液至接近顶部，斜插入“梳子”，确保“梳齿”底端无气泡，和“梳子”水平。
4.3加入1×电泳缓冲液
加入约200mL 1×电泳缓冲液，使凝胶上、下端都浸泡在电泳缓冲液中，并且内槽缓冲液高于外槽；
确保加样孔内无无气泡，以保证电流畅通。
4.4制备样品
（1）将15μL样品与15μL 2×样品缓冲液在dorf管中混合均匀，100度煮沸
5min，8000rpm 离心 5min；
（2）样品（从左至右）
①蛋白质 Marker（10μL，不加2×样品缓冲液，煮沸，离心）
②标记“1”（吸附后的上清液）
③标记“2”（洗涤后的上清液）
④标记“3”（50mM NaCl洗脱峰）
⑤标记“4”（500mM NaCl洗脱峰）
⑥标记“5”（超滤回流液）
⑦标记“6”（透析除盐后的溶菌酶样品）
⑧蛋白质 Marker（10μL，不加2×样品缓冲液，煮沸，离心）
加样：用移液枪缓慢地加入 30μL 样品于样品孔中，让样品沉于样品孔内，避免加入气泡。
4.5电泳
（1）恒压电泳 100V；
（2）当溴酚蓝迁移至凝胶底部约0.5cm处，停止电泳；
（3）小心剥离凝胶，将凝胶浸入考马斯亮蓝 R250染液中，浸泡过夜；
（4）第二天回收染色液，用脱色液均匀脱去凝胶上的剩余染液。
注意事项：染色和脱色都应该均匀，所以如果条件允许，应在脱色摇床上进行。
4.6马氏亮蓝R250染色
原理：考马氏亮蓝R250通过范德华力与蛋白质结合，适用于蛋白质电泳微量蛋白质染色，当蛋白质浓度超过一定范围时，对其染色不符合Beer定律，不适合作定量分析。
灵敏度：每一条蛋白质条带最低质量为0.1μg。
实验结果与分析
1.柱层析前的准备工作
经碱－酸－碱的方法（Na型）预处理724型阳离子交换树脂后进行装柱，然后用配制的0.1M磷酸钠缓冲液平衡离子交换树脂，经1L磷酸钠缓冲液的平衡之后，树脂仍没有平衡完全，流出来的缓冲液的pH仍过碱。
讨论：可能由于在碱酸碱预处理过程中洗涤碱液不完全，造成树脂平衡缓慢。所以配制新的缓冲液继续进行平衡树脂操作，经约500ml缓冲液流过后。树脂平衡完全，可进行下步操作。
2.柱层析法提取溶菌酶
按照实验步骤进行溶菌酶的静态吸附和杂质洗涤后，按实验步骤进行动态洗脱操作。得到63组实验数据。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制层析图谱。如下：
通过层析图谱可知，在22分钟起进入溶菌酶洗脱峰，收集洗脱出来的溶菌酶。4度保存。
3.超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶
提取出的粗溶菌酶经过超滤分离、盐析、透析除盐等操作，透析结束后，将透析袋内的溶菌酶样品装入离心管中，4度保存备用（标记“7”）。
4.SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量
保存的各管样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、马氏亮蓝R250染色后进行脱色，处理后得到含条带的凝胶。
对电泳条带进行分析：因在洗脱溶菌酶时本组在洗脱峰中多收集了两个dorf管的洗脱液，所以本组有8只dorf管的样品，7号管为析袋内的溶菌酶样品。由电泳条带可知，7号条带只有一条，所以7号管内的溶菌酶样品比较纯净。另，由于在制胶过程中，拔去梳子过程中造成了9号孔和10号孔上部脸在了一
起，从而导致点样时，9,10号点样孔内的样品有混合现象，造成了一定的实验失误。
南师大博雅VB记案例
南师大博雅VB记案例
————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：
循环结构 一、For循环语句： 1、计算1+2+3+4……+100 Private Sub Form_Click() Dim a As Integer, s As Integer For i = 1 To 100 a = a + 1 s = s + a Next i Print s End Sub 2、计算1+3-5+7-9+……-99 Private Sub Form_Click() Dim a As Integer, s As Long a = -1 For i = 1 To 99 Step 2 a = a + 2 s = s + (-1) ^ n * a n = n + 1 Next i Print s End Sub 3、找一个数的约数 Private Sub Command1_Click() Dim n As Integer List1.Clear n = InputBox("输入") For x = 1 To n If n Mod x = o Then List1.AddItem Str(x) End If Next x End Sub
4、循环嵌套：找勾股数 （1）Private Sub Command1_Click() Dim n As Integer List1.Clear For a = 1 To 300 For b = a To 300 For c = b To 300 If a ^ 2 + b ^ 2 = c ^ 2 Then List1.AddItem Str(a) & Str(b) & Str(c) End If Next c Next b Next a End Sub （2）简化 Private Sub Command1_Click() List1.Clear For a = 1 To 500 For b = a To 500 If Sqr(a ^ 2 + b ^ 2) = Int(Sqr(a ^ 2 + b ^ 2)) Then List1.AddItem Str(a) & Str(b) & Str(Sqr(a ^ 2 + b ^ 2)) End If Next b Next a End Sub 二、Select结构语句（善于实现多分支结构） Select case e Case e1 A语句 Case e2 B语句 . . . Case else N 语句
溶菌酶资料
