抗氧化酶的测定技术
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法
一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）
1、试剂的配制
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4?12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4?2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。
酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入2ml 0.05mol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定
（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；
（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中
（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；
同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。
（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。
SOD总活性＝/（1/2Ack×W×Vt）
SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack 为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS 的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。
二、POD、CAT酶活性的测定
粗酶液制备同SOD。
1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）
（1）试剂配制：
0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 ) 877ml 混匀即为1000ml PBS(0.2M，pH6.0)；
（2）反应混合液配制（以60个样为准）：
取200ml PBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml 30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。
（3）样品测定：
取3ml反应液并加入30μl酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40秒）。（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）每30S读数一次。
（4）酶活性计算：以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。
POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g min)
ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。
2、过氧化氢酶（CAT）活性测定
（1）试剂配制：
0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。
（2）反应液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。
（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。
（4）酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
CAT=/（W×Vs×0.01×t）(u/g min)
ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。
四、超氧阴离子自由基（O2-）产生速率的测定（羟胺氧化法）
1、试剂的配制
（1）1mM盐酸羟胺溶液：称取0.02085g盐酸羟胺用蒸馏水定容至300ml；
（2）17mM对氨基苯磺酸溶液：称取1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加热溶解后定容至400ml；
（3）7mMα-萘胺溶液：称取0.4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1配制）定容至400ml。
2、O2.-含量的测定
（1）样品液提取方法同SOD测定；
（2）取0.5ml提取液（酶液）（可视情况调整用量）中加入0.5ml PBS（0.05M，pH7.8），1ml 1mM盐酸羟胺溶液后摇匀。
（3）在25℃下保温1小时；
（4）依次先加入1ml 17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM α-萘胺，混合后快速摇匀；（5）在25℃下保温20min后在3000×g下离心3min后马上进行测定（或置于冰箱待测）；（6）以对照管调零（用水调零），取粉红色水相液测定OD530值（测定）；
（7）O2.-含量的计算：由测得的OD530，查NO2-标准曲线得到；根据羟胺与O2.-的反应式：NH2OH＋2O2.-＋H+ NO2-＋H2O2 ＋H2O 计算，即×2=；再根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得O2.-产生速率（以nmol min-1mg-1蛋白表示，也可以nmol min-1g-1鲜重表示）。
O2.-产生速率=（C×V）/（t×W）（nmol min-1g-1鲜重）
C为标准曲线上查得的浓度(umol/L)；V为测定时所取提取液用量(叶绿体稀释后的体积)；t 为反应时间(60min)；W为样品鲜重(叶绿体实际质量g)
参考文献：王爱国，罗广华．植物生理学通讯，1990，（6）：55～57
五、丙二醛含量的测定
1、试剂配制：
10%TCA：100g 三氯乙酸→ 1L
0.67%TBA：3.35g硫代巴比妥酸→ 500ml 10%TCA （避光）
2、测定步骤:
0.2 样品+1.6ml 10%TCA 研磨→12000g 离心10min →上清1.5ml +1.5 0.67% TBA →沸水煮30min →冷却，离心→上清OD450，OD532，OD600
3、计算组织中MDA含量：
