丹参多糖体外抗氧化抗肿瘤研究

丹参多糖体外抗氧化与抗肿瘤研究

焦亚东1杨兴斌2*

（1.陕西师范大学教育部药用资源与天然药物化学重点实验室，陕西西安710062；2. 陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710062）

摘要：采用水提醇沉法制备丹参多糖（SMP）。通过1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化HPLC-UV法表征SMP的单糖组成。通过DPPH·自由基、超氧阴离子、羟自由基、还原能力体系评估SMP的抗氧化能力。采用MTT法、LDH法和流式细胞术（FCM）评价SMP的抗肿瘤活性。结果表明，SMP主要由半乳糖醛酸（GalUA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gla）组成，其摩尔百分含量分别为4.36%、31.11%和65.52%。SMP 具有一定的抗氧化活性，且呈现量效关系。同时，SMP对人结肠癌细胞（LoVo）的生长具有显著的抑制作用，并且表现出一定的剂量依赖性，流式细胞术的分析结果表明SMP能显著地诱导LoVo细胞凋亡并能将LoVo细胞抑制在S期。

关键词：丹参多糖；抗氧化；抗肿瘤

Antioxidant, Antineoplastic activity of Polysaccharide

Extract from Salvia miltiorrhiza Bge.

JIAO Ya-dong1, YANG Xing-bin2*

(1 Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Plant Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry, Shaanxi Normal University, Xi'an 710062, China;

2 College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University,

Xi'an 710062, China )

Abstract: SMP was extracted by the method of water boiling and ethanol precipitation. The monosaccharide compositions of SMP was characterized by PMP precolumn derivatization procedure with HPLC-UV. In addition, the antioxidant potential of SMP was evaluated using the method of reducing power, and scavenging DPPH?radical, superoxide radical and hydroxyl radical. Moreover, the antineoplastic activity of SMP was evaluated by MTT assay, LDH assay and flow cytometry (FCM). The results showed that SMP was composed of galacturonic acid

1作者简介：焦亚东（1985—），男，硕士生，主要从事天然药物化学方面的研究。

* 通讯作者：杨兴斌（1969—），男，副教授，硕士生导师，主要从事食品药品质量标准、食品分子营养

学以及生化药理方面的科研工作。Email: xbyang@https://www.360docs.net/doc/62207798.html,

(GalUA), glucose (Glc) and galactose (Gal) in the mole percents of 4.36%, 31.11% and 65.52%. The antioxidative experiment of SMP indicated that it exhibited various degrees of antioxidant activities in a dose-dependent manner. In addition, SMP exhibited significant antiproliferative activity against LoVo cell line in a dose- and time-dependent manner. Moreover, FCM analysis demonstrated that SMP significantly induced the apoptosis of LoVo cell and caused cell cycle arrest at S phase.

Key words: SMP; Antioxidant activities ; Antineoplastic activity

丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)为唇形科植物丹参的干燥根和根茎[1]，是著名的活血化瘀药，临床广泛用于冠心病、心绞痛、心肌梗塞和脑血管疾病的治疗[2]。人们在研究中发现从丹参根中提取到的多糖，经口服和肌注，用于氨基核苷诱导的实验性肾病模型和四氯化碳引发的肝损伤模型时能减少尿蛋白的排泄，抑制血清胆固醇和脂质过氧化物浓度的提高，降低肝损伤引起的丙氨酸转氨酶ALT 升高，并改善血清白蛋白与球蛋白的比值(A/G) [3]，丹参多糖能降低 LPS 诱导的急性肝损伤模型小鼠肝组织中 MDA 含量，升高 GSH 含量，降低血清ALT 含量[4]，且具有明显的抗免疫性肝损伤的作用[5]。然而，对丹参多糖的抗氧化、抗肿瘤的研究报道较少，本实验通过评估丹参多糖体外抗氧化及抗肿瘤活性，为丹参多糖的进一步开发及临床应用提供依据。