溶菌酶 ----新型免疫抗菌抗病毒药物、饲料添加剂 溶菌酶研发背景： 抗生素是人类应用最广泛的抗菌药物，不仅用于临床，也广泛用于畜禽饲养和农业方面。在过去的50多年中，由于饲用抗生素在养殖中的长期使用导致大量耐药菌株的产生，且病原菌抗药性逐年增强，致使疗效下降，剂量提高，造成动物疾病越防越难防，越治越难治，给养殖业造成很大的损失和危害。同时也给全人类的健康造成严重的影响。因此，世界卫生组织于1994年就细菌耐药性的监测结果给全世界提出了警示：细菌对抗生素产生的耐药性正在以惊人的速度增加，而现在的抗生素药物正在失去原来的疗效。因此寻求广谱、高效的新一代饲用抗菌药物已成为迫在眉睫的摆在人类面前的课题。 澳大利亚昆士兰大学医学系博士生导师、高级研究员王雯禾博士（1993年毕业于英国剑桥大学达尔文学院获微生物营养学博士学位），一直致力于生命科学的研究和发展，历经十多年的研究发现：酶广泛存在于生物体内，参与新陈代谢等多种生理功能，其中对微生物细胞壁具有水解功能的抗菌酶，如溶菌酶lysozyme能够溶解微生物细胞壁而使微生物死亡，而且溶菌酶lysozyme在人和动物的唾液、眼泪、乳汁以及肌体组织中大量存在，是人和动物自身重要的免疫因子，与人和动物的健康息息相关。 溶菌酶lysozyme的溶菌（杀菌）作用与传统的抗生素药物相比，具有对某一病原菌所有血清型都有效的优点，克服了一种抗生素只能预防一种或其中一种血清型病原菌的不足，更不存在药物残留和耐药性的问题。 王雯禾博士认为，溶菌酶lysozyme作为畜禽、水产饲料添加剂在替代抗生素，控制耐药菌，生产绿色肉蛋奶食品方面是最佳的选择。并多次鼓励和支持国内年轻的科学家、学者，致力于这一伟大的、划时代的、对全人类的健康有杰出贡献的产品的开发和研究。并于2003年10月推出最早用于防治动物疾病的产品--溶菌酶系列,由于它不但能溶解（杀死）细菌，增强动物的免疫能力，而且还能和病毒结合使病毒失活，所以它作为预防动物疾病的新型饲料添加剂，正在动物疾病防治的许多领域被广泛应用。·溶菌酶生产原理 ---- 一种基因克隆酶 早在上世纪九十年代早期，荷兰科学家就研制出phyA基因工程菌，成为全世界第一个基因克隆菌的研究成果，作为一个伟大的研究成果在生物领域被迅速推广和使用。 溶菌酶是我们澳洲的研究专家团将来源于健康动物体内的溶菌酶利用分子生物学技术对其进行基因克隆重组进入受菌体，筛选优选优良菌种，通过生物发酵和生物提取工艺以及冷冻干燥技术产生的一种水溶性溶菌（杀菌）蛋白酶。 ·溶菌酶的社会效益 溶菌酶在畜牧业中推广应用，一方面将降低疫病造成的产量下降，减少由此引起的巨大经济损失，大大提高畜牧水产业的经济效益（若按仔猪的死亡率达10-20％，鸡死亡率达20％左右，水产死亡率达30%左右，造成的直接经济损失分别达到2.8亿元以上，4.44亿左右和5.2亿元），另一方面的推广应用能很好的解决家畜家禽水产疫病防治中的药物残留问题，并能改善肉蛋奶的质量，确保食品安全。同时，我国加入WTO后，可促进我国畜禽水产肉蛋奶的出口，增加国家外汇收入。 ·溶菌酶的生态效益 本产品在充分利用自然资源的基础，采用现代生物技术对活性生物成分——溶菌酶进行分离提纯所得到的制剂易泰·溶菌酶，不含激素和化学防腐剂。因此本产品在生产中的应用无毒、无药物残留、不会产生耐药菌株，不但不会对生态环境带来不良影响，还将有利于改善生态环境。 ·溶菌酶系列产品
鸡蛋清中提取溶菌酶方法的研究
第7卷第3期大连民族学院学报V ol.7 No.3 2005年5月 JOURNAL OF DALIAN NATIONALITIES UNIVERSITY May 2005 鸡蛋清中提取溶菌酶方法的研究 大连民族学院生命科学学院2001级高威孙纯义 溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-β-N-溶菌酶. 因其对人体细胞没有毒性作用，故在医学、食品科学等领域广泛应用. 蛋清中溶菌酶的含量约2‰，但杂蛋白的含量很高，使得在制取高纯度溶菌酶时操作比较复杂，成本较高. 本文介绍的方法操作简便，成本低，收率高. 1 实验材料与方法 1.1 实验材料 实验原料：新鲜的鸡蛋清. 试剂：冰醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、考马斯亮蓝G-250、磷酸、95%乙醇（以上试剂均为国产分析纯级），CM Sepharose FF（Parmacia公司生产）. 仪器：TDL—50B低速台式大容量离心机、752紫外可见分光光度计、TA2104H电子天平、恒温水浴锅等. 1.2 实验方法[1] 取100mL纯净水，用醋酸调pH值为3.5，水浴加热到85℃. 加入50mL新鲜蛋清，搅拌加热5min.将所得液体3000r/min离心10min，收集上清液. 将上清液加入处理好的CM Sepharose FF层析柱中，控制流速在200mL/h 左右. 吸附完毕用纯净水冲洗吸附柱，以除去杂蛋白. 用100mL 0.1mol/L的氯化钠溶液洗脱溶菌酶，流速200mL/h. 收集洗脱液，检测酶活力. 1.3 检测方法[2] 溶菌酶活力测定：将处理好的黄色小球菌用生理盐水稀释，使其在波长450nm处，吸光度在0.3~0.8之间. 用生理盐水做空白相，在比色皿中加入20μL洗脱液，然后加入3mL稀释好的菌液，于波长在λ450处，测量1min 内的吸光度下降值. 酶活力单位定义：每分钟引起ΔOD450下降0.001为一个酶活力单位. 溶菌酶活力=ΔOD450/0.001×W（W为加入溶菌酶质量）. 蛋白浓度的测定：采用考马斯亮蓝染色法. 以溶菌酶标准品为标准蛋白. 2 结果与分析 2.1 溶菌酶的提取及初步纯化 溶菌酶属于碱性蛋白酶，化学性质非常稳定，pH在3.0~7.0时其结构几乎不变，仍保持原酶活性. 在中性介质的条件下，溶菌酶能与鸡蛋清中其他蛋白质形成络合物，大大提高了其稳定性. 在这种情况下，溶菌酶的析出被抑制，但如果在该体系加入酸，降低体系pH值，就可破坏上述络合物的形成，使得溶菌酶与酸作用生成相应的盐，这样溶菌酶就可很好地被水提取. 同时，由于大多数的蛋白质分子的等电点都处在酸性或弱酸性范围内，所以也可去除部分杂蛋白，达到初步纯化的目的. 溶菌酶具有较好的热稳定性，当温度不是很高时，短时间的热处理，酶活力不会有明显的变化，而一般的杂蛋白分子会在较低的温度下变性沉淀. 将体系温度升高到85℃时，鸡蛋清中大量的其他蛋白质凝聚，而溶菌酶由于其耐热性较高则不会凝聚，仍在上清液中，这样也可以促进溶菌酶与其他蛋白质分开. 这样通过调节体系的pH值及温度，可达到从蛋清中较好地提取溶菌酶的目的. 2.2 用CM Sepharose FF高度纯化 CM Sepharose FF是弱酸性阳离子交换树脂，对溶菌酶有较高的吸附能力，与传统离子交换剂相比具有吸附速度快,能够快速洗脱的特点. 可使溶菌酶比活力由吸附前874U/mg上升到18 830U/mg，蛋白活力提高了22倍，且收率较高. 3 结论 查溶菌酶标准曲线可得洗脱液中溶菌酶的含量为1.05mg/mL，总得率为0.19%. 以黄色小球菌测定，酶活力为18 830U/mg. 所得酶活力与传统提取工艺相比纯度有较大的提高，同时具有操作简便、成本较低、收率较高、生产周期短等优点. 参考文献： [1] 张文会，王艳辉. 离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶[J]. 食品工业科 技，2003（6）24：57-59. [2] 林亲录，马美湖. 鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化[J]. 食品科学， 2002（2）23：43-46.
