蛋白酪氨酸激酶

Neratinib

伯舒替尼(Bosutinib，惠氏公司)是强效Src和Abl激酶双重抑制剂，既能抑制多种人肿瘤细胞中Src蛋白的自主磷酸化，也能抑制Src和Ab底物的磷酸化过程，具有高效的抗增殖活性，可抑制CMI。细胞的增殖和存活，对伊马替尼、达沙替尼和尼罗替尼等已产生耐药的CML，或ALL患者也取得了较好的疗效。目前，正在进行CML的Ⅲ期临床研究。

Motesanib(安进公司)能选择性地作用于VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR和c-kit受体，可致内皮细胞程序性死亡增加和血管面积减少，抑制肿瘤血管生成并诱导肿瘤消退。目前，本品NSCLC的Ⅲ期临床研究正在进行中；其GIST、甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌等适应证的研究也处于Ⅱ期临床研究阶段。

凡德他尼(Vandetanib，阿斯利康公司)是口服小分子EGFR、VEGFR、RET多靶点酪氨酸激酶抑制剂。Ⅱ期临床显示，单用或与多西他赛联合用药，其在NSCLC患者的二线／三线治疗中均有效。

Vatalanib(拜耳／诺华)是经高通量筛选出的VEGF、PDGF、c-kit多靶点小分子TKl，对VEGFR-2作用最强。与FOLFOX方案联合治疗转移性结直肠癌的2个Ⅲ期研究正在进行中。目前，发现体内乳酸脱氢酶水平较高的患者疾病PFS显著提高。

BIBtr 1120(勃林格殷格翰公司)是一种新的口服抗血管生成药，抑制VEGF、PDGF、FGF等的作用，目前分别开展了治疗晚期卵巢癌和NSCLC的Ⅲ期临床研究。

Axitinib(辉瑞公司)作为一种口服、强效血管生成抑制剂，同时靶向c-kit、VEGFR-1／2／3和PDGFRβ。2007年12月，本品在美国获治疗甲状腺癌孤儿药身份。目前，正在进行治疗胰腺、甲状腺和肾癌的Ⅲ期试验。Ⅱ期临床研究显示，对一线治疗后失败的转移性肾癌患者仍有效，该药可缩小索拉非尼治疗无效患者的肾肿瘤。