1仪器、材料与试剂

仪器 AL104电子天平，PL2002电子天平（Mettler Toledo）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；恒温水浴锅，LGJ-10冷冻干燥机（巩义市予华仪器有限公司）；H2050R-1高速离心机（湖南湘仪集团）；透析袋（截留分子量为8000-10000）（华美生物工程公司）；723型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；LC-2010A高效液相色谱仪，Class-VP 6.1色谱工作站（日本Shimadzu公司）；MILLI-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；RT6000酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；FAC SCalibur流式细胞仪（美国BD公司）；TS 100倒置显微镜（Nikon公司）；IX 71倒置荧光显微镜（OLYMPUS公司）；SW-CJ-2FD超净工作台（苏净集团）；Megafuge 1.0R冷冻离心机，二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）。

材料购买于西安市场，经陕西师范大学田先华教授鉴定为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)，洗净后在室温下自然风干。

试剂D-甘露糖（Man），D-核糖（Rib），L-鼠李糖（Rha），D-葡萄糖醛酸（GlcUA），D-半乳糖醛酸（GalUA），D-葡萄糖（Glc），D-木糖

（Xyl ），D-半乳糖（Gal），L-阿拉伯糖（Ara），D-岩藻糖（Fuc），抗坏血酸（Vc）均购自Sigma公司（St. Louis, USA），铁氰化钾（[K3Fe(CN)6]）和三氯乙酸（TCA）购自Sigma公司（Sigma-Aldrich GmbH，Sternheim，Germany），1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、氮蓝四唑（NBT）、还原型辅酶（NADH）和吩嗪甲硫酸盐（PMS）购自Applichem（Darmstadt，Germany），浓硫酸，重蒸苯酚，三氟乙酸（TFA），三乙胺（TEA）和1-苯

基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）分别购自德国Merck公司和北京化学试剂公司。色谱甲醇和乙腈均购自美国Honeywell公司。其他试剂均为分析纯，实验用水

为蒸馏水。

2 实验方法

2.1 MSP的制备

取丹参药材，粉碎，过80目筛，加入适量无水乙醇，80 ℃水浴回流脱脂2次，残渣晾干，加入10倍体积的水，80 ℃水浴，搅拌浸提4 h，过滤，残渣加水反复浸提3次，合并滤液。浓缩至适宜体积，加入无水乙醇至终浓度为80% ，醇沉3次。收集沉淀，反复冻融10次除蛋白，3000 r/min，10 min，收集上清，透析3 d，冷冻干燥，得SMP粗品[6]。

2.2 总糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[7]测定SMP中总糖含量。

2.3 单糖组成表征参照文献[8]的方法，对SMP的单糖组成进行表征。

2.4 体外抗氧化活性测定

2.4.1 清除DPPH·自由基作用的测定[9]

精确称取 4 mg 的 DPPH·，用甲醇100 mL溶解并。将 1 mL 不同浓度的待测液与3 mL DPPH·溶液依次加入试管中，摇匀，黑暗处理20 min，于517 nm 处测定吸光度 A i（本底组以甲醇代替DPPH·），蒸馏水代替待测液为阴性对照，以 Vc 作阳性对照。根据下列公式计算清除率：

清除率（%）＝ [1－(Ai－ Ac)/ Aj] ×100%

式中Ai为样品管的吸光值；Aj为样品本底的吸光值；Ac为本底的吸光值。

2.4.2 总还原力的测定[10]

将 1 ml不同浓度的待测液分别与 2.5 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L

Na2HPO4/NaH2PO4，pH6.6）及2.5 mL 铁氰化钾（1%）混合，混合物在50 ℃水浴中孵育 20 min，然后加入 2.5 mL 的 TCA（10%）终止反应，3000 r/min 离心10 min，取上清液2.0 mL，依次加入2.0 mL 水和0.5 mL FeCl3（0.1%），混匀后于700 nm处测定吸光度。Vc做阳性对照。

2.4.3 清除超氧阴离子（O2??）作用的测定[11]

试管中依次加入 1 mL NBT（81 μM）溶液，1 mL NADH （468 μM）溶液，1 mL多糖溶液，0.4 mL PMS（88 μM）溶液，混匀后静置5 min，于560 nm处测其吸光值。用水代替多糖溶液做阴性对照，水代替PMS做本底组对照，Vc做阳性对照。按以下方程计算清除率：