(推荐)溶菌酶作用机理
溶菌酶作用机理 1.溶菌酶：是催化某些细菌细胞壁水解、从而溶解其细胞壁的酶，主要存在于鸡蛋清及动物的眼泪中。 2.细胞壁多糖：是N-乙酰氨基葡萄糖（NGA）-N-乙酰氨基葡萄糖乳酸（NAM）的共聚物，其中的NGA及NAM通过b-1，4糖苷键而交替排列： 3.溶菌酶的结构：由129个氨基酸组成的单肽链蛋白质，含有四对二硫键，一级结构如图所示 4.溶菌酶的催化作用：为葡糖苷酶，能水解NAM的C1与NAG的C4之间的糖苷键，但不能水解NAG的C1 与NAM的C4之间的糖苷键，水解作用如下： 5.溶菌酶的三维结构：溶菌酶分子内部几乎是非极性的，在分子的表面有一个较深的裂缝，恰好能容纳多糖底物的六个单糖（ABCDEF环），是溶菌酶的活性部位，其中白色所示的是活性部位的Glu35和Asp52。 6.溶菌酶与底物的复合物的三维结构： 7.溶菌酶-底物结合部位示意图：NAG多聚体水解速率表明从5到6聚体增加到最大，活性部位的裂缝正好被六个糖残基所装满，水解部位是D和E之间的糖苷键
8.溶菌酶与底物的复合物的三维结构示意图：第四个糖残基D环由于空间的原因必须由正常的椅式变形为能量较高的半椅式，因此降低了糖苷键的稳定性容易断裂。 9.溶菌酶催化作用机制要点总结： （1）Glu35的-COOH提供一个H+到D环与E环间的糖苷键O原子上。H+的转移使D环的C1键与糖苷键O原子间的键断开，并形成正碳离子过渡中间产物。（2）含有E及F残基的NAG二聚体离开酶分子。 （3）正碳离子中间产物进一步与来自溶剂的OH-发生反应， Glu35质子化，酶游离出来。
（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）
溶菌酶提取
方法对比讲稿用 2.1 结晶法 溶菌酶具有耐热、耐酸的特性，并且易溶解在盐溶液，稳定性好，通过改变盐溶液的条件，可使溶菌酶以晶体形式析出而得以分离，结晶法也因此成为制备溶菌酶晶体最为传统的方法之一。该方法的主要过程可简述如下，向富含溶菌酶的蛋清中加入(NH4)2SO4等中性盐，依据溶菌酶的等电点区，用氢氧化钠调节蛋清溶液的 pH，再加入溶菌酶晶体进行诱导，4℃放置大概 2 周，即可析出大部分的溶菌酶晶体，而与其它杂蛋白质得以分离。如要得到到更高纯度的溶菌酶，可将析出的溶菌酶晶体过滤，重新溶解，再利用上述同样的方法进行重结晶即可。结晶法操作简单、成本低，是目前从蛋清中提取分离溶菌酶的首选方法，但它要求溶菌酶的含量要相对高，因此不适宜溶液中微量溶菌酶的分离。此外，晶体的形成，蛋白质结晶既受到自身分子结构的影响，又受到结晶条件的影响，结晶过程中只要有细微的差别，晶体的产量和质量都将受到很大影响（结晶过程不好控制），所以蛋白质结晶是一个宏观看似简单而实际微观极为复杂的物理化学过程。为进一步完善结晶法分离纯化溶菌酶，研发人员越来越重视膜结晶法的研究与应用。相比于常规结晶方法，膜结晶法对蛋白质初始浓度要求低、结晶诱导时间较短、尤其是结晶过程可控，因而具有明显优势。 2.2 离子交换法 离子交换法是借助溶液中各种蛋白质等粒子的带电差异，而与离子交换剂之间具有强弱不一的结合力，达到分离纯化物质的操作技术。依据原料及分离纯化的不同要求，可分别选择羧甲基琼脂糖、羧酸纤维素和羧甲基纤维素等离子交换剂。离子交换法操作简单，成本较低，可实现自动化连续操作，适用于大规模生产，是目前溶菌酶生产的常用方法。 （联用层析法因分离速度快、处理量大等优势而受到研发人员的广泛关注，包括膜亲和层析法、离子交换层析法等。尤其是离子交换层析法 20 世纪 80 年代便开始广泛应用于溶菌酶地分离纯化。此方法操作简便、成本低、高效、可实现自动化操作，是溶菌酶生产中的常用方法之一。） 2.3 色谱法 以亲和力为基础，将不溶性的载体与可逆结合的配体相偶联，制备成具有特异亲和性的分离介质，选择性地吸附生物活性物质，依据待分离物质的特性再利用相应组成的溶液洗脱而达到分离提取需要物质的目的，这就是 20 世纪 80 年代末发展起来的亲和色谱技术。亲和色谱技术是诸多色谱法的一种，选择性高、快速、高效，适合蛋清溶菌酶高效分离与纯化的需要。随着生产对技术要求的提高，研发人员以传统的膜处理为基础，利用固定离子亲和色谱和膜分离相结合，制备固定金属亲和膜，因其具有良好的分离性能，可用于蛋白质的分离纯化。多方研究结果表明固定金属亲和膜对溶菌酶的选择吸附性能良好。如若将间歇式吸附与连续式脱附耦合亲和层析法相结合，用于溶菌酶分离纯化，蛋白质回收率和吸附剂利 用率都会有明显提高。 2.4 亲和分离法 亲和力为基础，借助物质间的特异性结合力，使目的物质或者杂质与相应的配基结合而达到分离纯化目的物的目的，即亲和分离法，包括亲和沉淀法、亲和膜分离法、亲和过滤法、亲和层析法等。尤以亲和层析法和亲和沉淀法的应用广泛。亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具
溶菌酶
溶菌酶 溶菌酶 溶菌酶( Lysozyme，E．C．3.2.17)，全称为1，4-p -N -溶菌酶，又称为细胞壁溶解酶，是自然界普遍存在的一种酶，因其能溶解细菌细胞壁具有溶菌作用而得名。 （一）溶菌酶的结构及物理化学性质 溶菌酶易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚，是一种白色、无臭的结晶粉末。相对分子质量为14.7ku，由129个氨基酸残基组成，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高，含有4个二硫键，如图2 -24所示，其等电点为10~11。在37℃条件下溶菌酶的生物学活性可保持6h，当温度较低时保持时间更长，利于溶菌酶在体内发挥作用。禽蛋蛋清是溶菌酶的重要来源，蛋清溶菌酶的物理化学性质如表17 -1所示。溶菌酶由两个区域组成，由一个长的α螺旋所联接，其二级结构大多是α螺旋。N末端的区域( f40~80)由一些螺旋线组成，大多数是反平行的β折叠。第二个区域由fl~39和f89~129氨基酸残基组成。分子中的这两个区域被一个螺旋体（f87天冬氨酸- 114精氨酸）所分离，分子组成了内部疏水外部亲水的基本结构，对溶菌酶发挥抗菌功能起着巨大的作用。 表17 -1 蛋清溶菌酶的物理化学特性 特性数值 相对分子质量14 400 亚基数 1 氨基酸129 等电点10.7 二硫键数 4 碳水化合物所占比例0 E1%280nm 26.4 93℃时的D热值（每分钟破坏90%的活性）110 酶活力的实验通过浑浊溶壁微球菌的细胞溶解 （二）溶菌酶的来源 溶菌酶在自然界中普遍存在，在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中，均发现有溶菌酶存在，其物化性质基本相似，溶菌酶的来源如表17 -2所示。溶菌酶主要分布于禽蛋和鸟类蛋清中，尤其是浓厚蛋白的系带膜状层中。禽蛋中异常丰富，占整个蛋清中的 3.5%，鸡蛋蛋清是溶菌酶的主要商业来源。 表17 -2溶菌酶的来源