蛋白酪氨酸激酶综述

蛋白酪氨酸激酶综述目前至少已有近六十种分属20个家族的受体酪氨酸激酶被子识别。所有受体酷氨酸激酶都属于I型膜蛋白，其分子具有相似的拓朴结构：糖基化的胞外配体结合区，疏水的单次跨膜区，以及胞内的酪氨酸激酶催化结构域及调控序列。不同受体酪氨酸激酶结合，将导致受体发生三聚化，并进一步使受体胞内区特异的受体酪氨酸残基发生自身磷酸化或交叉磷酸化，从而激活下游的信号转导通路。许多肿瘤的发生、发展都与酪氨酸激酶的异常表达有着极其密切的联系，下面将对几类与肿瘤的发生发展最为密切的受体酪氨酸激酶的研究迸展做一简介。一、表皮生长因子受体（Epidermal grovth factor receptor, EGFR）家族 EGFRPE包括EGFR、ErbB2、ErbB4等4个成员，其家族受体酪氨酸激酶（RTK）以单体形式存在，在结构上由胞外区、跨膜区、胞内区3个部分组成，胞外区具有2个半氨酸丰富区，胞内区有典型的ATP结合位点和酪氨酸激酶区，其酪氨酸激酶活性在调节细胞增殖及分化中起着至关重要的作用。人的egfr基因定位于第7号染色体的短臂（7p12.3-p12.1），它编码的产物EGFR由1210个氨基酸组成，蛋白分子量约为170kDa，其中，712-979位属于酪氨酸激酶区。EGFR的专一配体有EGF、TGF、amphiregulin,与其他EGFR家庭成员共有的配体有（cellulin(BTC)、heparin-binding EGF(HB-EGF)、Epiregulin(EPR) ）等。 EGFR在许多上皮业源的肿瘤细胞中表达，如非小细胞性肺癌，乳腺癌、头颈癌，膀胱癌，胃癌，前列腺癌，卵巢癌、胶质细胞瘤等。另外，在一些肿瘤如恶性胶质瘤、非小细胞性肺癌、乳腺癌、儿童胶质瘤、成神经管细胞瘤及卵巢癌等中还可检测到EGFR缺失。最为常见的EGFR缺失突变型是EGFRⅧ，EGFR Ⅷ失去了配体结合区，但是可自身活化酪氨酸激酶，刺激下游信号通路的激活，而不依赖于与其配全结合。EGFR在许多肿瘤中的过表达和/或突变，借助信号转导至细胞生长失控和恶性化。另外，EGFR的异常表达还与新生血管生成，肿瘤的侵袭和转移，肿瘤的化疗抗性及预后密切相关。EGFR高表达的肿瘤患者，肿瘤恶性程度高，易发生转移，复发间期短，复发率高，患者的存活期短。 ErbB2，又名HER-2/neu，是EGFR家族的第二号成员，ErbB2通过与EGFR家族中其它三位成员构成异源二聚体，而发挥生物学作用，尚未发现能与其直接结合的配体。编码ErbB2的基因neu最早从大鼠神经母细胞瘤中分离得到，人类体细胞内neu基因的同源基因，又称为HER-2或erbB2，位于人第17号染色体的长臂（17q21.1），它编码的产物ErbB2由1255个氨基酸组成，蛋白分子量约为185Kda，其中，720-987位属于酪氨酸激酶区。 ErbB2通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达。然而在多种人类肿瘤中却过度表达，如乳腺癌（25-30%）、卵巢癌（25-32%、肺静癌（30-35%）、原发性肾细胞癌（30-40%）等。过度表达的原因主要是ErbB2基因扩增（95%）或转录增多（5%）。 1987年，Slamon等人首行先报道了ErbB2扩增和乳腺癌临床预后不良之间的显著关系，其显著性高于雌激素、孕激素等指标，并在以后的研究中得到大量证实。随后，ErbB2表达水平和乳腺癌治疗效果间的关系得到广泛研究，人们发现ErbB2高表达乳腺癌患者对他莫昔芬（tamoxifen）治疗、单独的激素疗法、以及环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟脲嘧啶联合化疗产生耐受。研究还表明，ErbB2在细胞的恶性转化中发挥重要作用，并能促进恶性肿瘤转移。ErbB2受体过度表达往往提示乳腺癌恶性程度高，转移潜力强，进展迅速，化疗缓解期短，易产生化疗和激素治疗抗性，生存率和生存期短，复发率高。和ErbB4对肿瘤的作用目前尚不清楚，但在肿瘤形成模型的临床前研究发现，ErbB3、Erb3与EGFR、ErbB2共表达后会使肿瘤恶性程度明显增加。二、血管内皮细胞生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）家族VEGFR家族的成员包括：VEGFR1（Flt-1）、VEGFR2（KDR/Flk-1）、VEGFR3（Flt-4）,这一家族的受体在细胞外存在着7个免疫球蛋白样的结构域，在胞内酪氨酸激酶区则含有一段亲水手插入序列。

酪氨酸激酶异常活化在恶性血液病发病中的作用(1)(精)

