转基因小鼠制备
1. 基因准备
2. 实验用鼠的饲养
小鼠品系的选择需结合实验要求，如果必须使用规定的品系，则可按规定或特定要求进行。用于转基因实验的小鼠根据其作用可分为供体鼠、受体鼠、结扎公鼠、种质公鼠。供体鼠是提供受精卵的母鼠，为了得到更多的受精卵，通常要对其进行激素注射；受体鼠是用于胚胎移植的假孕母鼠，以后生育转基因小鼠；结扎公鼠是有交配能力，但没有繁殖生育能力的公鼠；种质公鼠用于与供体母鼠配种。本项试验将全部应用C57/BL6 ×DBA杂交的F1代小鼠。
转基因实验需要定期提供相当数量的母鼠作为受精卵供体和假孕母鼠，以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎输精管的公鼠（简称结扎公鼠）。这些鼠可由实验动物中心提供，在实验前做好这些鼠与转基因相关的管理与饲养。
2.1 供体鼠
一般说来，杂交子一代鼠较纯系鼠产卵多，受精卵显微注射后两细胞分裂率较高，产仔较好。作为供体母鼠的种系，自然产卵数与超排卵数均应较高。一般用4～6周产仔更多但卵细胞膜脆性较大，在操作过程中易破裂；而6周以后母鼠产卵逐渐减少。
2.2 受体鼠（即假孕母鼠）
母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生假孕母鼠，假孕母鼠作为显微注射后受精卵的受体及其后代的养母。这种母鼠以6周龄至5个月龄较适宜，体重最好大于20克。母鼠一般4～5天为一个发情周期，因此在1个较大的母鼠群中约有20～25％进入发情期，如进入发情母鼠数与结扎公鼠数相近，可将每个公鼠笼内放1只母鼠；如母鼠数显著多于公鼠，可于每个公鼠笼内放2～3只母鼠。也可不考虑发情期，随机将每个公鼠笼内放2～4只母鼠。一般准备较多的假孕母鼠以防移卵失败。未使用的假孕母鼠可在阴栓产生两周后重复使用。
2.3 结扎公鼠
结扎公鼠与母鼠交配以后产生假孕母鼠和供体母鼠。用作母鼠假孕的结扎公
鼠需8周龄以上，对种系无特殊要求。在作正式实验以前，每只结扎公鼠至少需要和3只母鼠交配，使母鼠只产生阴栓而均不怀孕，方可投入正式实验。结扎公鼠可每晚与母鼠交配，但最好是隔日一次。结扎公鼠使母鼠产生阴栓的能力可维持两年。每只结扎公鼠最好有使母鼠产生阴栓的记录，如经4～6次都不能使母鼠产生阴栓，则所用结扎公鼠必须更换。如每月作9次显微注射，每次需4～8只假孕母鼠，则需结扎公鼠20只。
2.5 超数排卵
3～8周龄供体母鼠在12～14小时光照周期(上午6:00至下午6:00或上午7:00至下午7:00)的动物房内饲养3～5天，即可超数排卵。一般都采用PMSG 和HCG联合使用进行超排。用量每只母鼠都为5至7.5国际单位。一般为冰冻干燥的粉剂，均用生理盐水或PBSG溶解500国际单位／ml，分装于1.5ml离心管中，每管0.1ml，贮存于-20℃，有效期至少一个月。使用前加0.9ml生理盐水稀释至50IU/ml，每只供体母鼠腹腔注射0.1～0.2ml(即5～10个国际单位)。
PMSG与HCG注射的间隔时间，二者与动物房光照周期关系均影响超排卵效。一般PMSG与HCG注射间隔46～48小时，排卵发生于注射HCG后10～13小时。为精确地控制排卵时间，HCG的注射必须在内源LH释放之前。PMSG 刺激内源LH的释放受动物房光照周期的调节。内源LH的释放随种系而异，对大多数种系其释放在PMSG注射笫2个暗周期的中点之后16～20小时。如暗周期是晚6点至早6点，PMSG在下午1～2点注射，46～48小时后注射HCG，这一注射时间约在内源LH释放之前2～3小时。
腹腔注射PMSG后，供体母鼠仍置原笼内，待两日后注射HCG，注射HCG 后每只母鼠置于1个单笼饲养的结扎公鼠笼内，次晨检查阴栓。
3. 小鼠胎儿成纤维细胞培养体系的建立
3.1 材料
DBA公鼠与C57母鼠配种怀孕13.5d的小鼠胎儿。
细胞培养板(六孔)、低速台式离心机、CO2培养箱、净化工作台、冷冻管、10mL玻璃离心管。
DMEM/F12、胎牛血清。