鸡蛋溶菌酶提取
鸡蛋溶菌酶提取 溶菌酶（又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶） 是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。 性质： 白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适 pH值6.5。稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃， pH值为3条件下，15min后活力保持87%。抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在281.5nm 处的吸光系数为26.4。通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌 作用： 溶菌酶的用途极为广泛，在医药上，可与血液中的病毒结合，阻止流感、腺病毒等的繁殖；能分解粘多糖，有利于脓汁、痰液的排出；能清除坏死组织、增进抗生素的药效以及促进肠道有益细菌如乳酸菌的繁殖等作用；另外，它与抗生素联合应用还可治疗支气管炎、肺炎、白喉、小儿急性肾炎等多种疾病。在食品上，卵清溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解，而对其他物质无反应，人们利用它来代替有害健康的化学防腐剂（如苯甲酸及其钠盐），以达到保存食物的目的，是一种天然防腐剂；溶菌酶添加于牛乳，可使牛乳人乳化，提高了牛乳的营养价值。 提取工艺： （一）鸡蛋清中提取溶菌酶 方法一——食盐盐析 一．材料： 原料：鸡蛋、NaOH、NaCl、丙酮、（市售溶菌酶粉剂） 仪器与设备：搅拌器（200-300r/min）,离心机（4000r/min），抽滤机 二．工艺流程： 原料→ 清洗→ 去蛋壳→ 分离蛋清→ 搅拌→ 过滤→ 加盐→ 调节pH 值→ 结晶→ 干燥→ 成品→ 包装
南京师范大学博雅课程一览表
在即将离开学校的时候，给想不经常上博雅课又想拿分的学弟学妹们个参考，如果你是个一逃课就茶不思饭不想的主请自动跳过。==求各种踊跃发言完善这篇日志==来 能不选就别选的课 国学原理与人生老师方向东理由是每节课必点名，并且如果一学期三节课没到就没成绩，说话声音贼小，完全不给同学认真听讲的机会，考试论文不许在网上抄，不然没分。总之，大爷的。 旅游景观基础老师沙润理由是不定期点名，期中考试还要你做PPT上台演讲，期末考试还很痛苦的不知道该写什么，很麻烦。 生物多样性 中外戏剧经典名著鉴赏理由无聊不说老师还恐怖= = 西方文化史理由要买老师自行编写的书不然就考试不能 批判性思维，陈真的课，还有一学期叫啥忘了，反正他上下学期课不一样，他上课全英文讲课，卷子也是全英的，不定期点名，我承认我听不懂，后来他改中文讲课了，好吧，我依然听不懂……（我记得好像他上的课还有个逻辑学~~，总之就是慎选陈真的课） 旅游消费行为，节节点名，后来他点不动了就找个助教帮他点…… 管理心理学，不能选。每节课都要签到，期中期末都考，还是做卷子，还要自己去借书看，给的分还狂低。。 各国教育比较千万别选！！节节点名！三次以上不到真的会不给你过。。考试也很讨厌麻烦给分也不高 实用英语写作。。。考试就是4篇作文好像 中国经济1要自己买书（期末考试抄的）2 课课点名（我们当时有95个人）3上课无聊，没学问到什么东西（这个估计看个人，至少我没学到啥）4期中要交论文（最不能理解的是要附上好几张材料）5上课喜欢点名回答问题
可以选择的课（入选条件为极少的点名考试又易过的） 大学语文法国作家与中国文化现代社交礼仪宗教文化西方音乐鉴 赏文革十年摄影艺术与审美人体生理与人体健康世界民族音乐欣赏古汉语文学食品与安全生活中的法理宝玉石鉴赏电影文化学当代战争与世界和平 一些开课会变的不点名又很好的老师：杨家新老师郦波老师汤天明老师 我想说的是那个新的内容恐怕我么有时间一一添加了，还请同学们留意评论呀~
一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法
(10)授权公告号 (45)授权公告日 2014.11.12 C N 103114082 B (21)申请号 201310069093.9 (22)申请日 2013.03.04 C12N 9/36(2006.01) (73)专利权人浙江工业大学 地址310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18号 (72)发明人张健 金志敏 夏春年 姚小武 张岩 (74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人黄美娟 王兵 CN 1108381 C,2003.05.14, 陈若飞.从蛋壳中提取溶菌酶的研究..《沈 阳化工学院院报》.2008, 卢庆祥.用聚丙烯酸凝聚提取溶菌酶..《化 学教学》.1995, M. Sternberg 和D. Hershberger.Separation of proteins with polyacrylic acids..《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure 》.1974,(54)发明名称 一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法 (57)摘要 本发明公开了一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的 方法：用水将鸡蛋清溶解，调节pH 至4.0～5.0 并加热至80℃左右，使杂蛋白沉淀、过滤除去，获 得滤液；再在弱酸性条件下，用木质素磺酸钠与 滤液中的溶菌酶进行聚合、沉淀；然后，将沉淀物 在碱性条件下溶解，用聚丙烯酰胺水溶液使其解 离，过滤得滤液；最后，向滤液中加入无水乙醇使 其结晶，过滤、干燥即得溶菌酶；本发明使用的原 材料价格低、工艺简单、条件温和、便于操作控制、 生产周期短，比以往的沉淀法更经济，更适合于工 业化生产。(51)Int.Cl.(56)对比文件 审查员 孙彦珂 权利要求书1页 说明书5页 (19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利权利要求书1页 说明书5页(10)授权公告号CN 103114082 B