酪氨酸激酶异常活化在恶性血液病发病中的作用(1) 】蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase, PTK）在调节细胞生长、活化和分化的信号转导中起着重的作用。基因突变（多半由染色体移位）或者激酶的过度表达可使PTK活力异常增高，并介导异常的信号转导途径，在多种恶性血液病的发生发展中起着主的作用。在慢性骨髓增殖性疾病（CMPD）、急性髓性白血病（AML）和间变性大细胞淋巴瘤的发病中，均存在着PTK的异常活化。进一步研究PTK相关的恶性血液病的发病机理，可以加快特异性的分子靶向治疗的研究进展。【关键词】酪氨酸激酶恶性血液病；基因突变 Abnormal Activation of Tyrosine Kinases and Its Role in the Pathogenesis of Hematological Malignancies ——Review Abstract Protein tyrosine kinases are key participants in signal transduction pathways that regulate cellular growth, activation and differentiation. Aberrant PTK activity resulting from gene mutation (often accompanying chromosome translocation) or overexpression of these enzymes plays an etiologic role in several clonal hematopoietic malignancies. Other than the causative effect of PTK product of the bcr/abl fusion gene on chronic myelogenous leukemia (CML), more evidence suggests that mutated tyrosine kinases are pivotal in the pathogenesis of most of other chronic myeloproliferative disorders, such as chronic myelomonocytic leukemia (CMML) and hypereosinophilic syndrome (HES). And the exciting results in several dependent groups in 2005 showed that a single nucleotide JAK2 somatic mutation (JAK2V617F mutation) was found to be involved in the pathogenesis of polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and chronic idiopathic myelofibrosis (CIMF). In the leukogenesis of acute myeloid leukemias (AML), the losing of the control of the proliferation of hematopoietic progenitor cells was principally the results of the aberrant PTK activity, such as FLT3 and C kit overexpression. It works together with the loss of function mutation genes in promoting progenitor cell differentiation to confer AML's phenotypes. These upregulated PTK molecules represent attractive disease specific

蛋白酪氨酸激酶简介

蛋白酪氨酸激酶简介癌症极大威胁人类健康，抗肿瘤研究是当今生命科学中极富挑战性且意义重大的领域。目前，临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物，这类抗癌药具有难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药等缺点。近年来，随着生命科学研究的飞速进展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶作为药物筛选靶点，发现选择性作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。蛋白酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，可分为受体型和非受体型两种，它们能催化ATP上的磷酸基转移到许多重要蛋白质的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化。蛋白酪氨酸激酶在细胞内的信号转导通路中占据了十分重要的地位，调节着细胞体内生长、分化、死亡等一系列生理化过程。蛋白酪氨酸激酶功能的失调则会引发生物体内的一系列疾病。已有的资料表明，超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常表达将导致细胞增殖调节发生紊乱，进而导致肿瘤发生。此外，酪氨酸基酶的异常表达还与肿瘤的侵袭和转移，肿瘤新生血管的生成，肿瘤的化疗抗性密切相关。因此，以酪氨酸激酶为靶点进行药物研发成为国际上抗肿瘤药物研究的热点，为此投入的研究经费也是其它任何一个非传统的肿瘤靶点所无法匹敌的。目前为止，已有十多种蛋白酪氨酸激酶抑制剂和抗体进入I-Ⅱ期临床试验阶段，个别的已经上市，并取得了令人鼓舞的治疗结果。基中，Genentech公司和罗氏药厂联合研究和生产的HerceptinTM(Trastuzumab)是一种抗酪氨酸激酶受体HER2/neu的人源化的单克隆抗体。1998年，美国食品的药物管理局（Food and Drug Administration, FDA）正式批准Herceptin用于治疗某些HER2阳性的转移性乳腺癌。2001年5月，N ovartis公司研发的针对酪氨酸激酶Bcr-Abl的抑制剂GleevecTM (imatinib mesylate)由于对治疗慢性髓样白血病（chronic myelogenous leukemia,CML）具有非常好的疗效，尚未完成Ⅲ期临床就被FDA批准提前上市，用于治疗费城染色体呈阳性（Philadelphia chromosome – positive, Ph+）的慢性髓样白血病患者，引起了巨大的轰动。GleevecTM是第一个在了解癌症的病因后鸽是设计开发，并取得了显著成效和的肿瘤治疗药物，它的研发成功可以说是癌症治疗的一个里程碑。这一重大成就被美国《科学》杂志列入2001年度十大科技新闻。纽约《时代》杂志将其作为杂志的封面，称GleevecTM 开创了药物研发的新时代。2002年2月，美国FDA又批准GleevecTM 用于胃肠基质瘤（gastrointestinal stromal tumors, GLST）的治疗。2002年7月，AstraZeneca公司研发的IressaTM (ZD1839又被美国FDA批准用于治疗经过标准含铂类方案和紫杉萜化疗后仍然继续恶化的终未期非小细胞肺癌患者，这也是第一种用于实体瘤治疗的针对特定靶点挑战分子酪氨酸激酶抑制剂。Herceptin，Gleevec以及Iressa的上市进一步证明了以特定靶点尤其是以酪氨酸激酶为靶点进行抗肿瘤药物的研发是21世纪最有可能获得突破性进展的抗肿瘤药物领域，具有十分广阔的前景。

