染色体步移技术
螺旋讲堂2010年第4期总第23期
染色体步移
内容概览：
一、染色体步移技术概述
二、常见的染色体步移技术介绍
1、结合基因组文库的染色体步移技术
1）
物理剪切法构建亚克隆文库2）
限制性内切酶法构建亚克隆文库2、基于PCR 技术的染色体步移技术
1）
连接成环PCR 2）外源接头介导PCR
（1）连接载体的PCR
（2）连接单链接头的PCR
（3）连接双链接头PCR
3）半随机引物PCR 策略
（1）新Alu-PCR
（2）DW-ACP TM PCR
（3）热不对称交错PCR （TAIL-PCR ）
三、染色体步移技术之TAIL-PCR
1、TAIL-PCR 的原理
2、TAIL-PCR 的优点以及技术难点
3、TAIL-PCR
的操作流程
4、TAIL-PCR 中的注意事项
5、常见问题分析
生物人的网上家园
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螺旋网HelixNet 染色体步移技术是一种常用的克隆已知片段旁侧序列的技术。本文中主要总结了近年来染色体步移技术的发展情况，介绍了结合基因组文库的染色体步移技术和
基于PCR 的染色体步移技术，并且比较了他们之间的优缺点，最后着重与大家一起
讨论一下TAIL-PCR 的相关内容，希望能对大家有所帮助。
一、染色体步移技术概述
染色体步移(Chromosome walking)又称为基因组步移（Genome walking）是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目标序列的方法。对于已经完成基因组测序的模式生物种(如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等)，可直接从数据库中轻松的找到已知序列的侧翼序列。但是目前为止，自然界中大多数生物基因组DNA序列仍未知，要想知道一个已知区域两侧的DNA序列，染色体步移无疑是一种非常有效的方法。因此，染色体步移技术在现代分子生物学研究中较为重要，本文主要就染色体步移的相关方法，不同方法之间的比较，着重以TAIL-PCR的原理，实验操作及注意事项等进行讨论。
染色体步移技术的主要应用可归结为以下5个方面：
（1）鉴定T—DNA或转座子的插入位点，鉴定转基因技术所导致的外源基因的插入位点；
（2）根据基因的已知片段、EST或插入的转座子序列克隆目的基因，分离基因的启动子及调控元件；
（3）用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接；
（4）构建图位克隆中的重叠群；
（5）转化标记辅助育种中的STS或SCAR标记等。
二、常见的染色体步移技术介绍
目前，分离侧翼序列的染色体步移方法主要有两种，一是结合基因组文库为主要手段的染色体步移技术，构建基因组文库进行染色体步移尽管步骤比较繁琐，但是适于长距离步移，可以获得代表某一特定染色体的较长连续区段的重叠基因组克隆群。随着亚克隆文库条件构建条件的优化及测序技术的进步，这种方法也将更加快捷，准确。另一个是基于PCR扩增为主要手段的染色体步移技术。基于PCR扩增为主要手段的染色体步移技术步移距离相对较短，但是操作比较简单，尤其适合于已知一段核苷酸序列的情况下进行的染色体步移。在此基础上人们相继发明了十几种侧翼序列克隆的方法，依据其技术原理，可以将这些方法分为3类：连接成环PCR、外源接头介导PCR和半随机引物PCR。
1、结合基因组文库的染色体步移技术
基因组文库是指生物体全部DNA，经过合适的核酸内切酶消化或机械切割以后，克隆到适当的载体分子中，构成重组体分子群体，然后转化给诸如大肠杆菌这样的寄主菌株进行复制繁殖，如此构建的理论上含有生物体整个基因组全部遗传信息的克隆集合体，称作基因组文库，它是进行基因组学研究的重要技术平台，在基因组物理图谱的构建以及基因的图位克隆中发挥了重要作用。基因组文库的种类主要有入噬菌体文库、酵母人工染色体文库(yeast artificial chromosome，YAC)、P1噬菌体文库和细菌人工染色体文库(bacterial artificial chromosome，BAC)等。其中，BAC文库因其插入片段大、嵌合率低、遗传稳定性好、
易于操作等优点而备受青睐，近年来，小麦、棉花、水稻等越来越多的物种构建了BAC文库。
在基因克隆中，该方法用于鉴定一系列彼此重叠的DNA限制片段，分离序列及表达产物未知的基因，特别
是发育相关的基因。利用基因组文库克隆目的基因，首先要有一个根据目的基因建立起来的遗传分离群体，
找到与目的基因紧密连锁的分子标记，然后用遗传作图将目的基因定位在染色体的特定位置，找到与目的
基因紧密连锁的分子标记。构建含有插人大片段DNA的基因组文库(BAC或YAC)，以与目的基因连锁的
分子标记为探针筛选基因组文库，鉴定出分子标记所在的大片段克隆，再以该克隆为染色体步移的起点，
用外侧克隆末端作为探针筛选基因组文库，分离新的重叠克隆用获得的阳性克隆，多次重复上述步骤，逐
渐逼近目的基因，构建目的基因区域的重叠群。随后通过亚克隆文库获得含有目的基因的小片段克隆，最
后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。
目前构建亚克隆文库比较常用的DNA片段化方法主要有两种：物理剪切法和限制性内切酶法。
1）物理剪切法构建亚克隆文库
将大片段的BAC DNA通过物理方法变成目标大小的小片段，可以用超声波处理，也可以用DNA片段剪切仪。传统的超声波处理方法具有操作简单，快速的优点，但是不同的超声波具有不同的性能，需要摸索最佳的处理条件才能达到理想的效果。然而利用DNA片段剪切仪，通过调节剪切头中注射器上下移动的速度来控制目标片段剪切的程度，具有目标片段集中、方便、稳定性高的优点。物理剪切法构建大片段DNA 亚克隆文库，优点是对于具有复杂二级结构的大片段BAC DNA可以通过构建高覆盖率的亚克隆文库获得完整的核苷酸序列，缺点是需要提取高质量BAC DNA、步骤繁琐，剪切后的限制性片段与载体连接一般要求过夜，所需时间较长，且技术要求高，成本较高。
2）限制性内切酶法构建亚克隆文库
末端半补齐(partial-filling)原是为某些不相容的酶切末端能彼此连接而设计的一项技术。Zabarosky等首先将其应用于以噬菌体为载体的基因文库构建中，以后逐渐有人将这一技术应用于以质粒为载体的基因文库构建中，使文库转化子中重组子的比例由单酶切连接的10％提高到70％以上，极大减小了文库筛选的工作量。首先利用限制性内切酶Sau3AI对制备的2709染色体DNA做部分酶切，回收2～9kb的片段，并用dATP、dGTP由大片段酶将末端5'-GATC-3'补上两个碱基，但仍留有两个碱基的5突出末端(5'-GA-3')，文库载体pUC18则用SalI酶切后用dCTP、dTTP由大片段酶做末端半补齐，相连接后转化宿主菌(见图1)，共获得3×10个转化子，插入片段大小分布在2～7kh之间，重组子高达70％以上，并且从所构建的文库中
成功筛选到2709碱性蛋白酶的编码基因。
在亚克隆文库的构建方面引入末端半补齐技术，彻底消除了载体自环化的可能性，只有在相应的外源
片段插入后，才能形成环化产物，因此极大提高了连接产物中重组质粒的比例，使组成基因文库的总转化子数目大大减少，减轻文库筛选的工作量；而且经末端半补齐的插入片段其自身末端也失去了彼此问退火的能力，因而消除了插入片段自身相互连接的可能性，保证了基因文库中克隆基因的真实性。同传统碱性磷酸酯酶法相比较，采用半补齐技术处理的连接产物为完整的共价闭环质粒，不象碱性磷酸酯酶法那样留有缺口，因而半补齐法的连接产物转化率不受影响；而且在技术操作上半补齐法并不比碱性磷酸酯酶法复杂。当然，通过末端半补齐得到的连接产物，其连接处的酶切位点一般均被破坏，但是这一缺点对于构建基因文库并不构成特别的影响。
2、基于PCR技术的染色体步移技术
PCR技术自发明以来，发展突飞猛进，Ochman等在此基础上发明了反向PCR，并首次应用于基因
组染色体步移。自此以后的20年中，先后有十几种扩增未知序列的染色体步移方法的报道。这些方法都有独特的技术特点以及特定的应用环境，但根据其技术原理，这些方法体现了3种主要的策略：连接成环PCR 策略，外源接头介导PCR策略和半随即引物PCR策略。
1）连接成环PCR
反向PCR(Inverse—PCR，I-PCR)是连接成环PCR策略最为典型的代表，是Triglia等在常规PCR基础上提出的扩增位于靶DNA区段两侧未知序列的一种PCR方法，此法选择的引物虽与已知DNA序列互补，但是引物延伸的方向与常规PCR相反(图2)。反向PCR成功与否的关键在于限制性片段分子内成环的效率，选择一个已知序列中没有的限制性内切酶对DNA进行酶切，用连接酶将限制性片段自身环化做模板，根据已知序列末端设计反向引物进行PCR，即可获得两侧未知核苷酸序列。
反向PCR成败的影响因素主要有两个方面：(1)分子间连接形成大量的线状串联体会导致非特异扩增；
(2)酶切片段过长将导致扩增效率下降，因此优化连接反应体系尤为重要。以反向PCR为代表的连接成环PCR策略是历史上第一次利用PCR技术进行染色体步移。尽管I-PCR应用不多，但它却是利用PCR进
行染色体步移的一块基石，从此以后各种新方法大量涌现。
图2反向PCR原理示意图
2）外源接头介导PCR
外源接头介导PCR是在包含待分离侧翼序列区域的限制性片段外侧连接载体或接头，和原片段一起构成一个序列“已知一未知一已知”的结构，根据两侧的已知序列设计引物，就可以扩增得到中间未知的序列。接头可以是双链也可以是单链，根据所连接的载体或接头的不同，实验程序也存在较大差异。
（1）连接载体的PCR
连接载体的PCR是利用已知基因组DNA序列设计的特异引物和载体通用引物进行扩增获得目的片段的一项PCR技术。Shyamala等利用单特异引物PCR(single specific primer PCR，SSP-PCR)以小鼠伤寒
杆菌组氨酸转运操纵子为起点成功的进行了连续步移。以MI3mpI8RFDNA为载体，用PstI和AraI酶切基