0.05%胰酶+0.04%EDTA消化液：称取0.04gEDTA完全溶解于100mL D-Hank`s液，用1mol/L的NaOH调PH至7.2-7.4，然后称取0.05g胰酶溶解其中，过滤除菌后分装，-20℃保存。
细胞培养液：DMEM/F12+FBS(终浓度为10%)+PS。
D-Hank`s液：NaCl8g+KCl 0.4g+Na2HPO4 0.05325g+KH2PO4 0.06g+NaHCO3 0.35g，加水至1000mL，调PH=7.2，高压灭菌，4℃保存。
3.2 方法
3.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞的原代培养(消化法)
(1)手术取13.5日龄胎儿置于盛有D-Hank`s液的广口瓶中。
(2)用加PS的D-Hank`s液冲洗2~3遍，移入另一个平皿。
(3)去除胚胎的头、四肢、内脏，将剩余部分转移至另一平皿。
(4)将眼科剪将其尽量减碎，加入D-Hank`s液吹打散开，吸去漂浮的脂肪组织等，并吸尽液体。再吸入适量D-Hank`s液冲洗1遍，再剪，再用D-Hank`s液冲洗，直至冲洗液清亮。
(5)将剪碎的组织放入一10mL玻璃离心管中，再加入约组织量5倍的消化液进行消化，反复吹打。
(6)当溶液出现明显浑浊后，静置一段时间后将上层浑浊液吸入到新的10mL 玻璃离心管中，1500rpm，5min。
(7)去上清，用D-Hank`s液重悬离心2次，1500rpm，5min。
(8)去上清，加成纤维细胞培养液重悬，进行细胞计数，铺六孔细胞培养板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
(9)步骤(6)中微小化沉淀物加消化液进行第2次消化，重复步骤(6)- (9)，至步骤不再消化(吹打液不再浑浊)。
3.2.2 小鼠胎儿成纤维细胞的继代培养
(1)待培养皿中90%铺满单层细胞时，吸去原有培养液，用D-Hank`s冲洗细胞2次。
(2)加入0.05%胰酶+0.04%EDTA消化处理并置于37℃培养箱直到贴壁的胎
儿成纤维细胞基本变圆。
(3)加入成纤维细胞培养液终止消化。收集细胞混悬液，1500rpm离心5min，除去上清。
(4)用培养液重悬细胞，吸取悬液铺入六孔板中，置37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。细胞反复消化培养3代至培养孔中杂细胞基本消失。
3.2.3 细胞的冻存与复苏
冻存：弃去旧培养液，用D-Hank’s清洗两遍。加消化液约2min，吹打悬浮细胞，移入离心管，1500rmp，离心3min。D-Hank’s液洗一遍，弃废液，再用配好的冻存液（含20%FBS，含10%DMSO的DMEM/F12）细胞，加入冻存管中。-4℃15min，-20℃2h，然后放入-75℃冰箱过夜，最后放入液氮中保存。
复苏：从液氮瓶中取出快速放入37℃中水浴。融化后加入10倍左右的DMEM/F12培养液，离心（1000rpm/min）10min，去上清，加入培养液，最后稀释使细胞浓度为1×106个/ml。放置在37℃，饱和湿度，5%CO2的培养箱中，细胞贴壁后更换培养液。
5. 基因转染胎儿成纤维细胞及细胞株的建立
5.1 材料
Multiporator（effendorf，德国）、低速台式离心机、CO2培养箱、倒置显微镜、细胞培养六孔板、单人双面净化工作台、自动双重纯水蒸馏器、数码凝胶图像处理系统、DNA扩增仪。
DMEM/F12、G418、LUTEOTROPICHormone、Hypoosmolar buffer。其它试剂为国产分析纯级，分别购自南京科威公司、上海华美公司、上海生工公司、上海药剂等。
0.05%胰酶+0.04%EDTA消化液：称取0.04gEDTA完全溶解于100mL D-Hank`s液，用1mol/L的NaOH调PH至7.2-7.4，然后称取0.05g胰酶溶解其中，过滤除菌后分装，-20℃保存。
G418筛选培养液：DMEM/F12 100ml+G418 10.000g，过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。