蛋白酪氨酸激酶

蛋白酪氨酸激酶(PTK)是多种肿瘤最常见的生长因子受体，抑制其活性可破坏肿瘤细胞的信号传导，抑制肿瘤细胞增殖和新生血管形成，而对正常细胞影响较小。常见的受体型包括表皮生长因子受体(EGFR)家族、胰岛素受体(IGFR)家族、血小板衍化生长因子受体(PDGFR)家族、VEGFR家族、纤维细胞生长因子受体(。FGFR)家族等。非受体型包括SRC、ABL、JAK、ACK、CSK、FAK、FES、FRK、TEC、SYK家族等。以PTK为靶点的单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是近年抗肿瘤药研究的热点。2005年之前，美国FDA批准以PTK为靶点的单克隆抗体曲妥珠单抗(1998年)、贝伐单抗(2004年)和西妥昔珠单抗(2004年)和小分子酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(2001年)、吉非替尼(2003年)、埃罗替尼(2004年)等靶向药物应用于临床。2005年后TKI制剂不断上市，且多靶点药已成为新的研究方向。 Neratinib 伯舒替尼(Bosutinib，惠氏公司)是强效Src和Abl激酶双重抑制剂，既能抑制多种人肿瘤细胞中Src蛋白的自主磷酸化，也能抑制Src和Ab底物的磷酸化过程，具有高效的抗增殖活性，可抑制CMI。细胞的增殖和存活，对伊马替尼、达沙替尼和尼罗替尼等已产生耐药的CML，或ALL患者也取得了较好的疗效。目前，正在进行CML的Ⅲ期临床研究。 Motesanib(安进公司)能选择性地作用于VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR和c-kit受体，可致内皮细胞程序性死亡增加和血管面积减少，抑制肿瘤血管生成并诱导肿瘤消退。目前，本品NSCLC的Ⅲ期临床研究正在进行中；其GIST、甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌等适应证的研究也处于Ⅱ期临床研究阶段。凡德他尼(Vandetanib，阿斯利康公司)是口服小分子EGFR、VEGFR、RET多靶点酪氨酸激酶抑制剂。Ⅱ期临床显示，单用或与多西他赛联合用药，其在NSCLC患者的二线／三线治疗中均有效。 Vatalanib(拜耳／诺华)是经高通量筛选出的VEGF、PDGF、c-kit多靶点小分子TKl，对VEGFR-2作用最强。与FOLFOX方案联合治疗转移性结直肠癌的2个Ⅲ期研究正在进行中。目前，发现体内乳酸脱氢酶水平较高的患者疾病PFS显著提高。 BIBtr 1120(勃林格殷格翰公司)是一种新的口服抗血管生成药，抑制VEGF、PDGF、FGF等的作用，目前分别开展了治疗晚期卵巢癌和NSCLC的Ⅲ期临床研究。

酪氨酸激酶体系顺口溜

酪氨酸激酶体系：胰岛素，生长激素，促红细胞生成素记忆：为了生计老暗算别人一刀，简直是个畜生血沉ESR加快：纤维蛋白质，球蛋白，胆固醇记忆：单纯（胆固醇）少女求（球蛋白）签（纤维蛋白）问红尘（红细胞血沉）单核细胞：3-8%,中性粒50-70%,淋巴20-40% 记忆：单身三八，中年无（5）妻（7），聆听儿诗红细胞生成素调节：BPA(爆式促进激活物)，促红细胞生成素，性激素，生长激素，甲状腺素记忆：一个畜生（促红细胞生成素）居然对生（生长激素）怀六甲（甲状腺素）的女人实施性（性激素）暴力，性激素：雄激素是正性，雌激素负性铅中毒：动力性肠梗阻，卟啉症记忆：铅可抑制ALA脱水酶和亚铁鳌合酶的活性蛋白质大部分是由肝脏合成的，除了Y-球蛋白是由浆细胞合成的记忆：将（浆）在外（Y）,君令有所不受失读症：角回受损-->独角戏（歌名）