因组DNA，PstI和XmaI酶切载体DNA，然后连接酶切后的基因组片段和载体片段作模板进行PCR扩增。
由于非特异片段没有特异引物结合位点，因此，连接了非特异片段的载体不能得到大量扩增，而使特异片段得到有效扩增。SSP-PCR方法原理简单，实验设计简单，尤其适合于保存有cDNA或基因组文库的实验室，但是其操作较繁琐，特异性较低，产物仍需进行进一步的鉴定。
（2）连接单链接头的PCR
锅柄PCR(pan handle PCR，P—PCR)是连接单链接头PCR的典型代表，因其以一个类似锅柄结构的DNA分子为模板而得名。Jones等率先报道了这一分离侧翼序列的方法，其基本原理见图3。P—PCR 中需要3个根据已知序列设计的引物，3个引物在已知序列内呈线性排列，其中第3个引物可以作为接头使用，与已知序列互补配对形成单链模板。其过程为：首先选择合适的内切酶酶切DNA，产生5或3粘性末端，然后在片段的末端连接上含有3自由端的单链寡核苷酸链，其具有两个特点：一是5端和限制性片段的突出末端互补，二是3自由端与已知序列中的部分片段完全反向互补，连接好以后最好用核酸外切酶I 除去多余的接头，在Taq DNA聚合酶的作用下，沿着3端单链部分完全补平，含有连接片段的单链DNA 在合适的温度下自身退火形成一个含有锅柄结构的环，然后线性排列的3个单引物进行3次PCR扩增，即可获得未知序列片段。Jones等将P—PCR做了一步的改进，他们在形成panhandle结构之前在3末端连上了ddCTP，使引物错配的机率减少，从而使特异性增加，他们利用此法从人类基因组DNA扩增得到4～
9kb的大片段未知序列。
图3锅柄PCR原理示意图
（3）连接双链接头PCR
双链接头法也称为adapter介导的PCR法。其主要过程为首先用能够产生粘性末端的限制性内切酶消化基因组DNA，然后将末端配对的接头和限制性片段连接，以其作模板，用接头引物和已知序列特异引物进行PCR扩增，即可获得包含侧翼序列的目标片段。然而在研究基因组复杂的物种时，针对如何抑制接头到接头的非目标扩增的问题，众多研究者进行了大量的研究，将这一技术不断改进，使其扩增效率更高，特异性更好。
Riley等则设计了一种特殊的被称为Vector-ette的接头，由于接头引物是与中间错配区的一条链的序列完全一致的，因此避免了从接头到接头的非特异扩增，而由于中间有一段序列不配对而形成泡泡型，所以这种PCR也称为泡泡PCR。Rosenthal等设计了捕捉PCR(Capture PCR)，由于这一技术在PCR中特异引物上增加了有利于选择特异产物的生物素标记，因此可通过链霉亲和素包被的磁珠捕捉分离带有生物素标记的单链产物，以其做模板进行二次PCR扩增大大提高了扩增的特异性。Yan等设计了T接头连接的方法(T-linker PCR)来进行染色体步移，原理见图4。T-inker PCR的方法最大的改进在于实现了接头和目标DNA分子的特异性连接，这种特异性连接极大的提高了PCR扩增的特异性和效率，并且不需要低退火，因此一次性扩增得到的片段可以很长。由于T接头构造简单，不需要特殊修饰，不需要任何酶切位点，并且在源头上阻断了非标表片段与接头的连接，提高了扩增的产物真实性，因此在侧翼序列克隆方面具有良好的效果。肖月华等则在YADE(Y．shaped adap．tor dependent extension)扩增技术中采用由多种酶切和连接产生的DNA作模板，大大提高了该方法扩增相邻序列的效率，实现了邻近序列的连续扩增，通过2
轮连续的扩增从7种酶切连接产物中成功地获得了1个棉花小GTP酶基因(GhR-acB)的2228bp上游序列。
3）半随机引物PCR策略
早在1991年Parker等就提出目标基因步行PCR(targeted gene walking PCR)，1993年Sarkar等又报
道了限制位点PCR(restriction site PCR)，其策略都是通过设计一批随机引物和已知序列的特意引物组合扩
增已知序列的侧翼序列，和前两种策略相比较，半随机引物PCR减少了酶切、连接等繁琐的试验操作。但
是长期以来由随机引物引发的非特异性扩增无法有效的得以控制，所以一直没有被广泛应用。近年来，随着研究的不断深人，新Alu-PCR法、DW-ACPT PCR法(DNA Walking-AnnealingControl PrimerTM，即复性控制引物的DNA步行法)和TAIL-PCR法(thermal asymmetric interlaced PCR，即热不对称交错PCR)等新的方法相继问世，很大程度地降低了非特异扩增。
（1）新Alu-PCR
Alu因子是分散于人类基因组中的短片段保守序列，平均大约每4kb的碱基出现一次，研究者利用这一规律，发明了Alu-PCR,从而较容易得从非人类基因组的背景中扩增人类基因组序列。新Alu-PCR则是根据已知序列或是外源插人序列与Alu保守序列设计引物，扩增所需的未知侧翼序列。尽管Alu因子序列保守，但其在人类基因组中的分布却是具有位点随机性，为了降低两个Alu因子之间引发的非目的扩增，需要采取两个措施:一是在PCR扩增中使用不对称引物浓度;二是在Alu因子引物的合成时用dUTP进行修饰，这种引物在扩增10个循环后被尿嚓咤脱氧核糖基酶(UDG)破坏，从而阻止Alu因子引物的单引物扩增。此外，Alu因子若能够被其它物种中的同类物型的分散保守序列所取代，则可以扩大其应用领域。
（2）DW-ACP TM PCR
DW-ACP TM PCR的核心是在随机引物设计中采用了复性控制引物，从而有效地控制了引物的非特异性结合。复性控制引物有3部分组成:3‘端目标核心序列、调节子和5‘端非目标尾部序列(图5)。目标核心序列能够和待扩增区域的某一部位特异结合，但位置随机，非目标尾部序列主要起到调节整条引物Tm值得作用，调节因子是其中关键部分，是由一段多聚脱氧次黄嚷吟核苷酸[poly(dI)]构成。poly(dI)能够和所有的核苷酸配对，但配对是的氢键作用比正常的A-T,G-C弱，因而具有很低的Tm值。通过调解复性温度，在PCR 反应的第一个循环中，ACP TM在和模板DNA作用时，中间的poly(dI)能形成一个气泡状的结构，它能够促进目标核心序列与模板特异性结合而抑制非目标尾部序列与模板的非特异性结合，从而阻碍了非特异性产物扩增。随后由于特异引物1的延伸。构成了完整的DW-ACP引物的模板，DW-ACP引物可以完全退火进行扩增，然后使用DW-ACP引物5'端的通用引物及特异性引物2进行巢式PCR,即可以得到大量的特异产
物，且有效的抑制了非特异性产物产生。
图5ACP TM的结构图及其与模板的作用方式
（3）热不对称交错PCR
热不对称交错PCR由Li和Whiner首先研究并报道，其基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异引物(special primer,spl,sp2,s3)，用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(arbitrary degenerate primer,AD)相结合，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异产物。
以上所述的几种方法基本上代表了现有的染色体步移技术，根据其特点及试验材料的要求，选择恰当的方法是必须考虑的，因此对以上几种方法进行综合比较(表1)。
结合基因组文库的染色体步移技术是在PCR技术发明以前分离侧翼序列的惟一方法，目前仍然为广大科研工作者所采用，其最突出的优点在于步移距离较长、速度较快，可进行连续步移弄清跨度为数百个千碱基(kb)的连接片段；同时，可以一次性获得数个包括启动区，调控区等在内的完整的基因的核苷酸序列信息，适用于遗传背景不是很清楚的情况下通过分子标记克隆未知新基因以及具有高度重复序列或具有复杂结构的核苷酸片段的染色体步移等。但是由于需要构建基因组文库，过程繁琐，工程浩大，费时费力，且成本较高，因此对于近距离单基因的染色体步移，人们更倾向于利用PCR的方法。
基于PCR的染色体步行技术最主要的问题在于如何从序列信息未知的条件下设计两个特异性引物来扩增未知区域。连接成环PCR、外源接头介导PCR以及半随机引物PCR代表了3种不同的解决策略。反向PCR是最早应用于染色体步移的一种方法，操作简单，一次反应能同时分离到目的片段两侧的序列，但对于模板的质量和数量要求严格，如果存在合适的酶切位点，优化自连体系，在DNA片段相对较小时仍然是理想的选择。外源接头介导的PCR策略近年来应用比较多，尤其在T-DNA侧翼序列分析方面，但是该方法操作过程相对复杂，有时还需要末端加尾、去磷酸化或磷酸化等处理，并且扩增长度较短，非特异扩增的风险较大，不适合大规模的样品分析，但是对于同一样品进行连续步移或者多点同时步移时，T-1inker PCR技术就成为了理想的选择。以新Alu-PCR法、DW-ACP PCR和TAIL-PCR法法为代表的半随机引物PCR策略，试验步骤简单，自动化程度高，步行距离长，而且扩增特异性高，因此非常适合大规模的分离侧翼序列，尤其在大规模分析突变体插入位点方面具有绝对的优势。但是，半随机引物PCR也有不尽人意之处，比如新Alu-PCR扩增区域包含有较短的Alu重复序列时，往往得不到目的产物，DW ACP-PCR 和TAIL-PCR随机简并引物存在有限的结合位点，对于高度重复的序列，即使使用不同的简并引物也难以扩增获得阳性结果。因此，在实际操作中研究者往往将上述方法中的两个或两个以上的技术联合使用，尤其是结合基因组文库的染色体步移技术与结合PCR的染色体步移技术在试验中的联合使用，二者优势互
补，实现了长距离快速染色体步移。
三、染色体步移技术之TAIL-PCR
TAIL-PCR 技术简单易行，反应高效灵敏，产物的特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段，已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。下面将分为三大部分向大家详细介绍TAIL-PCR ，首先了解TAIL-PCR 技术的原理、方法等；再从实验出发，了解实验的操作流程、注意事项、结果分析与处理等；最后就一些TAIL-PCR 过程中的常见问题及应对方法等与大家一起讨论。