第一节 溶菌酶的提取
第一节溶菌酶的提取 一、简介 1.Lz的结构及组成 溶菌酶(Lysozyme,EC 3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶（Muramidase），是由英国细菌学家弗莱明(Fleming)在1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液（如淋液）中及白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶。其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特 别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。 鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。此酶为白色、无臭结晶粉末,味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。其分子是由129个氨基酸残基排列构成的单一肽链（见图6-1），有四 图5-1 溶菌酶的分子结构 对二硫键，分子量为14300。结晶形状随结晶条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结晶等。 2.Lz的基本性质 Lz是一种碱性球蛋白，广泛存在于鸟和家禽的蛋清中。其酶蛋白性质稳定，热稳定性很高。 （1）Lz的热稳定性 Lz在酸性pH下是稳定的，此时100℃的加热对Lz仅有较小的活力损失。在pH4.5（100℃，3min）、pH5.29（100℃，3min）下加热，Lz是稳定的。一般认为Lz在酸性条件
下稳定，在碱性条件下不稳定。 糖和烯烃类能增加Lz的热稳定性，NaCL对Lz也有抗热变性作用，而且盐溶液的存在对Lz的活力是十分必要的。在低盐浓度时，Lz的活化和离子强度密切相关，在高盐浓度时对Lz的活力受到抑制，阳离子的价态愈高则抑制作用愈强。具有—COOH和—SH3OH基的多糖对Lz活力有抑制作用。 （2）加工过程中的化学变化 蛋白质和过氧化的脂类作用对食品的储藏有着重要的影响，自由基使不饱和脂肪酸过氧化产生H2O2,导致产品的破坏，这类反应的一个特征是产品的溶解性下降。溶菌酶和过氧化甲基亚油酸盐一起培养，导致蛋白质溶解度的下降和增加了溶解部分的分子质量，这是由于在Lz中产生了游离基，而导致其和过氧化的甲基亚油酸作用，研究表明Lz中游离基浓度随水分活度的上升而下降。 在150℃~300℃焙烤对溶菌酶和酪蛋白的作用中，溶菌酶被作为一个纯蛋白质样品在250℃几乎所有溶菌酶的氨基酸被分解，色氨酸，含硫氨基酸、碱性氨基酸和β-OH氨基酸，较酸性氨基酸、脯氨酸、芳香族氨基酸(除色氨酸外）、有烷侧链的氨基酸容易分解这在氨基酸和还原糖间形成风味和有色物质的美拉德反应中是很重要的。 （3）络合作用 溶菌酶和许多物质形成络合物导致其失活。人们发现等量蛋清和蛋黄的混合物其溶菌酶无活力；脱水全蛋中仅保留部分溶菌酶的活力；蛋黄污染的蛋清仅有两个离子交换色谱峰，而不是无污染的三个峰；对全蛋的色谱分离无溶菌酶。据此，研究者认为抑制机理是在溶菌酶和蛋黄化合物间形成静电相互作用的络合物所致。 3.Lz的用途 溶菌酶作为一种活性物质可应用在各个领域，我国的食品工业、酶工程、发酵工业、医学和科学研究对溶菌酶有较大的需求。 由于溶菌酶对多种微生物有抑制作用，因此可以用于食品保鲜。目前主要应用于海产品、水产品、乳制品和干酪的保鲜，低度酒、糕点及饮料的防腐，以及水产熟制品及肉类熟制品的防腐保鲜的方面。 此外在发酵工业领域，酵母膏是发酵工业中用量最多的一类培养基成分。它的制备目前大多是采用酵母自溶法或酵解酵母的办法制成的。如果改用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。另外溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶。由此可见溶菌酶的用途极其广泛。 4.Lz的来源及分布 1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在，根据来源不同，将溶菌酶分为以下三类： （1）动物源溶菌酶 动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应
溶菌酶应用简介
1. 溶菌酶简介 溶菌酶，又称细胞壁水解酶，广泛存在于高等动植物组织及分泌物、原生动物、昆虫和各种微生物中。1922年Fleming等发现，在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶，因而被命名为溶菌酶。它能够水解N一乙酰葡萄糖胺与N一乙酰胞壁酸之间的β一1，4糖苷键，因此可以溶解大多数革兰氏阳性菌的细胞壁而具有溶菌作用，溶菌酶本身是一种蛋白质，安全性能高，在食品、医药、生物学中得到了广泛的应用。 2. 溶菌酶的理化性质（可要可不要） 溶菌酶是一种糖苷水解酶，是由129个氨基酸残基组成的小分子碱性球蛋白，相对分子质量为14 300，分子中富含碱性氨基酸和芳香族氨基酸，其多肽链经盘绕折叠形成二级和三级结构，形成一个椭圆形的外形结构， 溶菌酶纯品为白色粉末结晶，无臭、甜味，易溶于水和低浓度的盐溶液，不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45--50℃，最适pH为5～7，在低温干燥条件下可长期保存，热稳定性强，耐酸性强，pH为4—7时，100℃下处理45 min仍能保持其酶活性，但在碱性条件下化学性质不稳定，易变性。 3. 溶菌酶的作用 1．抗菌消炎 2．抗病毒：溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用。与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。 3．增强免疫力：溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。 4．其它方面的药理作用：溶菌酶还具有激活血小板的功能。可以改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，从而体现其止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用。 5．促进双歧乳酸杆菌增殖：溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接促进婴儿肠道细菌双歧乳酸杆菌的增殖，促进婴儿消化吸收，可以促进人工喂养婴儿肠道细