感觉性失语症：颞上回受损-->驱赶余孽运动性失语症：Broca区-->洞与B联系起来，或Bro像brother,brother爱运动啊快痛-->传入纤维是A*纤维，慢痛C纤维，记忆：形状像豆芽，豆芽长的快，C纤维-->chronic是慢的意思凝血因子：IV->钙离子，V->易变因子记忆：武艺盖世凝血辅因子：IV，V，III，VIII 记忆：我师傅三八被消耗的因子：II，V，VII，VIII 记忆：浩霸占我妻儿内源性凝血：启动因子12,慢，单独凝血因子12,11,9,8,4，外源性凝血：启动因子3,快，单独凝血因子，3,4,7 记忆：123,3+4=7

生理性抗凝血酶III：丝氨酸酶抑制物-->9-12因子记忆：3+9=12 VitA的活性形式：视黄醇，视黄醛，视黄酸记忆：看（视）黄色的电影是看A片几乎所有的血浆蛋白均为糖蛋白，除了清蛋白，清蛋白与胆红素结合记忆：因为清蛋白清高，不愿与糖为伍，清蛋白-->清扫有毒物质-->与胆红素结合-->肝脏-->胆红素与Y,Z蛋白结合对凝血酶敏感的凝血因子：I,V,VIII,XIII 蛋白质C系统：蛋白质C(PC),凝血酶调节蛋白，蛋白质S,蛋白C抑制物蛋白质C (PC):灭活Va,VIIIa，抑制Fx及凝血酶原激活记忆：我爸（5,8）嫖娼（P,C）蛋白C抑制物与PC形成APC 肝脏是储存维生素A,E,B12,K的主要场所记忆：干(肝)脆罢课（BAKE）氨基酸的记忆：中性氨基酸：中性氨基酸：谷氨酰胺，天冬酰胺，酪氨酸，丝氨酸，色氨酸，苏氨酸，胱氨酸，蛋氨酸记忆：(中)国(股东老实)好(色输)成穷(光蛋)

蛋白酪氨酸激酶活性测定

Protein Tyrosine Kinase Assay Kit Cat. No. 539700 Introduction 3URWHLQ W\URVLQH NLQDVH 37. FDWDO\]HV WKH WUDQVIHU RI 32P-ATP followed by separation of the 323 SHSWLGH SURGXFW IURP WKH XQUHDFWHG 32P-ATP via the streptavidin membrane still demands an intensive and inconvenient washing procedure. CALBIOCHEM?’s Protein Tyrosine Kinase Assay Kit is based on a process that combines affinity binding and ultrafiltration separation to analyze a mixture sample. 7KH 37. DVVD\ EHJLQV ZLWK D UHDFWLRQ RI WKH HQ]\PH VDPSOH ZLWK D ELRWLQ\ODWHG SHSWLGH VXEVWUDWH DQG 32P-ATP. Separation by such affinity ultrafiltration process is easy, gentle, and efficient. Separation occurs in solution relatively free of nonspecific background. In addition, the ultrafiltration separation is performed in a contained and compact system that eases the handling of the radioactive sample and minimizes the radioactive waste. The sample reservoir of the centrifugal ultrafiltration unit containing the 32P-peptide product as retentate can be directly placed into a liquid scintillation vial for counting. CALBIOCHEM?’s Protein Tyrosine Kinase Assay Kit has been carefully formatted to ensure its assay performance and user-friendliness. This kit uses biotinylated EGF receptor peptide (RENAEYLRVAP) as a substrate (Pearson, et al. 1991, Methods in Enzymology200, 62-81). The Protein Tyrosine Kinase Assay Kit should be used to assay activity of EGF receptor or related PTKs that can phosphorylate the peptide substrate, or potency of an activator or inhibitor of the PTKs. Users who wish to assay other PTKs or other protein kinases with specific peptide substrates and kinase reaction buffers should choose our Universal Protein Kinase Assay Kit (Cat. No. 539551). FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR HUMAN OR DRUG USE. MSDS AVAILABLE UPON REQUEST.