D-Hank`s液：NaCl8g+KCl 0.4g+Na2HPO40.05325g+KH2PO40.06g+NaHCO3
0.35g，加水至1000mL，调PH=7.2，高压灭菌，4℃保存。
5.2 方法
5.2.1 细胞对G418的耐受性实验
(1)选择生长均匀、形态正常的细胞消化后，计数。取两块6孔细胞培养板，
的加湿培养箱中向每孔中接种 1ml含2～5×105个细胞的培养液，37℃、5%CO
2
培养至 50%～70%汇合。
(2)分别向1至8孔中加入 G418。每孔浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml。第9、10、11、12孔作为空白对照。
(3)每两天换培养液一次，每天观察细胞的生长情况并记录。
5.2.2 电转染用电压、脉冲时间的优化
电转染时电压和脉冲时间是影响细胞存活率和转染率的最主要因素，许多研究表明，电转染后细胞存活率在50%左右的电学参数就是较为理想的转染参数。
本实验以电压100V、150V、200V、250V和脉冲时间60μs、80μs、100μs、120μs分别电击P3代小鼠胎儿成纤维细胞，电穿孔结束后将电转染液转移至六孔细胞培养板中并补加正常的乳腺上皮细胞培养液后置培养箱中培养24小时，然后消化贴壁细胞计数细胞数，计算出细胞存活率。
5.2.3 基因电转染小鼠胎儿成纤维细胞
(1)弃去原培养液，用D-Hank`s液冲洗2遍。加入0.05%胰酶+0.04%EDTA消化液消化，2min左右后弃去大部分消化液。
(2)待大量细胞变圆时，用含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化。轻轻吹打分散细胞，并加入1mL左右D-Hank`s液一起移入离心管中。同时，吸取少量悬液进行细胞计数。其余的细胞悬液在室温条件下，1500rpm离心5min。
(3)将细胞计数板平放于显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴加细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片之间的空隙。在镜下观察细胞，根据细胞数量调整细胞密度，使细胞密度达到200个~500个/10mm2。
(4)在显微镜下对细胞进行计数，活细胞胞体完整，透明不着色，凡着色者均为死细胞。计算四角大方格内的细胞数，压线者只计算左线和上线者，右线和
下线不计算在内。然后按下列公式计算：
细胞数/毫升原悬液=（4大格细胞总数/4）×10000×稀释倍数
(5)离心后，弃去上清。加入1mLHypoosmolar Electroporation Buffer悬浮细胞，1500rpm离心5min，弃上液。
(6)将细胞重悬于Hypoosmolar Electroporation Buffer，使细胞达到1~3×106cells/mL。
(7)吸取400μL细胞悬液加入基因片段并混合，DNA的终浓度应为5~20μg/mL。
(8)将400μL的细胞悬浮液转移进electroporation cuvettes（径宽2mm），细胞悬浮液中应没有气泡。
(9)Multiporator中电穿孔：
Mode Eukaryotes“⊙”
V oltage（V）200V
Time constant（τ）100μs
No. of pulsees（n）1次
(10)电脉冲后，使细胞悬浮液在cuvette中室温条件下静置7min。
(11)将细胞悬浮液分别加入六孔含正常胎儿成纤维细胞培养液的六孔板中，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下静置培养。
5.4 药物筛选