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤
从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤 1.鸡蛋清样品制备及粗分离 将4～5 个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得小于8.0），量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后用1 mol ／L 的HCl 溶液调pH 值至7.0 左右，再用脱脂棉过滤收集滤液。 2. 724 弱酸性阳离子交换树脂的再生及层析 1.吸附： 将处理好的蛋清约200 mL，加入32 g再生的724 树脂中，缓慢搅拌吸附6 h。 2.洗涤、洗脱： 待分层后，将蛋清液倒去，用去离子水反复冲洗，以去除杂蛋白，滤干树脂，用等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加入等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。 第二天，有白色沉淀析出，离心（15 min，10 000r ／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品 浓缩 1·透析除盐、去碱性蛋白： 4℃条件下，用去离子水透析24 h 左右（1天）直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反应直到没有浑浊产生为止）。离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入1 mol ／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升至8．0～9．0，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀） 2·聚乙二醇浓缩： 盐析物用1 倍去离子水溶解成稀糊状，装入透析袋，在装有聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液； 3·冷冻干燥： 用3 mol ／L 盐酸调pH值至5．0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。 溶菌酶纯度检测 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法 ①凝胶板的制备： 用30％分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏水、10％APS 溶液配制而成； ②溶菌酶的处理： 用磷酸缓冲液制成50 μg ／mL 的溶液，取10~80 μL 点样于凝胶板上 ③电泳： 电流为10 mA，时间4 h； ④固定、染色和脱色： 电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染色液中浸泡10～30 min，用水漂洗
溶菌酶
内容 1：溶菌酶简介 1.1 溶菌酶 溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，EC3.2.1.17）又称为胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。溶菌酶是由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，化学性质非常稳定。 溶菌酶存在 在自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁和组织细胞中(如肝、肾、淋巴组织、肠道等)。 从木瓜、芜青、大麦、无花果和卷心菜、萝卜等植物中也能分离出溶菌酶，其中以蛋清含量最高。 溶菌酶生理作用 在生物体内溶菌酶具有抗菌消炎，抗病毒，增强机体免疫力的生理功能，还可激活血小板，改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，具有止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用 2：溶菌酶的种类 溶菌酶的研究最早是从尼科尔(Nicoile)1907年发表枯草杆菌溶解因子的报告开始的。两年后，Laschtschenko指出：鸡卵白强烈抑菌作用是酶作用的结果。1922年英国细菌学家弗莱明(Fleming)发现人的唾液、眼泪中存在这种能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。 1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶，此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。 根据来源不同，将溶菌酶分为三类 （1）动物源溶菌酶 ?动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。 ?鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应用最多的，在鸡蛋清中约含有3.5%左右的酶，分子 量为14000，其等电点在pH10.8左右，最适效应温度在50℃，化学性质稳定，pH 在1.2～11.3之间改变时对酶结构影响很小，pH在4～7范围内100℃处理1min仍 有近100%的活力，在210℃条件下加热1.5h仍具有活性。 鸡蛋清溶菌酶在碱性环境条件下稳定性较差，分解G+细菌，但对G-细菌不起作用。研究表明其它鸟类蛋清溶菌酶也是由129个氨基酸残基组成，但其排列顺序和鸡蛋清溶菌酶不同，并且活性部位也不相同。 人溶菌酶分子量为14600，对人的溶菌酶研究发现它是由130个氨基酸残基组成，也有4个S-S键，其一级结构氨基酸顺序及组成与鸡蛋清溶菌酶相比有极大的差异，但三级结构有相似性，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍。对于哺乳动物溶菌酶，目前仅从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化学性质与人溶菌酶相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性远低于人溶菌酶。 （2）植物源溶菌酶 目前发现含溶菌酶的植物有近170种，在木瓜、无花果、大麦等植物中均已分离出溶菌酶。植物源溶菌酶分子量较大，约为24000～29000单位，其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但其对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。 （3）微生物源溶菌酶 上世纪60年代从微生物中分离出溶菌酶，根据其作用对象分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。
