绿藻栅藻培养

绿藻栅藻培养

藻类，特别是单细胞藻类的营养丰富，含有动物和人生长发育所必需的营养物质。自上世纪四十年代以来,各国学者都试图用藻类这一资源解决人类食物和动物饵料的缺乏问题。另一方面，藻类可直接或间接的作为鱼类及其他水生动物的饵料。

1 藻类的培养方式

藻类的培养方式，以藻类培养的目的要求而各种各样。但可分为密闭式培养和开放式培养两大类。

1.1密闭式培养

密闭式培养的目的是不使外界杂藻、菌类及其他有机体混入培养物中。将培养液密封在与外界完全隔离的透明容器中，由此通气，搅拌，输送培养液及调节水温和取样等设备，也都要与外界隔离。培养容器多为管状，也有池状，用有机玻璃或透明的聚乙烯所料做成水平管道，直立或斜立在地上，暴露阳光或人工光照下。这种培养方式，成本高，好控制，产量亦稳定。

1.2开放式培养

将藻类培养于敞开的容器(如水泥池、管道、木盆等)中。方法设备较简便，可进行小量或大面积的培养。该法培养物中易发生敌害生物污染，但成本低，使用较普遍，也是今后藻类培养所应采取的方式。开放式可分如下几种类型：

(1) 开放循环培养：其特点式培养液借助循环水泵而不断循环流动。培养物能循环，就可省却搅拌工作。

(2) 开放非循环培养：其特点是培养液不循环流动，而定时由小管通入CO2和空气到培养液中；同时也起搅拌作用。此法在大面积培养中使用较普遍。优点是设备简单，无需动力，水泵及大量的CO2及通气设备。

(3) 半开放循环培养：半开放培养是指培养容器或池，槽等场所虽仍敞开，但有些部分密闭，或用塑料布覆盖。这种培养方式，利用管道，依靠动力，使培

养液流动和通入含二氧化碳的空气。该方式设备复杂，但效果较好。

2 藻种的分离

为了要进行某种藻类的科学研究活大量培养，有必要把某种藻类与其他生物分离。分离培养藻种，可分为两大类，一为单种培养，即藻类虽只有一种，但还混杂细菌。另一为纯培养，即不仅藻类只有一种，亦无其它任何生物。纯培养比较困难，一般的分离培养往往只能做到单种培养。

主要根据培养的目的要求，及某一种类的生物学特征。藻类的分离主要有以下几种常用方法。

2.1 离心法

将混合液用离心机离心，水中不同藻体及细菌就以不同的速度下沉，因此得以分开。这样将不同时间下从导管底的藻体取出，经镜检选定某种藻类最多的沉积物，再加清水，继续离心，如此反复就可得到比较单纯的藻体，在接种相应培养液中培养。该法可消除细菌，并增加纯粹分离的可能性，至少可作为藻种平板培养的准备工作。另外，在水液中藻体含量较少时，可用此法集中藻体。但此法不能做到使不同藻类完全分离。

2.2 稀释法

该方法用已消毒试管5只，在第一管盛蒸馏水10mL，第2～5管都装5mL，用高压蒸汽消毒，待冷却后，第1管用滴管滴入混合藻液1～2滴，充分振荡，使均匀稀释。每次用消毒吸管，从第1管中吸取5mL滴入第二管中如前振荡，使均匀稀释。以后依次同样滴入第3～5 管，并都充分均匀稀释。然后把五个已盛又消毒的琼胶培养基培养皿，加热使之溶解，待冷却而尚未凝固时，分别滴入五个试管的藻液各一滴，用力振荡，使藻液充分混乳培养基中。待冷凝后，把五个培养皿放在受着漫射光窗口，一直到出现藻群时为止，在20℃左右时，约10天即出现藻群。用消过毒的白金丝取些藻群，进行琼胶固体培养基的不通气培养。此过程反复多次，直至得到完全分离的纯藻种群为止。此法稀释要使用较多容器分组培养，比较麻烦，但较易成功。

2.3 微吸管法

将水样在载玻片上滴成绿豆粒大小的一些水滴，这样可使每个水滴中有很少生物而便于分离；在解剖镜下用微吸管(口径小至0.008～0.16 mm，圆口，可自行拉制)。将要分离的藻体吸出，用蒸馏水或平衡矿物质溶液冲洗数次，然后主导成有培养基的小培养皿中培养，待生长旺盛后，再扩大培养。此法较适用于能运动的藻类。