清除率（%）＝ [1－(Ai－Ac)/ Aj] ×100%

式中Ai为样品管的吸光值；Aj为样品本底的吸光值；Ac为本底的吸光值。

2.4.4 清除羟自由基（·OH）活性测定

用2-脱氧-D-核糖法测定样品对羟自由基的清除活性[12]。用磷酸盐缓冲液（20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH7.4）配制反应液（含有0.1 mM EDTA，0.1 mM FeCl3和 2.8 mM DR）。测定时取 1.5 mL反应液，依次加入0.1 mL Vc（1 mM）、0.35 mL H2O2（20 mM）和1 mL不同浓度的待测液，于37 ℃水浴20 min后依次加入1 mL TBA（1%）和0.3 mL TCA（2.8%），再于90 ℃水浴15 min，532 nm处测定吸光值。抑制率计算方法：

清除率（%）＝ [1－(Ai－ Ac)/ Aj] ×100%

式中Ai为样品管的吸光值；Aj为样品本底的吸光值；Ac为本底的吸光值。

2.5 体外抗肿瘤活性研究

肿瘤是常见疾病，恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康、导致死亡的主要病因之一[14,15]。目前，对肿瘤的治疗主要集中在化学治疗和放射治疗，但是这两种治疗方法副作用甚大，复发率高，尤其对机体免疫与造血系统有较大的损害。

本实验以结肠癌细胞LoVo为例，采用体外抗肿瘤模型和流式细胞仪检测技术评价SMP的抗肿瘤活性。

2.5.1 MTT法检测细胞增殖实验

取对数生长期细胞，制成细胞悬液，并调浓度至约1×105 个/mL，接种于96孔培养板。每孔加90 μL，置37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养24 h后，分别加入10 μL不同浓度的样品溶液，继续培养24 h和48 h，加入20 μL MTT（5 mg/mL），4 h后加入SDS三联液终止反应，继续培养16 h后用酶标分析仪在

570 nm处测定吸光值，每个处理设三个重复。按以下公式计算细胞生长抑制率：细胞生长成活率(%)=（实验孔A570—本底孔A570）/对照孔A570×100%。2.5.2 LDH法检测细胞毒性

细胞处理同2.5.1，区别在于继续培养48 h后，直接离心，吸取上清液，按LDH检测试剂盒说明书进行操作。按以下公式计算细胞上清液中LDH活性：LDH活性(U/L)=(测定孔A450－对照孔A450)/(标准孔A450－空白孔A450)×标准浓度×样品测试前稀释倍数×1000。

2.5.3流式细胞术检测细胞凋亡率及周期阻滞

取对数生长期细胞，胰酶消化后制备成浓度为3×105 cell/mL的细胞悬液，于6孔板中每孔接种1000 μL。将6孔板板置于37 ℃、5% CO2培养箱继续培养。24 h后加入不同浓度的样品溶液，阴性对照（生理盐水）。继续培养48 h 后细胞用胰酶消化，离心收集细胞后，70%乙醇悬浮，在4 ℃冰箱固定12 h以上。固定后的细胞用PBS洗两遍并悬浮，加入PI染液（50 g/mL），37 ℃避光温育30 min，流式细胞仪上计数5 000个细胞，测定细胞各期DNA水平，分析细胞周期分布（激发波长488 nm，发射波长525 nm）。

2.6 数据分析

利用Excel软件对实验数据处理分析。

3 实验结果

3.1 SMP总糖含量

多糖在浓硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定其吸光值，通过制作的标准曲线即可测得多糖含量。以标准葡萄糖浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标做标准曲线，建立回归方程：y = 10.349x + 0.0779 R2 = 0.9964 （y：吸光值；x：葡萄糖浓度）。实验测得，丹参多糖浓度为80 μg/mL时的吸光值为0.644，由标准曲线可计算出，本实验提取的丹参多糖总糖含量为68.34%。

3.2 SMP的单糖组成分析

液相条件：动相A为纯乙腈；B由0.45 g KH2PO4、0.47 mL TEA、100 mL 乙腈和900 mL超纯水组成（pH 7.5）。色谱柱：Venusil C18柱（250 mm×4.6 mm ID，5 μm）；梯度洗脱：0 min，97%B；6 min，97%B；8 min，92%B；