受体酪氨酸激酶RTK介绍

1、受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs) RTKs是最大的一类酶联受体，它既是受体，又是酶，能够同配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。所有的RTKs都是由三个部分组成的：含有配体结合位点的细胞外结构域、单次跨膜的疏水α螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶（RTK）活性的细胞内结构域。已发现50多种不同的RTKs,主要的几种类型包括： ①表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）受体； ②血小板生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）受体和巨噬细胞集落刺激生长因子（macrophage colony stimulating factor, M-CSF）； ③胰岛素和胰岛素样生长因子-1 （insulin and insulin-like growth factor-1, IGF-1）受体； ④神经生长因子（nerve growth factor, NGF）受体；各类受体酪氨酸激酶 ⑤成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）受体； ⑥血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor, VEGF）受体和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）受体等。受体酪氨酸激酶在没有同信号分子结合时是以单体存在的，并且没有活性；一旦有信号分子与受体的细胞外结构域结合，两个单体受体分子在膜上形成二聚体，两个受体的细胞内结构域的尾部相互接触，激活它们的蛋白激酶的功能，结果使尾部的酪氨酸残基磷酸化。磷酸化导致受体细胞内结构域的尾部装配成一个信号复合物（signaling complex）。刚刚磷酸化的酪氨酸部位立即成为细胞内信号蛋白（signaling protein）的结合位点，可能有10～20种不同的细胞内信号蛋白同受体尾部磷酸化部位结合后被激活。信号复合物通过几种不同的信号转导途径，扩大信息，激活细胞内一系列

受体酪氨酸激酶分类

受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs) 各类受体酪氨酸激酶 RTKs是最大的一类酶联受体，它既是受体，又是酶，能够同配体结合，并将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化。所有的RTKs都是由三个部分组成的：含有配体结合位点的细胞外结构域、单次跨膜的疏水α螺旋区、含有酪氨酸蛋白激酶（RTK）活性的细胞内结构域。已发现50多种不同的RTKs,主要的几种类型包括： ①表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）受体； ②血小板生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）受体和巨噬细胞集落刺激生长因子（macrophage colony stimulating factor, M-CSF）； ③胰岛素和胰岛素样生长因子-1 （insulin and insulin-like growth factor-1, IGF-1）受体； ④神经生长因子（nerve growth factor, NGF）受体； ⑤成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）受体； ⑥血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor, VEGF）受体和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）受体等。受体酪氨酸激酶在没有同信号分子结合时是以单体存在的，并且没有活性；一旦有信号分子与受体的细胞外结构域结合，两个单体受体分子在膜上形成二聚体，两个受体的细胞内结构域的尾部相互接触，激活它们的蛋白激酶的功能，结果使尾部的酪氨酸残基磷酸化。磷酸化导致受体细胞内结构域的尾部装配成一个信号复合物（signaling complex）。刚刚磷酸化的酪氨酸部位立即成为细胞内信号蛋白（signaling protein）的结合位点，可能有10～20种不同的细胞内信号蛋白同受体尾部磷酸化部位结合后被激活。信号复合物通过几种不同的信号转导途径，扩大信息，激活细胞内一系列的生化反应；或者将不同的信息综合起来引起细胞的综合性应答（如细胞增殖）。