2.4 趋向法

利用藻类的特殊趋向性(如向光，向地等)不同而分离藻体。此过程反复几次就可得到一定纯度的藻体。分离效果较好，只是不能应用于不运动的藻体。2.5 平板分离法

在培养液中加入战培养液1.5%的琼胶，加溶解后，注入培养皿中，加盖后用15磅压力121℃灭菌20分钟，即制成胶质培养基(也可用硅酸胶和明胶制备)。在琼胶培养基放在40℃以下的水浴锅内，开改用吸管注入混合藻液，摇匀，使之分散在培养基平面上。之后，可放在恒温箱内，用荧光灯照射，使藻群生长。再经镜检，反复此法不断提纯，即可分离出较纯的藻种。

2.6 固氮蓝藻分离培养法

将一小片藻丝群接种到培养基上，几天后再用灭菌白金丝挑取生出的新藻丝接种到平板培养基上。这样经几次分离接种就得到较纯的藻种。

3 藻种的选择、接种和保存

3.1 藻种的选择

虽然藻类种类较多，但其中仅少数经过人工培养。应该研究在室外培养其他藻种的可能性和他们生产的潜力，所选择的生物种应具有下列特征：

(1)生长迅速；

(2)对极端的温度和辐射条件的耐性范围大；

(3)蛋白质,脂类和糖类含量高,或有选择地积累一种特殊的代谢产物(如甘油)；

(4)无毒性,且易于收获。

根据系统的要求和特殊的方法，还可有其他要求。

3.2 接种

再分离到单纯藻群后，就可接种到培养液中进行培养，进而移养扩大培养。接种方法有液体接种和干藻接种。前者是将藻液直接加入培养液中进行搅拌，加入的藻种分量视水温而定，水温较低(10℃以内)时，多加;约占培养液总量的30～40%左右，水温适宜时(25～30℃左右)，可加5～8%左右。后者是用干藻的藻体接种，接种量为0.1～0.2%。

3.3 藻种的保存

一旦藻种分离得到，就要保存好以便在一定的时间内供接种用。为此，要将藻种消毒，避免其他来源的污染。给以适当的光照和温度。在液体培养中，为了快速增殖，可用5400lx，再得到良好生长后(1～2周)，培养液移到更低的光照条件(540～1100lx)，以求缓慢生长及储藏。藻类在琼脂培养基上接种后的藻种，先给予2700lx光照6～7天，直到得到良好生长，然后移到540～800lx光强的地方。大多数藻类保存在室温下(15～20℃)即可，少数造中存活需较高温度。藻种接代一致的频率视物种及贮存条件而不同，单胞藻及丝状不运动的物种可以每六个月到十二个月移种一次，有鞭毛的物种移种次数要更频繁些。某些藻种曾成功地做到了在液氮下长期保存。

4 藻类培养管理及采收方法

藻类培养的管理包括培养基养料的补给，光照及温度调节，CO2的补给，搅拌，防污等。在培养过程中，补给的养料，要选择肥效速，并有持久性，来源较广，价格低廉的种类。一般都以有机肥料为补肥、光照、温度的调节视种类及季节而定。室内照光一般都采用白炽电灯和荧光管。温度调节一般采用室内用白炽灯照射培养物或用温室，安装电热管等升温，室外冬季升温较困难，主要采用玻璃棚；用冷水管道降温，或经通风遮阳降温。

CO2的补给一般通过空气压缩机或橡皮管将含5%CO2的空气通过培养物中。搅拌使藻类培养不可少的一道工序.搅拌可使培养物均匀分布，水温均匀，利于

藻类生长，搅拌的方法一般为人力搅拌，风力搅拌，空气搅拌和磁力搅拌。此外还有循环流动法。防污在藻类培养中很重要，对杂藻及细菌的防治主要采用石灰，漂白粉，硫酸铜等试剂，用1～0.5ppmCuSO4防值杂藻的效果较好，当有浮游动物污染时，可施用化学试剂，杀虫剂等杀灭，如硫酸铜1～2ppm可杀灭轮虫，纤毛虫；漂白粉4ppm对各种虫类均有效；食盐9‰，可杀灭轮虫；碘液5‰，再稀释到十万分之一，可杀灭纤毛虫。培养物的采收的时间要适当，主要根据其密度大小决定，采收的方法有：

4.1 理浓缩

(1) 离心法：国外使用最普遍。它利用离心力来把藻体与水液分离，是藻体下沉达到浓缩目的。主要工具是离心机。

(2) 重力沉降法：利用重力使培养物下沉而得到浓缩物。使用的工具是沉淀器。

(3) 遮光法和降温法：对趋光性强的藻类，如衣藻等进行遮蔽光线，使培养物下沉而得到浓缩物。低温使藻类也有下沉现象。

4.2 化学浓缩法

用沉淀剂如明矾，石灰等，使培养物下沉，而得到浓缩物。明矾0.3～0.4‰，将之研碎，加入培养物中搅拌，半小时培养物大部分下沉，在6～12 小时后，全部下沉。石灰一般是将其1斤溶在100～200斤水中，制得饱和石灰水，其用量是6%。但该两法沉淀的藻浓缩物的灰分较多。