交错式热不对称PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR ，简称TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA 序列的分子生物学技术，是利用一系列序列特异性的嵌套引物与一个短的简并引物指导扩增已知序列的侧翼序列的反应，为一种半特异的PCR 反应，由于两类引物的退火温度不同从通过控制反应过程中的退火温度而有效地控制特异性和非特异性产物的扩增。该技术由Liu 和Whitter 首先研究并报道。在分子生物学研究领域中，利用该技术分离出的DNA 序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针，也可以直接测序。目前，已成功地从YAC 和BAC 克隆中分离获得插入末端的DNA 序列和拟南芥的T-DNA 侧翼序列。此外，经过改良的TAIL-PCR 技术能够快速克隆Pal 及Pgi 基因的启动子序列和野油菜黄单胞菌群体感应信号基因。该技术的问世，使分子生物学研究工作者能够简易而有效地从已知序列中分离到其邻近的未知侧翼序列，解决有关基因操作的一系列难题。
1、TAIL-PCR 的原理
由一个特异性引物和一个简并引物相组合构成的PCR 反应叫做“半特异性PCR”。这种反应会产生3种不同类型的产物：(1)由特异性引物和简并引物扩增出的产物；(2)由同一特异性引物扩增出的产物；(3)由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL—PCR 反应中，后两种非目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。
TAIL-PCR 技术的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计三个嵌套的特异性引物(special prime ，简称spl ，sp2，sp3)，用它们分别和一个具有低Tm 值的短的随机简并引物(Arbitrary degenerate prime ，简称AD)相组合，以基因组DNA 作为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过
三轮PCR反应来扩增特异产物。反应流程如图1至图3所示。
TAIL-PCR一般分为三轮PCR反应。第一轮PCR反应（如图5）由五次高退火温度（一般65℃）的特异性反应、一次极低退火温度（一般25℃）的低特异性反应，与由二个高退火温度（一般65℃）的高特异性反应与一个低退火温度（一般44℃）的低特异性反应所组成的15个热不对称的超级循环构成。通过五次高特异性的反应，使spl与已知的序列(载体或T-DNA等)退火并延伸，提高目标序列的浓度。一次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上，随后进行15次热不对称的超级循环。经过上述反应得到了不同浓度的三种类型的产物：由特异性引物和简并引物扩增出的特异性产物和由同一简并引物或特异引物扩增得到的非特异性产物。第二轮PCR反应（如图6）则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过15次热不对称的超级循环，使特异性的产物被选择性地扩增，而非特异性的产物被压制到极低的含量。第三轮PCR反应（如图7）又将第二轮PCR反应的产物稀释1000倍作为模板，一般设置为普通的PCR反
应或热不对称的超级循环。通过上述三轮PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。
图5第一轮PCR反应
图6第二轮PCR反应
图7第三轮PCR反应
2、TAIL-PCR的优点以及技术难点
常规的PCR只能扩增两引物之间的DNA区段，难以对已知DNA序列侧翼的未知序列进行扩增。Reverse PCR、Hemispecific、one—sided PCR等方法可以部分地克服上述缺点，但在PCR反应前必须作酶切、连接、加尾等一系列繁琐的操作。TAII-PCR技术能够快速地分离到目标序列，对基因克隆研究具有重要的意义。
TAIL-PCR技术有以下优点：
(1)简单。只要设计好引物，即可以用基因组DNA作模板直接筛选到目标序列。节省了PCR反应前后的许多费时、费力的操作程序。只需几纳克的DNA即可作为模板，对其纯度的要求也不很高。
(2)特异性高。用短的简并引物和长的特异性嵌套引物相组合，通过不对称的温度循环和分级反应，使反应体系有利于特异引物的扩增，最终的扩增产物中目的片段占绝对优势，反应产物可以直接用做探针标记和测序模板。
(3)高效灵敏。使用任何一个AD引物，在6O～8O9／6的反应中能够产生特异性产物。运用不同的AD 引物就能够有效地扩增到目标片段。
(4)快速。整个TAIL-PCR反应循环能够在1d内完成，可以快速地获得目标片段。
(5)不涉及连接反应，反应产物准确可靠，重复性好。
TAIL-PCR反应需要较多的引物组合。此外，由于AD引物存在有限的结合位点，对于个别的侧翼序列，即使使用不同的简并引物也难以扩增到阳性结果。整个TAIL-PCR需要一系列连续的反应，反应条件的设置要求比较精细。
3、TAIL-PCR的操作流程
1）基因组DNA的获取：
基因组DNA的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。最好不要使用只经过简单处理的基因组DNA（例如：只进行细胞热处理或蛋白酶处理）作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组DNA。此外，由于本方法灵敏度极高，模板DNA一定不要污染，所需的DNA量不要少于3μg。不同物种基因组DNA 模板的使用量有不同的要求，具体见下表：
细菌基因组的具体提取方法可参考溶菌酶法：
（1
）
溶菌酶缓冲液的配方：0.3M蔗糖，25mM EDTA(pH8.0),25mM Tris-Hcl(pH8.0)；
（2）37℃过夜培养菌种100mL，培养好以后（菌体不要长的太浓，刚过对数期最好），离心，去除培养基，菌体用无菌水洗一次，离心，留菌体；
（3）加入15mL5mg/mL的溶菌酶，用移液器将管底的菌体吹悬起来，然后37℃水浴2h，在此过程中，每隔15min左右颠倒一下试管，以使菌体和溶菌酶充分作用；
（4）2h后，再补加5mL5mg/mL的溶菌酶，45℃水浴30min；
（5）水浴过后，向体系中加入5mL10%的SDS(只要使SDS的终浓度达到2%即可)，轻轻颠倒几次便可进行抽提处理；
（6）抽提时，先用等体积的酚抽提一次，然后用等体积的酚:氯仿抽提一次，最后再用等体积的氯仿:异戊醇抽提一次。（即总共抽提3次）；
（7）抽提完以后，上清用0.7-1倍体积的异丙醇沉淀DNA；
（8）沉淀下来的DNA用70%的乙醇洗一次，真空冷冻抽干后，加无菌水重溶。
（9）所提DNA用1.0%琼脂糖凝胶进行分析，紫外观测仪观测。
不同物种动物植物微生物
基因组用量0.1～1μg0.1～1μg10～100ng
真菌或植物基因组具体提取方法可参考CTAB/SDS法：
（1）将研钵用酒精灼烧消毒灭菌后，在冰上冷置一会，最后用液氮预冷后准备研磨样品。
（2）培养5ml的细胞培养物至饱和状态，取1.5ml的培养物离心5min收集菌体，将表面的水吸干后，研磨至粉末状倒入1.5mlEP管中，加入600μL冰预冷的基因提取液（50mM TrisCl(pH8.0)、100mM EDTA(pH8.0)与150mM NaCl的混合液），振荡混匀。
（3）加入30μL10%SDS和3μL20mg/ml蛋白酶K，混匀后37℃温育1h。
（4）加入112.5μL5M NaCl(在800ml水中溶解292.2g NaCl加水定容至1L)充分混匀后，再加入预热的65μL CTAB/NaCl溶液(在80ml蒸馏水中溶解4.1g NaCl，缓慢加入10g CTAB（十六烷基三乙基溴化铵），同时加热并搅拌。如果需要，可加热至65℃溶解。定容终体积至100ml)，混匀后65℃温浴30min。
（5）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，混匀，12000rpm离心10min，将上清液转入一个新管中。
（6）加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀，12000rpm离心10min，将上清液转入一支新管中。
（7）加入等体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，室温放置10min，12000rpm离心10min，收集沉淀。
（8）用600μL70%乙醇洗涤沉淀两次，真空冷冻抽干后，加无菌水重溶。
（9）所提DNA用1.0%琼脂糖凝胶进行分析，紫外观测仪观测。
2）已知序列的验证：
在进行PCR实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为：根据已知序列设计特异性引物（扩增长度最好不少于500bp），对模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。
3）特异性引物的设计：
根据验证的已知序列，按照前述的特异性引物设计原则设计三条特异性引物，即：SP1、SP2、SP3。
4）1st PCR反应：
基因组DNA经OD测定准确定量后，取适量作为模板（不同物种的最佳反应DNA量并不相同，实际用量参考下面的注*1），以AP Primer（四种中的任意一种，以下以AP1Primer为例）作为上游引物，SP1Primer 为下游引物，进行1st PCR反应。
①按下列组份配制1st PCR反应液：
②1st PCR反应条件如下：