细胞电转染48h后进行药物筛选，并准备没有转染外源基因的胎儿成纤维细胞作为阴性对照；在转染的细胞和阴性对照的细胞中同时加入含G418 700μg/mL 的DMEM/F12培养液进行筛选，以后每两天换一次液，并在倒置显微镜下进行观察；筛选三周左右，在显微镜下可以观察到有明显抗性的克隆细胞株产生，此时将细胞G418的筛选浓度降低至400μg/mL继续培养。
5.5 细胞株的扩大培养
在G418筛选2~3周后，可见明显的细胞克隆团。挑选生长旺盛、细胞形态好的细胞株，在六孔板底部做上标记。吸去旧培养液，用D-Hank`s清洗2遍，
然后将克隆环(自制)的底部一圈涂上灭菌凡士林，轻轻放在底部做有标记的地方并稍压紧。接着往环内加入50μL的胰酶消化液消化细胞，在显微镜下观察到细胞开始变圆时，加入DMEM/F12终止消化并用枪头轻轻吹打以悬浮细胞，然后将细胞悬液转移到24孔细胞培养板中，同时补加500μL新鲜的含200μg/mLG418的胎儿成纤维细胞培养液。待细胞长满24孔板后将其转入六孔细胞培养板中扩大培养。
5.6 细胞株的PCR检测
5.6.1 细胞染色体DNA的提取(考虑单细胞检测)
(1)待细胞基本长满6孔板底壁时，用D-Hank`s冲洗细胞2~3次，加入消化液消化细胞，待大部分细胞变圆时加入适量培养液以终止消化。
(2)取细胞消化液加入离心管，1500rpm离心5min。
(3)弃上清，加入500μL的灭菌三蒸水悬浮细胞，轻弹管壁，使之充分混合，12000rpm 离心5min。
(4)重复步骤(2)1次。
(5)加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
(6)加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。
(7)加200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。
(8)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(9)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(10)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(11)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(12)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液。
(13)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
(14)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2~5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的获得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rpm离心2min。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0~8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率，且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
(15)用0.75%的琼脂糖电泳检测定量。
5.6.2 PCR检测
引物序列：
目标产物长度：
PCR反应体系：
组成成份体积终浓度10×PCR bufferμL
dNTP(10mM)μLμM
引物Ⅰ（CMV+LYZ1，10μM）μLμM
引物Ⅱ（CMV+LYZ2，10μM）μLμM
模板DNAμL
Taq(5U/μL)μL
灭菌双蒸水μL
反应总体积为μL。
PCR循环参数为：
6. 重组胚胎的制备和培养
从单细胞到囊胚的植入前的胚胎(受精后0.5到3.5天)，可转移至假孕母鼠的生殖道以完成发育。单细胞至桑椹胚的胚胎转移至同步发情或略早的假孕母鼠的输卵管，这种输卵管胚胎移植仅适用于被透明带包裹的卵；3.5天的囊胚转移