MDA浓度C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450
MDA含量(umol/g FW)=C×V/W
式中V为提取液体积(1.6ml)，W为样品鲜重(0.2g)。
六、植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）
（1）取新鲜叶片或根系（不能萎蔫）0.3g，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后用吸水纸吸干水分；
（2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或15ml大离心管）中，加10ml去离子水，在室温下放置3h使叶片充分吸水后测定溶液电导率(R1)；
（3）再放入恒温水浴锅中在100℃沸水浴中煮20min以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率(R2)；
（4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：
相对电导率（%）=R1/R2×100%
还可以计算植株伤害程度：
伤害率=（处理电导率—对照电导率）/（煮沸电导率—对照电导率）×100%
七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）
1、试剂的配制
（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50 ml 90％乙醇中，加入100 ml 85％（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1Ｌ。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。
（2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40ml用蒸馏水定容至100 ml（也可取10mg BSA定容至100ml即为100μg/ml 标准BSA溶液）。
标准曲线的制作：
配制0～100μg/ml血清白蛋白血液
管号 1 2 3 4 5 6
100μg/ml牛血清白蛋白(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水量(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
蛋白质含量（ml） 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
配制0～1000μg/ml血清白蛋白血液
管号 7 8 9 10 11 12
100μg/ml牛血清白蛋白(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水量(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
蛋白质含量（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.1ml 酶液（做三个重复）+ 2.9ml考马斯亮蓝G-250―――混匀，放置2min后在595nm 下比色。
2、样品可溶性蛋白含量的测定
（1）样品可溶性蛋白含量测定：取20μl提取液（酶液）加入80μl，0.05M，pH7.8磷酸缓冲液（即稀释成0.1ml提取液），再加入2.9ml考马斯亮蓝溶液，反应2min后测OD595（以
100μl缓冲液加2.9ml考马斯亮蓝为对照调零）。
（2）蛋白质含量计算：
可溶性蛋白质含量（mg/g）=(C×VT)/(W×VS×1000)
C为标准曲线查得的蛋白质含量（μg）；VT为提取液总体积（稀释后的体积ml）；VS为测定时所用提取液体积（ml，20μl）；W为样品鲜重（g）。
八、彗星实验
采用机械分离方法分离植物细胞核：植物组织放人预冷的培养皿中，冰上冷冻10min，加人一定体积缓冲液，机械分离叶片细胞核，以缓冲液充分冲洗叶片使细胞核游离，并倾斜培养皿使细胞核聚集，吸取30斗L细胞核的悬浮液加入一定的溴化乙锭染色后于荧光显微镜下观察或进行彗星实验．机械分离方法分别采用Sorensen buffer、1×PBS、0．4tool?L～Tris—HCl 3种缓冲液进行
机械法分离细胞核取处理过的根尖或幼苗叶片切成适当大小.以烟草叶片为例，切成1cm×2cm 放于事先在冰上预冷的直径60cm 培养皿中，以250μL（400mM、pH7.0）Tris-HCl 或1×PBS 展开，用新的不锈钢刀片在叶片或根尖上轻划，并用缓冲液反复冲洗即可将游离出来的细胞核从叶片或根尖上冲洗到缓冲液中，操作中注意将培养皿倾斜放置以达到富集细胞核的目的，此外，操作要在微暗或黄光下进行，避免分离过程中造成人为的细胞核损伤。
几种抗氧化酶的作用
一.超氧化物歧化酶(SOD): 超氧化物歧化酶，是一种新型酶制剂，是生物体重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体清除自由基的首要物质。SOD在生物体的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！ 超氧化物歧化酶(SOD)按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜（Cu）锌（Zn）金属辅基的称（Cu.Zn—SOD），最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞；第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。 SOD是一种含有金属元素的活性蛋白酶。超氧化物岐化酶（SOD）能催化如下的反应：O2-+H+→H2O2+O2，O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。SOD是机体天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶（POD）会立即将其分解为完全无害的水。