将1st PCR反应液稀释1-1000倍后，取1μl作为2nd PCR反应的模板，以AD引物为上游引物，SP2引物为下游引物，进行2nd PCR反应。
①按下列组份配制2nd PCR反应液：
②2nd PCR反应条件如下：
6)3rd PCR反应：
将2nd PCR反应液稀释1-1000倍后，取1μl作为3rd PCR反应的模板，以AD引物为上游引物，SP3引物
为下游引物，进行3rd PCR反应。
①按下列组份配制3rd PCR反应液：
②3rd PCR反应条件如下：
8)切胶回收清晰的电泳条带，以SP3Primer为引物对PCR产物进行DNA测序
图8TAIL-PCR的实验操作流程
4、TAIL-PCR中的注意事项
TAIL——PCR的引物设计
1)TAIL
（1）特异嵌套引物与简并引物的退火温度要求至少相差10度以上；
（2）简并引物：按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计一系列简并引物；简并引物相对较短，长度为14bp退火温度在40℃，要考虑到兼并性。为了增加简并引物与目标序列间退火的可能性，除了3端的3个碱基以外，其它位置的碱基包含简并核苷酸。
（3）特异性引物的设计：
根据经过验证的已知序列区（最好不少于500bp）设计三个特异性引物（见上图）：设计方向为需要扩增的未知区域方向，SP2的位置应设计在SP1的内侧，SP3位于SP2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，一般以60-100bp为宜。引物设计原则：引物的长度为22-26nt，GC含量45-55％，Tm值60-70℃，引物Tm值计算公式：Tm=69.3+0.41（G/C）%×100-650/L（引物碱基数）。在设计特异性引物时，SP3P ri m e r 不要距离未知序列区域太远，一般以100~200bp为宜，以增加获取未知序引物设计列的有效长度。其他要求和普通PCR反应用引物相同。
TAIL——PCR的引物浓度
2）TAIL
为减少错配，特异引物应保持较低浓度；而简并引物的浓度要高，一般为2．5～5．0pmol/μL，以满足引物的结合效率。
3）模板的稀释倍数
根据需要将上一步PCR反应液稀释1～1000倍后，取1μl作为模板。此时首先建议使用PCR反应原液1μl 作为模板进行PCR反应。如果PCR扩增效果不理想，可以适当稀释PCR反应原液，再取1μl进行PCR反应。适当时，可以摸索一个稀释倍数的梯度，来确定最佳的稀释倍数。
4）反应条件
特异性引物和简并引物的选择直接影响扩增的效果。如果不能获得满意的扩增结果，则应该在预备实
验中重新设计特异性引物或者换用其它的简并引物。
在TAIL-PCR反应中，高特异性循环的退火温度设为65℃左右，较低特异性循环的退火温度设为44℃，低特异性循环的退火温度设为25～3O℃。在高严紧的循环中，退火温度要尽可能高，比特异引物的Tm 值要高1-5度。
可根据需要选择延伸时间，延伸时间长可以获取较长的DNA片段，但是容易产生非特异性PCR扩增。推荐延伸时间为2min。
5）TAIL-PCR产物分析
在多数情况下，第一轮反应有较多的非特异性产物（如图9与图10所示）。由sp1和AD为引物扩增出的
特异性片段在第一轮反应中由于量少而不一定能显现出来。当用sp2替代spl进行第二轮反应后，一些非特异性条带消失，特异性的产物被选择性地扩增而显现。欲增加产物的特异性，可以再把第三轮反应设置为热不对称的循环。由于特异性引物在第一轮反应中一般不能扩增到可被检测的水平，因此可以省去第一轮反应产物的琼脂糖凝胶电泳分析，仅仅检测第二轮和第三轮反应的产物来获得特异性的目标片段。取第第二轮和第三轮反应产物成对点样。由于特异引物是嵌套的，因此特异性扩增的特点是第三轮反应产物小于第二轮反应产物。不同的AD引物的扩增效率不同。有效的TAII-PCR扩增出的目标片段的大小应该在250bp-2kb。由于AD引物在特异性引物的下游有多个退火位点，同一目标序列有时会产生一个以上不同长度的特
异性片段（如图10所示），这时可以有选择地选取较大的片段进行后续试验处理。
图9TAIL-PCR的琼脂糖凝胶电泳结果1
5、常见问题分析
1）若三次PCR扩增结果均显示清晰条带，是否要将三次的清晰条带都进行DNA的回收测序？
答：不需要。后一个特异性产物要比前一个短60~100bp，当3rd PCR产物比2nd PCR产物稍短时，可以只回收3rd PCR产物。1st PCR产物基本上是AP引物的自扩产物或SP1引物的非特异性扩增结果，不需要
回收测序。
2)如果四种AP引物都没有扩增得到清晰条带，原因是什么？应采取什么解决措施？
答：①如果后两次PCR扩增都没有得到清晰条带，可以尝试将上一步的PCR反应液进行适当倍数稀释，然后再进行PCR反应。
②可能是起始基因组DNA模板中存在有抑制PCR反应的物质，此时可以尝试降低基因组DNA的用量或重新纯化基因组DNA。
③特异性引物的设计对侧翼序列的获取起有至关重要的作用。当使用四条AP引物均无理想结果时，应考虑重新设计特异性引物。特异性引物设计时应严格遵守说明书中关于特异性引物设计的原则。
④可以尝试适当增加3rd PCR反应的循环圈数。
3）获取的侧翼序列测序有套峰，是什么原因？
答：原因可能是非特异性扩增，或PCR产物不纯，也有可能是DNA本身结构复杂。可以重新设计测序引物，或考虑克隆测序。
4）第一次和第二次反应能否使用25μl体系？
答：用25μl反应体系结果并不如50μl体系理想，所以最好使用50μl反应体系以减少干扰因素。
5）是否可以使用一般的Taq酶代替TaKaRa LA Taq?？
答：用其它Taq酶结果不如TaKaRa LA Taq?理想。若要获取较长的扩增产物，最好使用TaKaRa LA Taq?。
染色体步移步骤
染色体步移技术（Genome Walking）是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用： 1. 根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究； 2. 步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列； 3. 鉴定T-DNA 或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等； 4. 用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列； 5. 用于人工染色体PAC、YAC 和BAC 的片段搭接。 其主要原理是根据 已知DNA 序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP Primer），与退火温度较低的兼并引物，进行热不对称PCR 反应。 现在有很多Genome Walking Kit，相应的说明书都介绍的很详尽，下面给你发一个原理图：
大致的原理是这样的，依据TaKaRa的试剂盒，具体的操作步骤如下： 1. 基因组DNA 的获取。 基因组DNA 的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。建议不要使用只经过简单处理的基因 组DNA（例如：只进行细胞热处理或蛋白酶处理）作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组 DNA。此外，由于本方法灵敏度极高，模板DNA 一定不要污染，所需的DNA 量不要少于3 μg。 2. 已知序列的验证。 在进行PCR 实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为：根据已知序 列设计特异性引物（扩增长度最好不少于500 bp），对模板进行PCR 扩增，然后对PCR 产物进行测 序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。 3. 特异性引物的设计。 根据验证的已知序列，按照前述的特异性引物设计原则设计三条特异性引物，即：SP1、SP2、SP3。 4. 1st PCR 反应。 基因组DNA 经OD 测定准确定量后，取适量作为模板（不同物种的最佳反应DNA 量并不相同，实际 用量参考下面的注*1），以AP Primer（四种中的任意一种，以下以AP1 Primer 为例）作为上游引 物，SP1 Primer 为下游引物，进行1st PCR 反应。
基因组学重点整理
生物五界：动物、植物、真菌、原生生物和原核生物；生物三界：真细菌、古细菌、真核生物 具有催化活性的RNA分子称为核酶（ribozyme）核酶催化的生化反应有：自我剪接、催化切断其它RNA、合成多肽键、催化核苷酸的合成 新基因的产生：基因与基因组加倍1）整个基因组加倍；2）单条或部分染色体加倍；3）单个或成群基因加倍。DNA水平转移：原核生物中的DNA水平转移可通过接合转移，噬菌体转染，外源DNA的摄取等不同途径发生，水平转移的基因大多为非必须基因。动物中由于种间隔离不易进行种间杂交，但其主要来源于真核细胞与原核细胞的内共生。动物种间基因转移主要集中在逆转录病毒及其转座成分。 外显子洗牌与蛋白质创新：产生全新功能蛋白质的方式有二种：功能域加倍，功能域或外显子洗牌 基因冗余：一条染色体上出现一个基因的很多复份(复本）当人们分离到某一新基因时，为了鉴定其生物学功能，常常使其失活，然后观察它们对表型的影响。许多场合，由于第二个重复的功能基因可取代失活的基因而使突变型表型保持正常。这意味着，基因组中有冗余基因存在。看家基因很少重复，它们之间必需保持剂量平衡，因此重复的拷贝很快被淘汰。与个体发育调控相关的基因表达为转录因子，具有多功能域的结构。这类基因重复拷贝变异可使其获得不同的表达控制模式，促使细胞的分化与多样性的产生，并导致复杂形态的建成，具有许多冗余基因。 非编码序列扩张方式：滑序复制、转座因子 模式生物海胆、果蝇、斑马鱼、线虫、蟾蜍、小鼠、酵母、水稻、拟南芥等。模式生物基因组中G+C%含量高, 同时CpG 岛的比例也高。