至2.5天假孕的母鼠子宫，用于子宫胚胎移植胚胎不需有透明带。将胚胎转移至假孕母鼠的较早阶段是为了给胚胎以充足的时间使其赶上发育阶段。
6.1 材料
6.1.1 试剂及配方
M2；M16；透明质酸酶；75%酒精；0.75%戊巴比妥钠；细胞松弛素B；氯化锶。
6.1.2 仪器设备
毛细玻璃管、拉针仪。
CO2培养箱、体视显微镜、小鼠用手术器械、显微操作系统、piezo系统；培养皿、酒精灯、胚胎培养杯、玻片等。
PVP、PV A
6.2 方法
6.2.1 显微注射针的准备
用断针仪垂直断开吸管末端，形成一个平的端口。平口吸管可以穿过透明带和卵质膜，而对卵的损伤降低到最小程度。去核针的内径约为7～8μm。
注射针的内径应根据供体细胞的大小和硬度进行调整。对于卵丘细胞核原生殖细胞，内径大小为4～5μm；对于成纤维细胞为7～9μm。
6.2.2 卵母细胞的收集
(1)制备移卵管。
(2)制作液滴。
(3)快速颈椎脱臼法处死雌性供体小鼠。
(4)将小鼠放在吸水纸上，用75%的酒精消毒腹部。
(5)用手指捏住皮肤并用眼科弯剪在皮肤上做一小切口（具体的位置不一定很严格）。然后用力将皮肤拉到头部，完全暴露腹部。然后剪开腹膜，完全暴露内脏器官。将肠管拉向一侧后即可在腹腔中见到两侧的子宫和相连的卵巢。卷曲的输卵管在卵巢和子宫之间。
(6)用眼科镊夹住子宫将其提起，这有利于将子宫和腹膜分离开。用显微剪
在膜上刺破一小口，然后将子宫分离下来。
(7)仍用镊子夹住子宫，用显微剪在卵巢和输卵管之间剪开。切口必须尽可能的接近输卵管。
(8)将镊子移到输卵管处夹住输卵管（小心的夹紧），在输卵管和子宫之间在剪一刀。
(9)将输卵管放入含有M2液滴的平皿中。
(10)将另一侧的输卵管按同样的方法取下来，接下来将其余所有供体的输卵管都取下来。所有的输卵管都要收集在同一个M2平皿中。
(11)在显微镜下观察输卵管（10～20倍放大），可见其为具有一透明的膨大部的不透明的一团。膨大部形成的原因是因为卵子团集在这里（许多受精卵外都包围着颗粒细胞）。可以透过膨大部见到受精卵。
(12)用一个镊子夹住输卵管，另一个镊子将膨大部撕开。小心控制输卵管的方向以便可见到卵团溢出输卵管。如果卵团没有立刻溢出输卵管，要用镊子将其轻轻地拉出。将空的输卵管丢弃，接下来重复以上的程序将剩余输卵管内的卵团取出。偶尔，个别输卵管的膨大部会不明显。在这种情况下就必须将输卵管完全撕开来收集卵子。
(13)用移卵管将收集所有的卵子并将其转移到另一个含有M2液滴中。
(14)用移液管吸取适量解冻的透明质酸酶存贮液于卵团混匀。反复吹吸卵子将加快分离。
(15)用吸管将受精卵移入第三个M2液滴。不断的将受精卵收集起来移到该平皿的另一液滴。在每一次的受精卵转移过程中都有一小部分颗粒细胞被洗掉，以至于在最后一次转移时颗粒细胞以被完全除去。然后将受精卵转移到新的M2液滴中。
(16)在其中一个平衡了的M16中将受精卵清洗两次。
(17)将受精卵转移到含M16的方杯培养并放在37℃、5%CO2的培养箱中培养。
6.2.3 卵母细胞的去核
10～20个卵母细胞为一组，放于玻片上含细胞松弛素B的培养液滴内，并
将玻片置于显微操作仪的操作面。
固定卵母细胞，并使其中期位于2点至4点之间的位置。
将去核针的顶端置于透明带的表面。
将染色体随少量的胞质一同吸去。
将一组卵母细胞完成去核后，在新鲜培养液滴中洗涤数次。将卵母细胞置于培养箱中30min～2h，再进行供体注射（或电融合）。
6.2.4 核供体细胞的准备
取出饥饿48h后的核供体细胞，用D-Hank`s液吹洗2遍。加入适量的消化液，3～5min后加入正常培养液终止消化，吹打后移入离心管，1500rpm离心5min。去上清，用适量M2重悬离心，1500rpm，5min。最后再用M2重悬移入指形管中以备核移植。
6.2.4 供体核的注射
在显微操作平面上轻轻将乱切细胞混合到PVP滴中。
在显微操作平面的一个CZB-HEPES小滴中放置10-20个去核卵为一组。