40 min，91% B。进样量15 μL，流速1.0 mL·min?1，检测波长为250 nm，柱温为30 ℃。SMP主要由半乳糖醛酸（GalUA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）组成，其摩尔百分含量分别为4.36%、31.11%和65.52%（图1）。

B

图1 PMP衍生的10种标准单糖的HPLC色谱图（A）和SMP的单糖组成HPLC分析图谱（B）Fig.1 The HPLC chromatograms of 10 PMP-labeled standard monosaccharides (A) and PMP-labeled monosaccharides released from SMP (B). Peaks: 1. Man; 2. Rib; 3. Rha; 4. GlcUA; 5.

GalUA; 6. Glc; 7. Xyl; 8. Gal; 9. Ara; 10. Fuc (I.S.)

3.3 SMP的体外抗氧化活性

3.3.1 SMP清除DPPH自由基的能力

DPPH·是一种很稳定的以氮为中心的自由基，在517nm处有强吸收峰，DPPH·通常被用来检测抗氧化剂的抗氧化活性。当有自由基清除剂存在时，DPPH·会和清除剂提供的质子结合形成DPPH-H，从而使溶液颜色由紫色变为黄色，使其在517 nm处的吸光度变小。SMP对DPPH自由基的清除作用，随着浓度的增加而增加，且在25-150 μg/mL范围呈量效关系，其IC50值为61.62 μg/mL（图2）。结果表明丹参多糖有一定的清除DPPH自由基的活性。

3.3.2 还原能力的测定

物质清除自由基的能力与其还原能力成正比，采用体外化学模拟条件下建立还原铁体系，具有较强还原力的物质能把三价铁还原成二价铁，通过显色反应判断还原能力，反应后吸光值越大，说明其还原能力越强。随着SMP浓度的

增加，OD值逐渐增大，且在12.5-187.5 μg/mL范围呈一定的量效关系。12.5 μg/mL时OD值为0.13，187.5 μg/mL时 OD值为1.174（图3）。

图 2 SMP清除DPPH活性

Fig.2 DPPH radical-scavenging activity of SMP and Vc was used as reference

antioxidants (x± s, n = 3)

图 3 SMP的还原能力

Fig.3 Iron(III) to iron(II) reducing power of SMP and Vc was used as

positive control (x± s, n = 3)

3.3.3 清除超氧阴离子的能力

在活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）中，超氧阴离子（O2??）是羟自由基（·OH）和单线态氧的前体之一，而且它可以产生其他不同类型的氧化因子，并由此间接启动脂质过氧化和放大细胞损伤。作清除率-浓度图，随着SMP浓度的增加，对超氧阴离子的清除作用越明显，30 μg/mL时清除率为23.58%，300μg/mL时清除率达96.74%，其IC50值为60.37 μg/mL，丹参多糖具有一定的清除超氧自由基能力（图4）。

图 4 SMP清除超氧阴离子活性

Fig.4 Superoxide radical-scavenging activity of SMP and Vc was used as

reference antioxidants (x± s, n = 3)

3.3.4 羟自由基清除作用

羟基作为活性氧自由基中最活跃的自由基，能使与其接触的生物分子发生氧化损伤，导致衰老、癌症和其他的各种疾病[16,17]。SMP有一定的羟自由基清除能力，且浓度-清除率呈现出良好的量效关系，其IC50值为78.32 μg/mL（图5）。

图5 SMP清除羟自由基活性

Fig.5 Hydroxyl radical-scavenging activity of SMP and D-Man was used as

reference antioxidants (x± s, n = 3)

3.5 SMP对LoVo细胞的抑制作用

通过MTT法测定SMP对人结肠癌细胞LoVo细胞的生长抑制作用可以发现，SMP对 LoVo有一定的抑制作用，并且呈现浓度依赖的关系（图6）。经400 μg/mL的SMP处理24 h后，LoVo细胞的存活率为31.01%。同浓度的SMP 孵育48 h后，LoVo细胞的存活率为29.01%。