进化程度越高, G+C 含量和CpG 岛的比例就比较低 如果基因之间不存在重叠顺序，也无基因内基因（gene-within-gene），那么ORF阅读出现差错的可能只会发生在非编码区。细菌基因组中缺少内含子，非编码序列仅占11%, 对阅读框的排查干扰较少。细菌基因组的ORF阅读相对比较简单，错误的机率较少。高等真核生物DNA的ORF阅读比较复杂：基因间存在大量非编码序列（人类占70%）；绝大多数基因内含有非编码的内含子。高等真核生物多数外显子的长度少于100个密码子 内含子和外显子序列上的差异：内含子的碱基代换很少受自然选择的压力，保留了较多突变。由于碱基突变趋势大多为C-T,故A/T的含量内含子高于外显子。由于终止密码子为TAA\TAG\TGA，如果以内含子作为编码序列，3种读码框有很高比例的终止密码子。 基因注释程序编写的依据：1）信号指令，包括起始密码子，终止密码子，终止信号，剪接受体位和供体位，多聚嘧啶序列，分支点保守序列2）内容指令，密码子偏好，内含子和外显子长短 基因功能的检测：基因失活、基因过表达、RNAi干涉 双链DNA的测序可从一端开始，亦可从两端进行，前者称单向测序，后者称双向测序。 要获得大于50 kb的DNA限制性片段必需采用稀有切点限制酶。 酵母人工染色体（YAC）1）着丝粒在细胞分裂时负责染色体均等分配。2）端粒位于染色体端部的特异DNA序列，保持人工染色体的稳定性3）自主复制起始点（ARS）在细胞中启动染色体的复制 合格的STS要满足2个条件：它应是一段序列已知的片段，可据此设计PCR反应来检测不同的DNA片段中是否存在这一顺序；STS必需在染色体上有独一无二的位置。如果某一STS在基因组中多个位点出现，那么由此得出的作图数据将是含混不清的。 遗传图绘制主要依据由孟德尔描述的遗传学原理，第一条定律为等位基因随机分离，第二条定律为非等位基因自由组合，显隐性规律/不完全显性、共显性、连锁 衡量遗传图谱的水平覆盖程度饱和程度 基因类型：transcribed, translatable gene (蛋白基因) ；transcribed but non-translatable gene ( RNA基因)Non- transcribed, non-translatablegene ( promoter, operator ) rRNA基因，tRNA基因, scRNA基因, snRNA基因, snoRNA基因, microRNA基因 基因组(genome)：生物所具有的携带遗传信息的遗传物质总和。 基因组学（genomic）：用于概括涉及基因作图、测序和整个基因功能分析的遗传学分支。 染色体组（chromosome set）：不同真核生物核基因组均由一定数目的染色体组成，单倍体细胞所含有的全套染色体。 比较基因组学（comparative genomics）：比较基因组学是基因组学与生物信息学的一个重要分支。通过模式生物基因组与人类基因组之间的比较与鉴别，为分离重要的候选基因，预测新的基因功能，研究生物进化提供依据。（目标）
基于PCR的染色体步移
１依赖酶切连接的PCR 这类方法首先对基因组DNA酶切之后，然后让酶切产物自我成环或在酶切产物末端加上相应的接头。以已知序列上的特异引物或接头上的锚定引物，扩增已知序列的上下游侧翼序列。 1.1 反向PCR 反向PCR（inversPCR，IPCR）是Triglia等提出的扩增已知序列上游和下游未知序列的方法。该方法的基本原理是对已知序列进行分析，选择已知序列中没有的限制性内切酶位点，酶切基因组DNA后，酶切片段环化自连，然后利用已知序列设计的反向引物，扩增已知序列两侧的未知序列，原理如图１。因此，这种方法包含以下３个步骤：（１）基因组DNA 酶切；（２）线性酶切产物环化；（３）已知序列处设计的反向引物扩增目标片段。在PCR 扩增之前，也可以根据已知序列用合适的内切酶将环化的DNA切割成线性DNA，这样更利于PCR反应的进行。 图1：反向PCR原理图 最初，IPCR用于扩增基因组DNA的侧翼未知序列，后来利用T4聚合酶补平双链cDNA 末端后再环化，可以有效扩增已知cDNA的侧翼未知序列。然而，IPCR存在技术缺点：（１）环化过程难以控制，基因组DNA酶切后，不同的酶切片段连接成线性串联体，致使非特异性扩增；（２）基因组DNA酶切位点随机分布，可能产生过长的酶切片段导致PCR扩增效率下降，成功率降低。Benkel等在此基础上对IPCR的反应体系改进，可以扩增长达40Kb的片段。Kohda等在对基因组DNA酶切之后，环化连接过程中，酶切位点之间加上一段桥连片段，有效扩增侧翼片段，这种方法称为桥连反向PCR（BI-PCR）。BI-PCR扩增的特异性更高，操作更加简便。最近，Tsaftaris等利用改进的滚环复制反向PCR从植物基因组DNA中成功分离出3Kb的启动子序列。以IPCR为代表的连接成环PCR策略是首次利用PCR技术进行的染色体步移技术。以此为基础，对基因组DNA酶切，在酶切末端加上接头或通过相应的方法在酶切末端加上已知序列，获得目标序列的PCR扩增的染色体步移技术大量涌现。 1.2 载体PCR 载体PCR（single specific primePCR，SSP-PCR）是通过把基因组DNA酶切之后，连接到质 粒载体（如ＳpBluescript KS）上，并用依据已知序列设计的特异引物和载体上的通用引物特异扩增目标片段的一种PCR染色体步移技术。
植物基因克隆
来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较 基因是遗传物质基本的功能单位，分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础，因此，克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同，所以获得目的基因的难易程度又不一样，特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术，染色体步移法和同源克隆法等，本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用，并且比较分析这几种方法的优缺点，为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列，若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样，但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长，因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的，因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。 笔者主要介绍两种比较新的RACE技术，基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7，12]
应用于染色体步移的PCR扩增技术的研究进展
遗 传HEREDIT AS (Beijing )28(5):587～595,2006 专论与综述 收稿日期:20050907;修回日期:20051109 作者简介:刘 博(1979— ),男,黑龙江人,硕士生,专业方向:植物基因工程。Tel :0411287509077;E 2mail :ppic9k @https://www.360docs.net/doc/668253332.html, 通讯作者:安利佳(1955— ),男,教授,博士生导师,研究方向:植物基因工程及基因工程药物。Tel :0411284706365;E 2mail :bioeng @https://www.360docs.net/doc/668253332.html, 应用于染色体步移的PCR 扩增技术的研究进展 刘 博1,2,苏 乔1,汤敏谦2,袁晓东2,安利佳1 (1.大连理工大学环境与生命科学院,大连116023;2.宝生物工程(大连)有限公司,大连116600) 摘 要:各种建立在PCR 基础上染色体步移的方法能够根据已知的基因序列得到侧翼的基因序列。染色体步移技术主要应用于克隆启动子、步查获得新物种中基因的非保守区域、鉴定T 2DNA 或转座子的插入位点、染色体测序工作中的空隙填补,从而获得完整的基因组序列等方面。其方法主要有3种:反向PCR 的方法,连接法介导的PCR 的方法以及特异引物PCR 的方法。文章就各种方法进行举例说明并加以分析比较。关键词:染色体步移;反向PCR ;连接法PCR ;特异引物PCR 中图分类号:Q75 文献标识码:A 文章编号:0253-9772(2006)05-0587-09 Progres s of the PCR Amplification T echniques f or Chromos ome Walking LI U Bo 1,2,SU Qiao 1,T ANG Min 2Qian 2,Y UAN X iao 2Dong 2,AN Li 2Jia 1 (1.School of Environmental and Biological Science and Technology ,Dalian University of Technology ,Dalian 116023,China ;2.Ta KaRa Biotechnology (Dalian )Co.,Ltd.Dalian 116600,China ) Abs t ra ct :Various PCR 2based methods are available for chromosome walking from a known sequence to an unknown region.It is promising in genome 2related re search for the following experiments :promoter cloning ,obtaining non 2con 2servative parts of genes in new species ,identification of T 2DNA or transposon insertion site s and filling in gap s or un 2known chromosome regions in genome sequencing.The se methods consisted of three type s :inverse PCR ,ligation 2me 2diated PCR and specific primer PCR.In this review ,we illustrated and compared the current techniques.Ke y w or ds :chromosome walking ;inverse PCR ;ligation 2mediated PCR ;specific primer PCR 获得与已知序列相邻的未知序列的染色体步移技术是一项重要的分子生物学研究技术。