用注射针轻柔地吹打供体细胞从而获得细胞核，然后将工体和在注射针内排成一线。
在施加数个piezo脉冲的同时，将注射针向前推进并穿过透明带，将注射针深深插入到卵质中，同时将供体核推到吸管的顶端。
将注射针置于卵内数秒，施加一个凭经验决定的最小强度piezo单一脉冲。质膜将会在吸管顶端的位置被穿破，质膜被穿破的标志是该处卵质膜迅速松弛。连同最小量的培养液将供体核排出到卵质膜内。
轻轻地撤回注射针（相对而言先快后慢）。
注射后的卵置于室温下5-10min，然后洗涤并在CZB培养液中继续培养，直到用锶活化。
6.2.5 胚胎活化和培养
核移植后约1h后，将卵置于无钙、含2.5～10mmol/L氯化锶及5μg/mL细胞
松弛素B的培养液中，37℃，5% CO2条件下活化。
1h后，将已活化的卵移入到含5μg/mL细胞松弛素B的培养液中，继续培养5h。
重构胚在新鲜的培养液重洗涤数次，继续培养直到进行胚胎移植。
7. 输卵管胚胎移植法
小鼠用手术器械用高压消毒。切口位于脊柱左侧lcm，约与最后1根肋骨平齐。小鼠用0.2ml 1％戊巴比妥钠麻醉后，剪去鼠后背部被毛，用70％酒精消毒。在鼠完全麻醉时，用手术剪在术部剪开一个长0.5cm的小口。
用镊子沿切口钝性分离皮肤肌肉，透过腹膜可见卵巢(桔黄色)和脂肪垫(白色)。然后用显微外科镊在相当于卵巢上部的腹膜开1个小口。这时应避开血管以防出血。用无齿镊夹住脂肪垫并带出左侧的卵巢、输卵管与子宫。用动脉夹夹住脂肪垫并将其放在鼠背后皮肤上，这样卵巢与输卵管保留在腹膜外。
鼠可于手术前即置于解剖镜下，如打开腹膜后再移动，事先最好将鼠放在一只塑料盘上，一般头在左侧，脂肪垫翻向后，输卵管在显微镜视野中心。
在解剖镜下可见位于卵巢囊里的输卵管和卵巢，用两只显微外科镊在相当于输卵管开口上部将透明的囊膜打开一小口，尽可能避开血管以防出血。
用显微外科镊轻轻拨动输卵管喇叭口使其呈水平状，将移卵管从开口部插入输卵管，吹移卵管直至第二、第三个气泡进入壶腹部。将移卵管略停一下再拔出，以防气泡和卵逸出，可按上述方法将胚胎转移至右侧输卵管。
去脂肪夹，用钝头镊子夹住脂肪垫，带动卵巢、输卵管子宫一并送回腹腔。，可将腹膜缝一、二针，再将皮肤切口缝合。
8. 整合检测
从G0代胎鼠组织或幼鼠尾巴提取的DNA，可用PCR(聚合酶链反应)、Dot blot(斑点杂交)、Southern blot(Southern杂交)等多种方法分析，以确定是否为转基因鼠。PCR与Dot blot可较快地提供信息，但PCR易有假阳性，Dot blot在基因拷贝数低或嵌合体时易有假阴性。Southern blot可给出一定长度的区带，不仅提供了外源DNA 结构与整合的信息，同时可克服上述方法所造成的假阳性或假
阴性。一般PCR后再Southern杂交可以既快又准确地获得结果。最终用Southern blot的结果作结论。所用探针需高度特异。
预实验一
G418筛选浓度的确定
(1)选择生长均匀、形态正常的细胞消化后，计数。取1块六孔细胞培养板，向每孔中接种1mL含2~5×105个细胞的培养液，37℃、5%CO2的加湿培养箱中培养至丰度为50%~70%。
(2)分别向1至5孔中每孔分别加入浓度为800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL的G418各1000μL。第6孔作为空白对照。
(3)每两天换培养液一次，每天观察细胞的生长情况并记录。
筛选结果：G418在培养液中的浓度因细胞类型和细胞周期的不同存在着很大差异。因此在正式实验之前进行细胞耐受性的预实验是必须的。本次实验的结果为：
根据这一结果，我们将初筛浓度定为100μg/ml，而将维持浓度定为50μg/ml。
预实验二
电脉冲条件的优化
电转染时电压和脉冲时间是影响细胞存活率和转染率的最主要因素，许多研究表明，电转染后细胞存活率在50%左右的电学参数就是较为理想的转染参数。