这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。 目前，人们认为自由基（也称游离基）与绝大部分疾病以及人体的衰老有关。所谓的自由基就是当机体进行代时，能夺去氧的一个电子，这样这个氧原子就变成自由基。自由基很不稳定，它要在身体组织细胞的分子中再夺取电子来使自己配对，当细胞分子推出新一个电子后，它也变成自由基，又要去抢夺细胞膜或细胞核分子中的电子，这样又称会产生新的自由基。如，超氧化物阴离子自由基、羟自由基、氢自由基和甲基自由基，等等。在细胞由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能。它能引起蛋白质变性和交联，使体的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代失常等，最终使机体发生病变。因此，自由基作为人体垃圾，能够促使某些疾病的发生和机体的衰老。虽然自由基会对机体产生诸多危害，但是在一般的条件下人体细胞也存在着清除自由基、抑制自由基反应的体系，它们有的属于抗氧化酶类，有的属于抗氧化剂。像SOD就是一种主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自由基，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及预防衰老等方面起着重要作用。 SOD能专一地清除体有害的自由基，以解除自由基氧化体的某些组成成分而造成的机体损害。如氧中毒、急性炎症、水肿、自身免疫性疾病、辐射病等疾病都与活性氧的毒性有关。实验证明，SOD能够清除自由基，因此可消除上述疾病的病因。此解毒反应过程是两步：
SOD酶活性测定方法
SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）
抗氧化酶活性等测定方法
叶绿体得提取 一、试剂配置 １、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用
植物提取物抗氧化成分及研究进展
植物提取物抗氧化原理及成分研究 抗氧化是抗氧化自由基的简称。因为人体常与外界接触，平时的呼吸、外界污染、放射线照射等因素会导致人体内产生自由基，过量的自由基会导致人体癌症、衰老和其它疾病，而抗氧化自由基（以下简称“抗氧化”）可以有效克服这些危害。因此，抗氧化已成为保健品和化妆品市场的主要研究课题之一。 本文从多种类植物提取物抗氧化成分及其原理出发，阐述了各界近年来利用植物对抗自由基的研究进展。 一、植物提取物抗氧化原理 不同的植物提取的有效成分不尽相同，同样，抗氧化作用的植物提取物也有很多不同成分，其作用机理也有所区别，西安源森生物从以下几方面进行了总结阐述： （一）作用于与自由基有关的酶 与自由基有关的酶类分为氧化酶与抗氧化酶两类，植物提取物的抗氧化作用体现在抑制相关氧化酶的活性和增强抗氧化酶活性两方面。 1. 抑制氧化酶的活性 生物体内许多氧化酶，如P-450 酶、黄嘌呤氧化酶(XOD)、脂氧化酶、髓过氧化酶(MPO)和环氧酶等，与自由基的生成有关，能诱发大量的自由基。 另外，诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)在缺血再灌注时活性增加，产生大量NO而导致氧化损伤。 研究表明，许多植物提取物对上述各种氧化酶有抑制作用，从源头抑制自由基生成。黄酮类化合物中的槲皮素、姜黄素在缺血再灌注损伤时可抑制iNOS 的活性，从而起到抗氧化作用；绞股蓝皂苷可以降低异常增高的XOD 和MPO 的活性，改善糖尿病大鼠肾脏的氧化应激，延缓肾脏损害的进展。 2. 增强抗氧化酶活性 机体存在具有防护、清除和修复过量自由基伤害的抗氧化酶类，如过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶等。SOD 是体内超氧阴离子的主要清除者，将其催化分解为H2O2，但H2O2也具有氧化损伤作用，CAT 将其转化为O2和H2O。同时H2O2也可通过GSH-Px 的催化和还原型谷胱甘肽(GSH)反应生成H2O，同时生成氧化型谷胱甘肽。 许多研究表明，植物提取抗氧化成分不仅能防护体内抗氧化酶，还能增强机体内抗氧化酶活性，如黄酮类中的槲皮素能减少胰岛β细胞的氧化损伤，同时还能恢复Fe2+致肾细胞损伤动物的SOD、GSH-Px 和CAT 的活力；皂苷类物质对氧自由基本身影响较少，但大多能提高体内SOD、CAT 等抗氧化酶的活性，从而增强机体抗氧化系统功能。 此外，一些天然物质可在基因与转录水平上诱导体内抗氧化酶如SOD 的表达，发挥其抗氧化作用。 （二）抗氧化成分之间互补和协同作用 植物提取物抗氧化成分之间存在相互补充、相互协调的关系，在体内通过电子和/ 或质子转移、作用于氧化酶和抗氧化酶、螯合钝化过渡金属离子、影响基因表达等途径联合发挥抗氧化作用。 研究发现不同浓度的茶多酚和西洋参之间均存在明显的协同增效作用，并且随着浓度上升，协同增效作用也相应增强。VE 和VC对鹰嘴豆抗氧化多肽的还原能力有显著的增效作用，且VC与鹰嘴豆抗氧化多肽的协同作用较VE更强，所有的协同作用随添加量和作用时间的增加而增强。 （三）直接清除或抑制自由基 植物提取物能够作为氢质子或电子的供给体，直接猝灭或抑制自由基，终止自由基的连
植物病毒检测技术研究进展汇总
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法
抗氧化酶 S O D P O D C A T活性测 定方法 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液 （pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na 2HPO 4 ·12H 2 O（分子量 358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH 2PO 4 ·2H 2 O（分子量 156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na 2HPO 4 ) 228.75ml，B母液(NaH 2PO 4 ) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。 参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）130mM甲硫氨酸溶液：取1.9399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 （3）100μM EDTA-Na 2溶液：取0.03721gEDTA-Na 2 用磷酸缓冲液定 容至1000ml。 （4）20μM核黄素溶液：取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml，避光保存。 （5）750uM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.06133g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 2、酶活性测定 （1）取10ml试管（要求透明度好）
几种抗氧化酶的作用