染色体步移技术主要有以下几方面的应用:(1)根据已知的基因或分子标记连续步移获取人、动物和植物的重要调控基因,用于研究结构基因的表达调控,如:分离克隆启动子并对其功能的研究;(2)步查获得新物种中基因的非保守区域,从而获得完整的基因序列;(3)鉴定T 2DNA 或转座子的插入位点,以及鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点;(4)用于染色体测序工作中的空隙填补,从而获得完整的基因组序列;(5)用于人工染色体PAC 、Y AC 和BAC 的片段搭接。对于基因组测序已 经完成的少数物种(如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥 等)来说,可以轻松地从数据库中找到已知序列的侧翼序列。但是这毕竟只是研究少数模式生物时的情况,对于自然界中种类繁多的其他生物而言,在不知道它们的基因组DNA 序列以前,想要知道一个已知区域两侧的DNA 序列,只能采用染色体步移技术。因而,染色体步移技术在现代分子生物学研究中占有举足轻重的地位,是结构基因组研究以及功能基因组研究的基础。 自从PCR 技术发明以来,人们就在PCR 技术的基础上设计了多种扩增未知序列的染色体步移的方法,这些方法依其原理可分为3类:反向PCR 的
染色体步移技术
染色体步移技术（Genome Walking） 染色体步行是一种常用的克隆已知基因旁侧序列的技术。染色体步行是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列的核苷酸。 现有的染色体步行PCR技术包括反向PCR、锅柄PCR、连接介导PCR、热不对称PCR、SON PCR等染色体步移技术主要有以下几方面的应用： 1. 根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究； 2. 步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列； 3. 鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等； 4. 用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列； 5. 用于人工染色体PAC、Y AC 和BAC 的片段搭接。 其主要原理是根据已知DNA 序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP Primer），与退火温度较低的兼并引物，进行热不对称PCR 反应。 现在有很多Genome Walking Kit，相应的说明书都介绍得很详尽，下面给你发一个原理图： 依据TaKaRa的试剂盒，具体的操作步骤如下： 1. 基因组DNA的获取。 基因组DNA的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。建议不要使用只经过简单
组DNA（例如：只进行细胞热处理或蛋白酶处理）作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组 DNA。此外，由于本方法灵敏度极高，模板DNA一定不要污染，所需的DNA量不要少于 3 μg。 2. 已知序列的验证。 在进行PCR 实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为：根据已知序 列设计特异性引物（扩增长度最好不少于500 bp），对模板进行PCR 扩增，然后对PCR 产物进行测 序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。 3. 特异性引物的设计。 根据验证的已知序列，按照前述的特异性引物设计原则设计三条特异性引物，即：SP1、SP2、SP3。 4. 1st PCR 反应。 基因组DNA经OD 测定准确定量后，取适量作为模板（不同物种的最佳反应DNA量并不相同，实际 用量参考下面的注*1），以AP Primer（四种中的任意一种，以下以AP1 Primer 为例）作为上游引 物，SP1 Primer 为下游引物，进行1st PCR 反应。 ①按下列组份配制1st PCR反应液。 Template（基因组DNA）x ng *1 dNTP Mixture（2.5 mΜ each ）8 μl 10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus） 5 μl TaKaRa LA Taq ?（5 U/μl）0.5 μl AP1 Primer（100 pmol/μl） 1 μl SP1 Primer（10 pmol/μl） 1 μl dH2O up to 50 μl ②1st PCR 反应条件如下： 94℃ 1 min 98℃ 1 min 94℃30 sec 60~68℃*2 1 min 5 Cycles 72℃2~4 min*3 94℃30 sec；25℃ 3 min；72℃2~4 min*3 94℃30 sec；60~68℃*2 1 min；72℃2~4 min*3 94℃30 sec；60~68℃*2 1 min；72℃2~4 min*3 15 Cycles 94℃30 sec；44℃ 1 min；72℃2~4 min*3 72℃10 min 5. 2nd PCR 反应。 将1st PCR反应液稀释1~1000 倍后，取1 μl作为2nd PCR反应的模板，以AP1 Primer 为上游引 物，SP2 Primer为下游引物，进行2nd
遗传学名词解释(中英对照版)
遗传学名词解释（中英对照版） abortive transduction 流产转导：转导的DNA片段末端掺入到受体的染色体中，在后代中丢失。 acentric chromosome 端着丝粒染色体：染色体的着丝粒在最末端。 Achondroplasia 软骨发育不全：人类的一种常染色体显性遗传病，表型为四肢粗短，鞍鼻，腰椎前凸。 acrocetric chromosome 近端着丝粒染色体：着丝粒位于染色体末端附近。 active site 活性位点：蛋白质结构中具有生物活性的结构域。 adapation 适应：在进化中一些生物的可遗传性状发生改变，使其在一定的环境能更好地生存和繁殖。 adenine 腺嘌呤：在DNA中和胸腺嘧啶配对的碱基。 albino 白化体：一种常染色体隐性遗传突变。动物或人的皮肤及毛发呈白色，主要因为在黑色素合成过程中，控制合成酪氨酸酶的基因发生突变所致。 allele 等位基因：一个座位上的基因所具有的几种不同形式之一。 allelic frequencies （one frequencies）在群体中存在于所有个体中某一个座位上等位基因的频率。 allelic exclusion 等位排斥：杂合状态的免疫球蛋白基因座位中，只有一个基因因重排而得以表达，其等位基因不再重排而无活性。 allopolyploicly 异源多倍体：多倍体的生物中有一套或多套染色体来源于不同物种。 Ames test 埃姆斯测验法：Bruce Ames 于1970年人用鼠伤寒沙门氏菌（大鼠）肝微粒体法来检测某些物质是否有诱变作用。 amino acids 氨基酸：是构成蛋白质的基本单位，自然界中存在20种不同的氨基酸。 aminoacyl-tRNA 氨基酰- tRNA：tRNA的氨基臂上结合有相应的氨基酸，并将氨基酸运转到核糖体上合成蛋白质。 aminoacyl-tRNA synthetase 氨基酰- tRNA合成酶：催化一个特定的tRNA结合到相应的tRNA分子上。因有20种氨基酸，故有20种氨基酰- tRNA合成酶。 amniocentesis 羊膜穿刺术：产前诊断中一种采羊水的方法。 amorph 无效等位基因：一种突变的形式，突变后的基因不能指令合成有功能的蛋白质。 amphiodiploid 双二倍体：即异源四倍体。 amplification 扩增：许多DNA拷贝的产物来自DNA的一个主要区域。 aneuploid 非整倍体：一种染色体数目的变异体，细胞中增加或减少一条或几条染色体。 annealing 退火：即DNA复性，降低温度使两条DNA单链重新互补结合形成双链的过程。 antibody 抗体：一种免疫蛋白分子，由免疫系统产生，可识别特异抗原并与之结合。 anticodon 反密码子：在tRNA的反密码子环上的三个相连的碱基可和mRNA上的密码子 互补结合。 antigen 抗原：任何一种可刺激机体产生抗体，并能与之特异结合的大分之物质。 AP site AP位点：即脱嘧啶脱嘌呤的位点，由DNA上碱基糖苷链的断裂形成，在修复时可供脱嘧啶嘌呤内切酶识别。 ascospore 子囊孢子：某些真菌产生的有性孢子，位于子囊中，为单倍性，常呈线状排列。 attached X 并联X染色体：一对果蝇的X染色体端端相连，作为一个单位进行遗传。
遗传学名词解释