南师大蛋清中提取溶菌酶实验
蛋清中提取溶菌酶 南京师范大学生命科学学院姓名：穆旭学号：09130333 摘要：本实验通过离子交换层析提取蛋清中的溶菌酶，掌握静态和动态离子交换的方法； 和从生物材料中提取活性蛋白质方法，并用超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶，掌握超滤分离技术的原理和操作。并且用SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量，从而掌握SDS－PAGE的原理和操作。 关键词：溶菌酶，柱层析，离子交换树脂，超滤，盐析，SDS-PAGE 研究材料与实验方法 1.柱层析前的准备工作 实验材料： 树脂：724型阳离子交换树脂、层析柱：φ1.6cm×30cm、溶液：0.1M NaOH，0.1M HCl、其他材料：布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等。1.1预处理724型阳离子交换树脂 碱－酸－碱的方法（Na型），每次用0.1N NaOH或者0.1N HCl溶液（体积约为树脂的2—3倍）浸泡树脂10—15min后，都要用蒸馏水将碱液、酸液冲洗掉。 1.2装填离子交换层析柱（重力沉降法） 固定层析柱，保持层析柱垂直；将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂自然沉降，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约2cm。 1.3配制0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0 先配制 1M Na2HPO4 57.7mL，1M NaH2PO4 42.3mL将两者混合后稀释至1000mL，装于试剂瓶中。 1.4平衡离子交换树脂 0.1M磷酸钠缓冲液恒速缓慢流经树脂，直至流出液的pH值与缓冲液相同，平衡结束。 2.柱层析法提取溶菌酶 实验材料： 起始缓冲液：0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0） 洗脱液：50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液）、500mM NaCl溶液150mL （溶剂：起始缓冲液） 再生溶液：0.5M NaOH溶液 仪器：磁力搅拌器等 其他材料：新鲜鸡蛋 2.1样品的预处理 取2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.5倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用4层纱布过滤除去不溶性物质，检查其pH值是否为7.0，否则用0.5M酸、碱调节。
溶菌酶溶液配制及应用
溶菌酶溶液 简介： 华越洋溶菌酶溶液是浓度分别为10mg/ml的蛋清型溶菌酶溶液，可以用于下列分子生物学实验： 1.核酸纯化 2.包涵体蛋白纯化 3.质粒DNA纯化 4.几丁质的水解 5.细胞壁的水解 运输及保存： 低温运输，-20℃保存，有效期一年。 ============================================================= 溶菌酶存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的1，4-β-糖苷键水解的酶。 溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
用途用于生化研究，临床上用于急慢性咽喉炎、扁平苔癣、扁平疣等疾病的治疗。 生产 以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得产品。 制备 溶菌酶是采用生物工程技术进行克隆、提取而制取,它是一种天然酶，安全绿色的添加剂，无抗药性。该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。 优点 1．溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋清溶菌酶是C型，是已知的最耐热的酶；2．溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复；3．溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定；4．溶菌酶适宜pH5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐；5．溶菌酶生产成本较低；6．溶菌酶的抗菌谱较广，不仅局限于G+ 菌，对部分G 菌也有抑制效果；7．溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，1992年FAO/WTO 的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。 应用 医学应用 可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。口服和肌注均有效。口服，3～5片/次(肠溶片含10mg)，3次/日。口含，1片/次(口含片含20mg)，4～6次/日。外用：以1%～2%溶液滴注、涂擦或直接喷粉。肌注，50mg～100mg/次，1～2次/日。滴眼：用2%溶液。副作用偶有较轻的过敏反应。氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓痰分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药. 食品应用 可作为防腐剂，它的主要功用是水解细菌细胞壁，在细胞内，则对吞噬后的病原菌起破坏作用.该酶对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球菌有分解作用。对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有一定程度溶解作用，其最有效浓度为0.05%。与植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用，可提高其防腐效果。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告