非受体型酪氨酸激酶Syk蛋白的提取与纯化

论著文章编号:1007-8738(2004)02-0230-04 非受体型酪氨酸激酶-Syk 蛋白的提取与纯化单保恩1,董青1,李宏芬1,陈晶1,董金琢2,马洪2 (1河北医科大学第四医院科研中心,河北石家庄050011;2美国MD 技术公司,Mo 63021,美国) 收稿日期:2003-06-07; 修回日期:2003-09-18基金项目:美国MD 技术公司合作课题基金资助(2002年)作者简介:单保恩(1962-),男,河北邯郸人,教授,博士生导师. Tel:(0311)6033941-290;Email:baoenshan@yahoo.c https://www.360docs.net/doc/5d12254595.html, Extraction and purification of non -recep -tor type PTKs -Syk SHAN Bao -en 1,DO NG Qing 1,LI Hong -fen 1 ,C HE N Jing 1,DO NG Jin -zhuo 2,MA Hong 2 1 Research Center ,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China;2MD Technologies Inc.845Pheasant Woods Drive Manchester,Mo 63021,USA Abstract AIM:To extract and purify Syk protein from Sf 21cells transfec-t ed by syk gene.METHODS:Sf 21cells were transfected with recom bi nant syk gene.After 48h of incubation at 28 ,the transfected cells were collected and sonicated with Sonfier son-i cator on ice.Filtered cell extract was loaded onto a R eactive Yellow -3res i n column and Toyopearl AF -H eparin -650M colum n respectively.The character of Syk protein in the fractions were i dentified by SDS -PAGE,W estern blotting and IEF.RESULTS:225m g of protein containing Syk were obtained from Sf 21cells (2.5 109)extract.There were two subpopulations in the elu -tion of Reactive Yellow -3resin column with the same relative molecular mass (M r )72 103.The two subpopulations were then applied on Toyopearl AF -H eparin -650M column and two pure proteins were obtained.The results of SDS -PAGE,W es-t ern blotting,and IEF showed the two proteins having the sam e relative molecular mass (72 103),corresponding to Syk,but with different pI.CONCLUSION:The y ield of Syk was 8m g from 2.5billion cells and the purity was >95%.The two purified Syk proteins have the sam e M r and different pI.The purified Syk protein can be applied to study Syk s m echanism,produce ant -i Syk antibody and invent Syk diagnosis kit,etc .Keywords:Syk;purification;chromatography;Sf 21cells 摘要目的:从转染syk 基因的Sf21细胞中提取、纯化免疫相关因子 Syk 蛋白。方法:将syk 基因转染Sf21细胞,于28 培养48h,收集细胞,用超声波破碎仪裂解细胞,提取裂解液中总蛋白,用Yellow -3凝胶和Toyopear-l AF -Heptin -650M 凝胶层析柱分离、纯化。层析液中的Syk 蛋白存在和性质,用SDS -PAGE 、免疫印迹实验和等电聚焦实验鉴定。结果:从25亿个Sf21细胞裂解液中提取了含有Syk 的225mg 蛋白质。经Yellow -3凝胶层析分离,得到两个亚种的Syk 蛋白,相对分子质量(M r )均为72 103。进一步用Toyopear-l AF -Heptin -650M 凝胶层析纯化后,得到两个纯的Syk 蛋白,SDS -PAGE 、免疫印迹实验结果显示,两种Syk 的M r 均为72 103,与Syk 的理论相对分子质量吻合。但等电聚焦实验显示,这两种Syk 蛋白成分具有不同的pI 值。结论:从25亿个转染syk 基因的Sf21细胞中纯化出8mg Syk 蛋白,纯度高于95%。这两种Syk 的M r 虽然相同,但具有不同的pI 值,是两个亚种。这些Syk 可用于研究Syk 的作用机制、抗Syk 抗体的制备和Syk 诊断试剂盒的制备等。关键词:Syk;分离纯化;凝胶层析;Sf21细胞中图分类号:R392.11 文献标识码:B 非受体型酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk),是一种B 细胞激活信号转导中最重要的激酶 [1] ,与T 细胞激活中的ZAP -70属于同一个PTK 家族,M r 为72 103。Syk 在T 细胞和B 细胞的成熟和活化过程中起关键作用[2]。该酶除有激酶活性中心SH1之外,还有两个SH2结构域,因而成为磷酸化I -TAM 招募的首选对象。被招募的Syk 立即成为Src 作用的第二个靶目标,进而启动B 细胞活化信号转导的三条主要途径(磷脂酰肌醇途径、MAP 激酶相关途径和磷酸肌醇3激酶途径),激活各种转录因子转位进入细胞核,与基因启动子区域中各种顺式作用元件或DNA 小盒结合,使相应基因发生转录激活和产物表达,调整B 细胞等细胞克隆的蛋白质表达、细胞分化或凋亡。研究发现,Syk 不但是免疫调节因子,在肿瘤发生发展中也发挥着重要作用。但是,用于研究Syk 的蛋白标准品、抗体和诊断用试剂很难取得。我们介绍从转染s yk 基因的Sf21细胞中提取、纯化免疫相关因子Syk 蛋白。