小木虫 遗传学名词解释！！！ A 腺嘌呤(adenine) abortive transduction 流产转导：转导的DNA片段末端掺入到受体的染色体中，在 后代中丢失。 acentric chromosome 端着丝粒染色体：染色体的着丝粒在最末端。Achondroplasia 软骨发育不全：人类的一种常染色体显性遗传病，表型为四肢粗短，鞍鼻，腰椎前凸。 acrocetric chromosome 近端着丝粒染色体：着丝粒位于染色体末端附近。 active site 活性位点：蛋白质结构中具有生物活性的结构域。 adapation 适应：在进化中一些生物的可遗传性状发生改变，使其在一定的环境能 更好地生存和繁殖。 adenine 腺嘌呤：在DNA中和胸腺嘧啶配对的碱基。 albino 白化体：一种常染色体隐性遗传突变。动物或人的皮肤及毛发呈白色，主 要因为在黑色素合成过程中，控制合成酪氨酸酶的基因发生突变所致。 allele 等位基因：一个座位上的基因所具有的几种不同形式之一。 allelic frequencies (one frequencies) 在群体中存在于所有个体中某一个座位上等位 基因的频率。 allelic exclusion 等位排斥：杂合状态的免疫球蛋白基因座位中，只有一个基因因 重排而得以表达，其等位基因不再重排而无活性。 allopolyploicly 异源多倍体：多倍体的生物中有一套或多套染色体来源于不同物种。Ames test 埃姆斯测验法： Bruce Ames 于1970年人用鼠伤寒沙门氏菌（大鼠）肝 微粒体法来检测某些物质是否有诱变作用。
染色体步移技术
螺旋讲堂2010年第4期总第23期 染色体步移 内容概览： 一、染色体步移技术概述 二、常见的染色体步移技术介绍 1、结合基因组文库的染色体步移技术 1） 物理剪切法构建亚克隆文库2） 限制性内切酶法构建亚克隆文库2、基于PCR 技术的染色体步移技术 1） 连接成环PCR 2）外源接头介导PCR （1）连接载体的PCR （2）连接单链接头的PCR （3）连接双链接头PCR 3）半随机引物PCR 策略 （1）新Alu-PCR （2）DW-ACP TM PCR （3）热不对称交错PCR （TAIL-PCR ） 三、染色体步移技术之TAIL-PCR 1、TAIL-PCR 的原理 2、TAIL-PCR 的优点以及技术难点 3、TAIL-PCR 的操作流程 4、TAIL-PCR 中的注意事项 5、常见问题分析 生物人的网上家园 plum 螺旋网HelixNet 染色体步移技术是一种常用的克隆已知片段旁侧序列的技术。本文中主要总结了近年来染色体步移技术的发展情况，介绍了结合基因组文库的染色体步移技术和 基于PCR 的染色体步移技术，并且比较了他们之间的优缺点，最后着重与大家一起 讨论一下TAIL-PCR 的相关内容，希望能对大家有所帮助。
一、染色体步移技术概述 染色体步移(Chromosome walking)又称为基因组步移（Genome walking）是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目标序列的方法。对于已经完成基因组测序的模式生物种(如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等)，可直接从数据库中轻松的找到已知序列的侧翼序列。但是目前为止，自然界中大多数生物基因组DNA序列仍未知，要想知道一个已知区域两侧的DNA序列，染色体步移无疑是一种非常有效的方法。因此，染色体步移技术在现代分子生物学研究中较为重要，本文主要就染色体步移的相关方法，不同方法之间的比较，着重以TAIL-PCR的原理，实验操作及注意事项等进行讨论。 染色体步移技术的主要应用可归结为以下5个方面： （1）鉴定T—DNA或转座子的插入位点，鉴定转基因技术所导致的外源基因的插入位点； （2）根据基因的已知片段、EST或插入的转座子序列克隆目的基因，分离基因的启动子及调控元件； （3）用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接； （4）构建图位克隆中的重叠群； （5）转化标记辅助育种中的STS或SCAR标记等。 二、常见的染色体步移技术介绍 目前，分离侧翼序列的染色体步移方法主要有两种，一是结合基因组文库为主要手段的染色体步移技术，构建基因组文库进行染色体步移尽管步骤比较繁琐，但是适于长距离步移，可以获得代表某一特定染色体的较长连续区段的重叠基因组克隆群。随着亚克隆文库条件构建条件的优化及测序技术的进步，这种方法也将更加快捷，准确。另一个是基于PCR扩增为主要手段的染色体步移技术。基于PCR扩增为主要手段的染色体步移技术步移距离相对较短，但是操作比较简单，尤其适合于已知一段核苷酸序列的情况下进行的染色体步移。在此基础上人们相继发明了十几种侧翼序列克隆的方法，依据其技术原理，可以将这些方法分为3类：连接成环PCR、外源接头介导PCR和半随机引物PCR。 1、结合基因组文库的染色体步移技术 基因组文库是指生物体全部DNA，经过合适的核酸内切酶消化或机械切割以后，克隆到适当的载体分子中，构成重组体分子群体，然后转化给诸如大肠杆菌这样的寄主菌株进行复制繁殖，如此构建的理论上含有生物体整个基因组全部遗传信息的克隆集合体，称作基因组文库，它是进行基因组学研究的重要技术平台，在基因组物理图谱的构建以及基因的图位克隆中发挥了重要作用。基因组文库的种类主要有入噬菌体文库、酵母人工染色体文库(yeast artificial chromosome，YAC)、P1噬菌体文库和细菌人工染色体文库(bacterial artificial chromosome，BAC)等。其中，BAC文库因其插入片段大、嵌合率低、遗传稳定性好、 易于操作等优点而备受青睐，近年来，小麦、棉花、水稻等越来越多的物种构建了BAC文库。 在基因克隆中，该方法用于鉴定一系列彼此重叠的DNA限制片段，分离序列及表达产物未知的基因，特别 是发育相关的基因。利用基因组文库克隆目的基因，首先要有一个根据目的基因建立起来的遗传分离群体， 找到与目的基因紧密连锁的分子标记，然后用遗传作图将目的基因定位在染色体的特定位置，找到与目的 基因紧密连锁的分子标记。构建含有插人大片段DNA的基因组文库(BAC或YAC)，以与目的基因连锁的 分子标记为探针筛选基因组文库，鉴定出分子标记所在的大片段克隆，再以该克隆为染色体步移的起点， 用外侧克隆末端作为探针筛选基因组文库，分离新的重叠克隆用获得的阳性克隆，多次重复上述步骤，逐 渐逼近目的基因，构建目的基因区域的重叠群。随后通过亚克隆文库获得含有目的基因的小片段克隆，最 后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。 目前构建亚克隆文库比较常用的DNA片段化方法主要有两种：物理剪切法和限制性内切酶法。
分子生物学考试大题
1、Each allele has a different phenotype ,why(illustrate by example). 位于染色体同一位置的分别控制两种不同性状的基因是等位基因，等位基因之间具有多种关系。比如，果蝇中white位点的存在对红眼的形成是必要的。这个位点是根据无义突变命名的，该突变使果蝇在突变杂合子中具有白色的眼睛。表述野生型和突变型基因时，通常在野生型基因后面加上＋。 当等位基因存在时，一个动物可能是携带两种突变基因的杂合子。这种杂合子的表型依赖于每一个突变所遗留下的活性。从本质上讲，两个突变基因间的关系与野生型和突变型间没有区别，一个突变可能都是显性的，也可能部分是显性的。在任何一个遗传位点上并非一定要有一个野生型基因。人类学行系统的比较就提供了一个例子：缺失功能有空白型表示，即O型；但是功能性的A型和B 型是共显性的，并且对O型表现出显性。 2、Conservation of exons and its application. 外显子的保守性可以做为鉴定编码区的基础，即通过确认那些在许多生物体中都存在的序列片段。对于含有这样基因的区域，即在许多生物中这些基因的功能长期被保留下来，这个序列所代表的蛋白质应当有两个特性：它必须有一个开放的阅读框（ORF）；在其它生物中很可能存在与它相关的序列。 物种杂交可作为鉴定基因的第一条标准，将来自一定区域的短片段作为探针，通过Southern杂交检测来自不同物种的相关DNA，如果我们发现几个物种中的杂交片段与某一探针相关（探针通常来源于人的DNA），则这个探针就可成为一条基因外显子的候补片段。将这些候补片段进行测序，如果它们有阅读框，则它们就可被用来分离周围的基因组区域；如果它们是一个外显子的一部分，则可以用它来鉴定整条基因，分离相应的cDNA和mRNA,从而最终分离出蛋白质。3、Chromosome walking and its application. 从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠的顺序和染色体的其它顺序。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻片段，等于在染色体上移了一步，称为染色体步移。 染色体步移技术是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效
反向PCR技术原理和应用