生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定 实验报告集 班级生工1411 学号 组别7 姓名
实验室学生守则 一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员 的指导。 二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、 准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。 三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操 作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。 四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪 动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室 外。 五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和 吃东西。 六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管 理人员报告。 七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、 水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）
实验报告 溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定 一、目的 对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定 二、原理 鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。 1、溶菌酶分离纯化原理： （1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白 （2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白 2、溶菌酶鉴定分析 （1）考马斯亮蓝法测蛋白含量 （2）分光光度法测定酶活性 （3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度 三、实验材料与方法 1、实验材料与试剂 鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等 2、实验仪器 低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。 3、实验方法 1.新鲜鸡蛋清的制备与粗分离 2. 树脂柱层析分离纯化 （1）D152树脂处理(2)湿装法装柱(3) 上柱离子交换吸附(4) 冲平(5) 洗脱 3.透析与浓缩 (1) 透析除盐(2) 聚乙二醇浓缩 4.蛋白质含量的测定 5.溶菌酶纯度的测定（SDS凝胶电泳）
南师大教师教育学院综测办法
(2011年9月修订） 一、总则 第一条依据《普通高等学校学生管理规定》（教育部第21号令），参照《南京师范大学学生综合素质测评实施意见（修订）》，并结合教师教育学院的实际情况，制定本实施细则。 第二条综合测评的内容包括思想品德、专业学习、综合能力三个方面的测评。思想品德测评主要评估学生的政治表现、法纪观念、道德修养等。专业学习测评主要评估学生的专业学习成绩及科技学术能力。综合能力测评主要评估学生在校园文化活动、社会服务等方面的综合表现。 第三条综合测评每学期进行一次，分别安排在每年的3月和9月，对上一学期的综合表现进行测评（大四最后一学期不进行综合测评）。 第四条综合测评成绩中的奖励分、扣减分条件仅对测评学期有效(以所测评的学期时间为限，以相关材料标注时间为准)，且每项条件只能加（减）分一次，并以获奖证书、处分决定、活动记录等书面材料为凭证（加分材料须本人提供）。 第五条实施综合测评必须坚持科学、客观、公正、公平的原则。综合测评结果，将作为选拔优秀人才、优秀学生评比表彰、奖学金评定、学期（年）综合评定和毕业生推荐等的主要依据。 二、测评方式 第一条院学生综合测评工作由院党委领导，院学生工作办公室负责组织实施。学院成立由院党委副书记、团委书记、学生工作办公室主任、各年级辅导员组成的学生综合测评工作领导小组。各班成立由班主任主持，班长、团支书、学习委员、学生代表（2-3人，各班按班级人数民主推选）组成的综合测评小组，由测评小组负责本班的评分工作。
第二条测评程序： 1、个人总结：学生就本人上一学期的表现进行书面总结，基本内容为取得的成绩、存在的不足、心得体会和努力方向。同时依据实施细则认真填写《教师教育学院学生综合素质测评自评表》。 2、班级评分：由各班综合测评小组根据学生平时表现档案记载及个人提供书面证明材料，依据实施细则进行评分，分数填写在《教师教育学院学生综合素质测评自评表》中的“班级评分”一栏。班级汇总测评结果并填写《教师教育学院学生综合素质测评成绩汇总表》报送各年级辅导员。 3、学院审核：院党委成立学生综合测评工作领导小组，根据实施细则和实际情况对各班的测评结果进行审核，并对相关材料予以存档，同时将审核后的成绩向各班公布、公示。 4、测评结果一经公布、公示，任何人不得擅自更改。如有特殊情况，确需复议的需经院党委同意，可由年级辅导员主持召开测评小组会进行复议，并将复议结果报院党委审批。三、成绩计算 综合测评得分＝思想品德测评成绩×15%＋专业学习测评成绩×70%＋综合能力测评成 绩×15% （一）思想品德测评 测评成绩＝（基本分＋奖励分－扣减分）×15% 思想品德测评基本分为80分，满分为100分。 【奖励分】 （1）在德育方面（如见义勇为、舍己救人、拾金不昧等好人好事）受国家级、省级、校级、院级表彰者，分别加15分、12分、6分、3分。