此外，较大体积的种类，如丝状体，非浮游性的藻类等可用过滤法采收。采收后的藻浓缩物即可经干燥加工成饲料或其他原料。

5 分析技术

5.1 细胞计数—显微镜法

培养物中的个体数测定，是按照个体计数方法，测定和估计培养物单位容积中的个体数。计数方法同浮游植物定量的方法。此外，也可以采用血球计数法。

5.2 分光光度计法

培养物的藻类密度也可用分光光度计测定。当藻类密度较低时，光径中的细胞数与测量到的光密度有一简单的几何关系。在藻类密度不大时，光密度大，细胞数目就多，即可用测得的光密度值表示细胞数目。

5.3 干重测定

测定干重的增加量是生产估测方法中的一个最直接的方法，其步骤如下：(1) 取样—从藻体培养液中取出有代表性的一小部分体积的藻液，取样时在以下三点上要特别注意：a.将培养物搅拌均匀 b.快速吸取样品以免沉积 c.足够多的样品

(2) 分离—取出样品后，用过滤膜过滤或用离心法把藻体与介质分开。细胞必须洗过以除去盐分和其它污物，通常是用稀释的培养液或缓冲液。海洋藻类不能用蒸馏水洗，以免质壁分离和细胞胀破。

(3) 干燥—选择对特定有机体最适的烘干温度. a.避免过热 b.有好的重复性 c.

对同一样品增烘1小时后，称得统一重量。

(4) 测定结果的表示法所得干重测定值要以单位培养液体积的干重表示，室外的培养池则用单位照光面积的干重来表示。

2 配制藻类培养液的几条原则

（1）要有适量氮源（除固氮蓝藻外），如氨盐、硝酸盐、有机氮等。硝酸盐、氨和尿素常用作配方中的氮源，根据造中的性能和pH的最适点而定。藻类的生长主要依赖氮的可利用性。大多数微型藻干物中含有7～9%的氮。因此在1 L培养液中生产10g细胞就至少需要500～600mgL-1KNO3。

（2）碳源：无机碳通常是用含1～5%CO2的空气来供应的，碳的另一种供应办法是用碳酸氢盐。选用何种办法主要是根据藻类生长的pH最适点而定。

（3）应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等。

（4）要考虑各种盐类总浓度和pH是否适合藻类需要，可用碳酸氢钠调节pH。通常用偏酸的pH 值来避免钙镁和其它微量元素发生沉淀。

（5）要加入各种藻类需要的微量元素，如铁、锰、铜、锌等（后几种包括

在土壤抽出液中）。培养基中的微量元素通常是用早已证明有效浓度的混合溶液来提供的(浓度在μgL-1级范围)。然而，这些微量元素的组分对藻类生长是否必须却不能总能显示。为增加微量元素的稳定性，常用柠檬酸盐和EDTA作为螯合剂。

（6）要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅。

（7）要添加适量生长物质如维生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。

3 培养基配制

目前绿藻、栅藻、小球藻作为大型枝角类食藻虫的培养驯化食物，在实验室人工培养中，主要使用M11、BG11或水生四号培养基。

3.2 M11培养基

M11是实验室蓝绿藻培养常用培养基，其配置成分如下表：

3.3 BG11培养基

实验室常用BG11培养蓝绿藻，但四尾藻、月牙藻用此培养基更好，其配制成分如下表：

3.4水生四号

水生四号即常用的水生四号培养液，为单细胞绿藻（栅列藻）培养液。其配方如下所列：

(NH4)2SO4 0.200g

Ca(H2PO4)2·H2O+2（CaSO4·2H2O）0.030g

MgSO4·7H2O 0.080g

NaHCO3 0.100g

KCl 0.025g

FeCl3 (3%) 0.150mL

土壤浸出液0.500mL

蒸馏水1000mL

藻类接种及注意事项：

1.试验用三角瓶（500ml）酸缸浸泡洗净，之后放入培养基，培养基的量在总容

积的1/3（200ml）左右，一般我们购买的藻种浓度很高时，接种时接入5ml 即可。

2.121℃下，高压灭菌锅内灭菌30min。

3.灭菌完成后，等瓶中的培养基完全冷却后，根据需要开始接入藻种。

4.接种过程应在无菌操作台中进行，并且之前要对操作台进行30min的紫外灭

菌。（注意，不可将藻种暴露于紫外灯下）

5.在24-27℃下，光照2000lux左右光照下进行培养。如藻量培养量大（10L瓶

子，则需要曝气）。不曝气的情况下，则需人工摇动3-4次/天。