一?超氧化物歧化酶(SOD): 超氧化物歧化酶，是一种新型酶制剂，是生物体重要的抗氧化酶, 广泛分布于各种生物体，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体清除自由基的首要物质。SOD在生物体的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损塞，并及时修复受损细胞。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD 的地位越来越重要！ 超氧化物歧化酶(SOD)按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜(Cu)锌(Zn)金属辅基的称(Cu.Zn—SOD),最为常见的一种酶，呈绿色， 主要存在于机体细胞浆中；第二种是含猛(Mn) 金属辅基的称(Mn—SOD),呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞；第三种是含铁(Fe)金属辅基的称(Fe-SOD),呈黄褐色, 存在于原核细胞中。 SOD是一种含有金属元素的活性蛋白酶。超氧化物岐化酶(SOD)能催化如下的反应：O2-+H+fH26+6,。2淋为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种,具有极强的氧化能力，是生物氧毒塞的重要因素之一°SOD 是机体天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有蚩的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有蚩的活性氧，但体的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会 立即将其分解???专 为完全无蚩的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。 目前，人们认为自由基（也称游离基）与绝大部分疾病以及人体的衰老有关。所谓的自由基就是当机体进行代时，能夺去氧的一个电子，这样这
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）L磷酸缓冲液(PBS，： A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g； B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。 （3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。 （4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 （5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取 NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 2、酶活性测定 （1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀； （2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中 （3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min； 同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。 （4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。 （5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在
植物病毒分子检测方法概述
植物病毒分子检测方法概述 邵碧英 (福建出入境检验检疫局 福州 350001) 植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。 CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。 1 以病毒外壳蛋白为基础的检测方法 植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。 111 酶联免疫吸附反应(EL ISA) EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。该方法已被用于各种植物病毒检测。 后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。 EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。 112 斑点免疫吸附法 20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。也已用于各种病毒检测。 斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。 113 直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。 鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。徐明全等[3]采用IDD TB法从兰花叶片中检测到建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus。把石斛兰叶片从叶尖至叶尾每0.5cm切割1次并压印在膜上,检测结果可直接显示出感染病毒的具体部位。 组织印迹法明显比EL ISA和DIBA的试验程序简单、快速。但病毒在植物的不同部位分布不均匀,同一样品要重复多次,以提高检测的准确性。 114 电印迹免疫分析(EBLA) 电印迹免疫分析方法首先用SDS2PA GE 分离病毒CP,把蛋白带转移到膜上,再进行抗原杭体反应,根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。 EBLA和EL ISA、DIBA相比具有明显的优点,通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来,排除了杂蛋白的干扰,可检测低浓度的植物病毒。此方法 — 7 7 3 —
土壤酶活性测定方法综合
土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作 与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验 试剂纯度和基质自身分解。
抗氧化酶测定实验方法