图6 SMP对LoVo细胞系的抑制作用

Fig. 6 Inhibitory effect of SMP on LoVo cell proliferation

图7 SMP对LoVo细胞释放LDH的影响

Fig. 7 Effect of HCP on LDH release in LoVo line cells

3.6 HCP的细胞毒性

在细胞增殖抑制试验中发现SMP对LoVo细胞有抑制活性，从而进一步测定SMP的细胞毒性。结果显示，在孵育24 h后，随着SMP浓度的升高，LoVo 细胞LDH的释放量从231U/L增加到579 U/L，同时，测得阳性药物5-Fu在浓度为100 μg/mL时LDH的释放量为112 U/L。在孵育48 h后，随着SMP浓度

的升高，LoVo细胞LDH的释放量从346 U/L增加到848 U/L，同时，测得阳性药物5-Fu在浓度为，100 μg/mL时LDH的释放量为168 U/L（图7）。

3.7流式细胞术检测细胞凋亡率及周期阻滞

为了进一步研究SMP对LoVo细胞的生长抑制作用，采用流式细胞术检测SMP孵育48 h后LoVo细胞的凋亡数量及周期分布，以期揭示其对细胞增殖抑制作用的原理。不同浓度的SMP（100 μg/mL和400 μg/mL）在孵育48 h后对LoVo细胞的作用结果见图8。阴性对照组细胞凋亡率0.01%（图8A）；100 μg/mL HCP处理48 h细胞的凋亡比例为17.61%（图8B），与对照组比较具有显著性差异（p<0.05）；400 μg/mL HCP处理48 h细胞的凋亡比例为21.44%（p<0.05，图8C）。这些体外研究数据表明SMP能够诱导LoVo细胞的凋亡。

A B

C D

图8 SMP对人结肠癌细胞LoVo的凋亡诱导和周期阻滞作用

Figure 8 Effects of HCP on apoptosis of LoVo cell line and cycle. Control (A); Cells treated with 100 μg/mL of SMP (B); Cells treated with 400 μg/mL of SMP (C);The results of data processing

(D)

同时，检测SMP可改变LoVo细胞的周期分布（图8）。SMP作用LoVo 细胞48 h后，实验对照组S期和G2/M期细胞所占的比例分别为31.53%和10.92%，而100 μg/mL SMP作用后S期和G2/M期细胞所占比例分别为44.4%和10.16%，400 μg/mL SMP作用后S期和G2/M期细胞所占比例分别为49.49%和9.38%。药物处理后S期细胞比例有所增高，这表明SMP能显著地促进人结肠癌细胞（LoVo）进入S期，使细胞阻滞在S期，阻断肿瘤细胞由S期向G2/M期的进程，使DNA的复制和有关蛋白的准备工作无法完成，从而阻滞细胞的有丝分裂。

4 结论与讨论

研究证明多糖作为主要的水溶性成分具有多种生物活性。70年代以来，科学家们发现多糖及糖复合物参与了细胞各种生命现象的调节。近十多年来，由于细胞膜的化学功能、免疫物质的化学研究与发展以及新药物资源的寻找与研究等，人们对多糖及其复合物作用的认识越来越深入，发现糖类在生物体内不仅作为能源物质或结构材料，更重要的是参与了生命现象中细胞的各种活动，具有多种生物活性。多糖及其复合物在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老等方面发挥着重要的生物活性[18]。

本文通过超氧阴离子自由基体系、羟基自由基体系、DPPH自由基体系、还原能力体系研究SMP的抗氧化能力。结果显示，SMP有一定的抗氧化活性，且呈现较好的剂量依赖效应。通过MTT实验发现SMP能够抑制人结肠癌细胞LoVo的增殖，并且呈现剂量关系。采用LDH测试盒检测SMP对LoVo细胞的细胞毒性，发现SMP能够促进LoVo细胞LDH的释放，并且随剂量的增大，LDH的释放量升高。利用流式细胞术检测SMP对LoVo细胞凋亡和周期的影响，结果表明SMP能诱导细胞凋亡和引起明显的S期阻滞。但其抗肿瘤机制有待于更深层次的探究。

综上所述，通过研究丹参多糖的体外抗氧化、抗肿瘤功能，为以丹参为原料的产品进一步开发及应用提供理论依据。

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