反向PCR技术原理和应用 摘要：PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。随着现代医学和分子生物学的飞速发展，该技术在各个领域都发挥着重要的作用。 关键词：反向PCR;原理;不足之处;应用 反向PCR是一种多聚合酶链式反应（PCR）应用的方法，可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于P CR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。 用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4 kb。在许多情况下，首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板（依赖于引物）的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类型决定的接点（例如，互补突头连接与钝头连接）。对于扩增左翼或右翼序列，初试时最好靠近识别多个碱基位点的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入合适的酶切位点。 用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反向PC R大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环化前需用Klenow或噬菌体T4 DNA聚合酶修理（钝化）。连接前，需用酚或热变性使内切酶失活。 聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火，T aq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向P CR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。 1 反向PCR技术原理 反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。 2 反向PCR技术不足之处 该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶
基因组步移技术概述
基因组步移技术概述 高俊平(山东省潍坊科技学院贾思勰农学院潍坊262700) 摘要基因组步移技术是一种常用的克隆已知片段旁侧序列的技术。本文介绍了近年来出现的几种主流基因组步移技术，以期为相关研究提供方法借鉴。 关键词基因组步移基因组酶切连接PCＲ 基因组步移(genomic walking)是指从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针，从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆含有与探针相重叠的序列。从第二个重组克隆再分离出末端小片段作为探针筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段。它是一种重要的分子生物学研究技术，可以有效克隆已知片段侧翼的未知序列。 迄今为止，基因组步移主要有两种方法:一是结合基因组文库的基因组步移技术，此方法适于长距离步移，可以获得某一特定染色体较长连续区段的重叠基因组克隆群;另一个是以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCＲ)扩增为主要手段的基因组步移技术，该方法产生的步移距离相对较短，但是操作简单，尤其适合于寻求已知片段旁侧的未知序列。1基于基因组文库的基因组步移技术 基因组文库是指生物体的全部DNA经过合适的核酸内切酶消化或机械切割以后，克隆到合适的载体分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，就包含了这个生物体的整个基因组信息，也就成为了此生物体的基因组文库。它是基因组学研究的重要技术平台，目前构建基因组文库的方法主要有两种:物理剪切法和限制性内切酶法［1］。 以基因组文库为基础进行基因组步移的步骤大体如下:①用与目的基因连锁的分子标记为探针筛选整个基因组文库，鉴定出分子标记所在的大片段克隆; ②再以该克隆为基因组步移的起点，用外侧克隆末端作为探针筛选基因组文库，分离新的重叠克隆(阳性克隆);③多次重复上述步骤，逐渐逼近目的基因，构建目的基因区域的重叠群;④通过亚克隆文库获得含有目的基因的小片段克隆，并对其进行遗传转化和功能互补验证，从而最终确定目的基因的核酸序列。 2基于PCＲ技术的基因组步移技术 随着PCＲ技术的发明，以该技术为基础发展了多种基因组步移方法，这些方法按原理可分为两类:一是依赖酶切连接介导的PCＲ法;二是不需要酶切连接的PCＲ法。 2．1依赖酶切连接的PCＲ此类方法首先对基因组DNA进行酶切，然后把酶切产物连接成环或在酶切产物末端加上相应的接头。根据已知序列设计的特异引物和接头上的锚定引物分别作为PCＲ反应的正反向引物，以此来扩增已知序列的上下游侧翼序列。2．1．1反向PCＲ反向PCＲ(inverse PCＲ，IPCＲ)的原理是对已知序列进行限制性内切酶位点分析，然后选取已知序列中没有位点的限制性内切酶，对基因组DNA进行酶切并将酶切片段环化自连，然后根据已知序列设计反向引物，扩增已知序列两侧的未知序列。IPCＲ的优点是操作简单;缺点是环化过程难以控制，这是因为酶切位点随机分布，有可能产生较长的片段，从而导致PCＲ扩增效率下降。鉴于此，科研人员在此基础上发展了桥连IPCＲ:环化的过程中，在酶切位点之间特意加上一段桥连片段，从而能更有效地扩增侧翼片段。Chen等［2］通过IPCＲ技术克隆了小麦花粉特异性基因TaPSG719的启动子序列。尽管IPCＲ应用不多，但它开创了利用PCＲ技术进行基因组步移的先河。以此为基础，大量应用PCＲ技术进行基因组步移的方法相继涌现。 2．1．2载体PCＲ载体PCＲ(single specific primer PCＲ，SSP-PCＲ)是指把基因组DNA酶切片段连接到质粒载体上，并用已知序列设计的特异引物和载体上的通用引物特异扩增目标片段的一种PCＲ技术。SSP-PCＲ实验设计简单，尤其适合于保存有cDNA或基因组文库的实验室，但是其操作较繁琐，特异性较低，产物仍需做进一步的鉴定。Gowik等［3］运用SSP-PCＲ技术成功克隆出了一种黄顶菊基因(ppcA1)的启动子序列。2．1．3连接单链接头的PCＲ单链接头PCＲ(panhandle PCＲ，P-PCＲ)是连接单链接头PCＲ的典型代表，因其关键环节形成一个锅柄状结构，故也称锅柄PCＲ。其原理为:基因组DNA先用限制性内切酶酶切，然后在酶切片段末端连接上含有自由端的单链寡核苷酸链(3'端与已知序列中部分片段完全反向互补)，这样含有连接片段的单链DNA在合适的温度下会自身退火形成一个类似锅柄结构的环，接下来用在已知序列内呈线性排列的3个单引物进行3次PCＲ扩增，即得到目的片段。P-PCＲ的优点是特异性较高，但由于单接头连接效率低，会限制锅柄结构的形成。在此基础上，科研人员对其进行了改进，即在形成锅柄之前在3'末 · 77 · 生物学教学2019年(第44卷)第3期
基因组学-名词解释
Chromosome walking，染色体步移，通过鉴定克隆DNA的重叠部分来构建克隆重叠群的一种方法 Contig，（重叠群）一组连续的重叠DNA序列 C-value paradox，（C值悖论）在每一种生物中其单倍体基因组的DNA总量是特异的，被称为C值 (C Value)。C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象称为C值悖论 CpG island，（CPG岛）人类基因组中大约56%的基因上游富含GC的DNA区域Physical gap，（物理间隙）指构建基因组文库时被丢失的DNA序列，它们从已有的克隆群体中永久性地消失 Restriction mapping，限制性酶切图谱，通过分析限制性酶切片段的大小确定DNA分子中限制性酶切位点 Scaffold,骨架序列，序列间隙分开的一系列序列重叠群 Genomics, 基因组学，研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。用于概括涉及基因作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学分支。 Proteomics, 蛋白质组学，用来研究蛋白质组的各种技术 Histone code，组蛋白密码，组蛋白化学修饰的模式影响各种细胞活性的假说Map-based cloning，又称定位克隆(positional cloning),用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA 顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息 Restriction fragment length polymorphism (RFLP)，限制性片段长度多态性，因为在其一端或两端存在多态性限制位点而产生的长度各异的限制性片段Epigenetics，表观遗传学，是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科 pseudogene, （假基因）一个失活，即无功能性的基因拷贝 nucleoid,（拟核）原核生物中的含DNA区域 fluorescent in situ hybriduzation, 荧光原位杂交，一种通过观察荧光标记在染色体的位置而确定标记物的技术 sequence tagged site mapping,序列标签位点，基因组中唯一的一段DNA序列mapping reagent,作图试剂，在STS作图中使用的一种分布于单个染色体或整个基因组的DNA片段集合 SSLP, 简单序列长度多态图，一系列表现长度多态性的重复序列 variable number of tandem repeat, 可变数串联重复，由十几个核苷酸的重复序列拷贝组成的简单序列长度多态图，也叫小卫星 short tandem repea t,短序列重复，由二，三或四核甘酸重复单位顺序排列组成的一种简单序列多态性，也叫微卫星 l ong(or short) interspersed nuclear element,长散布重复片段，一种基因组范围的重复序列，常常具有转座活性 RNA world, 进化早期所有生化反应以RNA为中心的时期 genetic mapping, 遗传作图，采用遗传学技术构建基因组图谱 physical mapping（物理图）采用分子生物学技术构建基因组图谱的方法