植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定 一、原理 植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。 丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。 二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在 450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为： Y532＝-0．00198十0．088D450 (44—1) D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。三、材料、仪器设备及试剂1、[仪器设备]紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：10ml1支，2ml1支；剪刀1把。
植物病毒病检测方法
植物病毒病检测方法 植物病毒病是农业生产上一种重要病害，严重影响农作物的产量和质量, 目前还没有1种治疗效果较理想的药剂，对发病植株做到早期诊断及提前检测就显得尤为重要。植物病毒学历经近百年的发展，植物病毒的检测方法与手段也在不断发展与改进。常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法等。 1.4.1侵染力测定法 侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上，根据侵染力的大小定量。它的灵敏度在所有定量法中是比较高的，而且是其他定量法的基础。设计一种新的定量法，如果不经过侵染力的验证，将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系统感染率的测定法等。侵染力测定多用粗汁液来接种，为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围，须用缓冲液稀释接种物。 局部枯斑法1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟（Nicotiana glutinosa）接种叶片上引起局部坏死斑点，在一定的病毒浓度范围内，所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础（田波，1987）。所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法，但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外，还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。 淀粉－碘斑法当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时，采用此法。Holmes（1931）发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块，但不能用于计数。将这种接种叶用95％乙醇加热到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色时，则侵染点处出现淀粉－碘的蓝色反应。当下午采摘叶片，褪色过夜，然后用碘液染色，则侵染点较周围组织着色浅；当采摘叶片前，植株先在黑暗中放几个小时，再用碘液染色，则侵染点组织着色深。这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物从光合组织中的运出。淀粉－碘染色的强弱受环境条件的影响较大，不如局部枯斑法可靠，但在标准化条件下仍可用于侵染性的定量测定。 侵染性滴度法当上述方法都不适用时，可采用侵染性滴度法。即把欲测定样品用缓冲液稀释，可用十倍稀释、成倍稀释、半倍稀释或更低稀释。这种方法的缺点是需用大量实验
抗氧化酶的作用
重要的抗氧化酶和抗氧化剂的作用 超氧化物歧化酶（SOD）是美国的McCord和Fridovich在1969年发现的一种清除超氧阴离子自由基的酶。SOD是一种广泛存在于生物体内的金属酶，按金属辅基的成分不同主要分成三类,第一类含铜和锌，称为CuZn-SOD，是最常见的一种，呈蓝绿色，主要存在于真核细胞的细胞浆内。第二类含锰，称为Mn-SOD，呈粉红色，主要存在于原核细胞体、真核细胞的细胞浆和线粒体内。第三类含铁，称为Fe-SOD，呈黄褐色，主要存在于原核细胞中。另外，在牛肝中还发现一种CoZn-SOD[8]。 正常生理状态下，机体产生的自由基和清除自由基的速率处于动态平衡状态。但当机体内自由基产生增多，就会对机体的蛋白质、脂质和DNA造成损伤，导致机体疾病的发生。SOD是生物体内对抗氧自由基的一种最重要的抗氧化酶，是专门清除超氧阴离子自由基的。它的作用是将氧自由基歧化，发生2O2- +2H+ SOD H2O2 + O2的反应。由于H2O2 在SOD活性部位生成，会对SOD本身产生杀伤。催化产生的H2O2 如果不被及时清除，它会与O2-反应生成毒性更大的羟基自由基。衰老自由基学说认为，代谢产生的自由基对机体造成的损害可引起衰老，SOD可有效的清除自由基，在一定程度上延缓衰老。此外，SOD还具有增强机体免疫力，提高机体对自由基引发的疾病的抵抗力，消除运动性疲劳等生理功能[3]。 过氧化氢酶（CAT）是一种末端氧化酶，广泛存在于动植物和微生物体内，酶分子结构中含有铁卟啉环，1个分子酶蛋白中含有四个铁原子[9]。CAT的生物学功能是催化过氧化氢分解为水和氧，2 H2O2 CAT 2H2O + O2 。过氧化氢酶（CAT），广泛存在于动植物和微生物体内的一种末端氧化酶。它的生物功能是催化细胞内的过氧化氢分解，起抗氧化作用，即2H2O2 2H2O+O2，它可防止过氧化氢含量过高对机体组织造成损伤，对细胞起到保护作用。 本研究结果显示，力竭运动后，大鼠的心组织、肝组织和肺组织中CAT活性均表现出升高，这可能是由于运动应激造成大鼠组织过氧化物质增多，使得组织CAT活性对应升高。同时，结果显示，联合补充谷氨酰胺和番茄红素对力竭运动大鼠肝组织和肺组织的抗氧化能力提高的效果最为明显，而单纯补充番茄红素对心脏
纤维素酶活力测定方法_张瑞萍
测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn
实验 15 植物病毒病害抗性鉴定
实验15 植物病毒病害抗性鉴定 植物病毒是导致粮、菜、果、花卉产量下降、品质变劣的重要原因之一。自1892年俄国Iwanowsky发现烟草花叶病毒以来，己被正式命名的植物的病毒789种，并明确病毒只含有一种类型的核酸，即核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）， 70年代后发现了只含有小分子量 RNA、不含蛋白质、侵染活性很高的类病毒25种，80年代后发现了含有线状病毒基因组RNA和与类病毒相似的环状RNA的拟病毒40种。 植物病毒种类多，繁殖速率快，传播途径广，并且缺少有效防治药剂和措施。因此，植物病毒病一旦流行，危害之重，己超过真菌、细菌病害。因此，加强植物病毒研究，减轻植物病毒危害，对国民经济的发展具有重要意义。 本实验重点学习目前普遍采用的几种植物病毒病害检测及抗性鉴定的方法及步骤。 一、试材及用具 1．试材发病的植物组织及家兔等。 2．仪器及试剂高速冰冻离心机，离心管以及分子量为6000的聚乙二醇（PEG6000）、氯仿等。 二、方法步骤 （一）病毒检测 可用于植物病毒检测的方法主要有生物学测定、血清学检测、电镜检测、免疫电镜以及酶联免疫吸附反应（ELISA）、免疫PCR等分子生物学方法，其中血清学检测是快速、准确、 图5－1 病毒抗原的分离与纯化
灵敏度高、成本低的病毒检测方法，可用于实际检验检测工作中去。本实验重点介绍，其它方法可查阅有关文献资料。 利用血清学技术进行病毒检测，主要依据血清学反应（免疫学反应），即抗原与抗体之间发生的各种作用。抗原指的是能诱导产生抗体的一类物质，它可以是病毒、细菌、真菌、植物菌原体等微生物，也可以是酶类、DNA、RNA、类脂、多糖等有机化合物，甚至还可以是叶片、枝条等各类组织。抗体是指由抗原注射到动物体内诱导产生的、并能与抗原在体外进行特异性反应的一类物质，庄要是一些免疫球蛋白。含有抗体的血清通常称为抗血清。抗原能与由其诱导产生的抗体发生凝集、沉淀等反应，利用病原物中特异性强的抗原与相应的抗体反应，就能实现对病原物（病毒）的检测、鉴定。目前国际上己制备出 200余种重要植物病毒抗血清。我国农业部植检所为满足植物病毒检疫的研究和需要，先后制备出 30余种植物病毒抗血清。因此，利用血清学技术检测病毒，主要包括如下三个环节：1．病毒抗原的分离与纯化利用高速冰冻离心机等设备以及聚乙二醇（PEG）、氯仿等化学药品，从冰冻的病组织中分离、纯化病毒抗原。其操作步骤如图5－1所示。 2．病毒抗血清的制备病毒抗血清的制备主要包括试验动物选择、抗原注射、血样采集以及抗血清的收集与保存等过程，可用图5－2表示： 图5－2 病毒抗血清的制备与保存 3．血清学反应将抗血清及抗原进行一系列稀释后，采用试管沉淀、小试管环状沉淀、玻片凝集、免疫双扩散、免疫电泳及荧光抗体等反应方法进行血清学反应，从而实现对病毒的检测与鉴定。 （二）病毒病抗性鉴定 病毒检测的对象是病原物（病毒），是对病毒定性（病毒的有无及其种类）与定量的分析鉴定，而抗性鉴定的对象是寄主，即植物品种或种质对特定病毒的抵抗能力。目前植物病毒病抗性鉴定所采用的方法，大都为大田病圃法。例如，刘琴等（2002）对110个小麦引进品种在自然病圃区进行了对小麦黄花叶病的抗性鉴定。主要做法是，每个品种分别播种，设置对照与重复，于病害发生期调查发病率。所采用的病情分级标准是： 1级 抗（R）：发病率0%～9.9%；
酶活性测定方法
酶活性测定 1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu) 2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu) 3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase) 试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷） 0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6) 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化
抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase ,APX)活性测定试剂盒 使用说明
抗坏血酸过氧化物酶（ascorbateperoxidase ，APX）活性测定试剂盒使用说明 微量法100T/96S 产品简介： APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化H 2O 2氧化AsA，是植物AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到AsA 的含量，在胁迫和解胁迫条件下，APX 与AsA 具有一定的负相关性。 APX 催化H 2O 2氧化AsA，通过测定AsA 的氧化速率，可计算得APX 活性。 试验中所需的仪器和试剂： 低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容： 试剂一：液体×2瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加3mL 蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体×1支，4℃保存。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 称取约0.1g 样品，加1mL 试剂一，冰上充分研磨，13000g 4℃离心20min，取上清液。 二、测定操作表： 1.分光光度计预热30min 以上，调节波长到265nm，用蒸馏水调零。 2.试剂一在25℃中预热30min 以上。 3.空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL 蒸馏水、140μL 预热的试
剂一、20μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。 4.测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、140μL预热的试剂 一、20μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。 APX活力计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：每克样品每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/g鲜重)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Wε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间（min），2min。 b.使用96孔板测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1μmol AsA为1U。 APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.1848×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：每克样品每分钟氧化1μmol AsA为1U。