本实验以电压100V、150V、200V、250V和脉冲时间60μs、80μs、100μs、120μs分别电击P3代小鼠胎儿成纤维细胞，电穿孔结束后将电转染液转移至六
孔细胞培养板中并补加正常的乳腺上皮细胞培养液后置培养箱中培养24h，然后消化贴壁细胞计数细胞数，计算出细胞存活率。
下图是不同的电压和脉冲时间组合电击乳腺上皮细胞后细胞的存活率（%）
一般将电转染后细胞存活率在50%左右的电学参数定为转染参数，故本实验采用的一组参数是200V、100μs。
细胞生长曲线的绘制
取生长代数为4、10、20的细胞，按1～5×104cell/孔分别接种于24孔板中，每日取三孔进行细胞计数，按平均值绘制生长曲线。(标注：来自徐娟论文)
计数法（标注：来自文献）
1．取生长良好接近汇合的细胞，用胰蛋白酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数。
2．根据细胞计数结果按每块六孔板10000／mL作传代培养接种细胞，共接种21孔细胞。
3．24h后开始计数细胞，以后每隔24h计数一次，每次取3孔细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7d。
4．根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。
转基因小鼠的制备
转基因小鼠的制备 【实验目的】 1.了解转基因小鼠制备的原理和方法。 2.学习转基因小鼠制备的流程。 3.掌握对转基因小鼠进行筛选的方法。 【实验原理】 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体基因组的外源基因称为转基因。转基因技术则是指制备转基因动物所需的一套技术，它涉及外源基因的构建、载体和受体的筛选、基因导人技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面。 1974年，Rudolf Jaenisch通过将SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，创造了第一只携带外源基因的小鼠。后来又有研究人员把Murine leukemia病毒注射到小鼠胚胎得到了能通过生殖系统稳定遗传的小鼠，并且外源基因能在后代中稳定表达。这些能稳定遗传且表达外源基因的小鼠即我们现在一般意义上所说的转基因小鼠。 【实验步骤】 一、显微注射法 1.受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用。 2.目的基因的导入 用显微操作仪将目的基因溶液导入受精卵的细胞核内。 3.受体母鼠的准备 将雄鼠输精管结扎，然后与可育雌鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。 4.胚胎移植 将已转入目的基因的受精卵从背部植入假孕母鼠的输卵管或子宫内（视胚胎发育的状况而定），使胚胎在养母体内发育成熟。 5.对幼鼠的鉴定 幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交鉴定外源基因是否整合到幼鼠的染色体上。 二、胚胎干细胞囊胚显微注射法 1.囊胚期受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，交配后第四天上午从子宫中冲取受精卵备用。 2.目的基因的导入
Dicer1转基因小鼠模型的建立
2008年8月 第16卷 第4期中国实验动物学报ACT A LABORAT ORIUM ANI M A LIS SCIE NTIA SINICA August ,2008V ol.16 N o.4 研究报告 Dicer 1转基因小鼠模型的建立 郑志红1,高峰2,杨葳1,汪瑛1,于洋1,周生来1,李兆阳1 , 吕相川1,张梅英1,王禄增 1(1.中国医科大学实验动物部,沈阳 110001;2.中国医科大学附属第一医院,沈阳 110001) 【摘要】 目的 建立Dicer 1转基因小鼠模型。方法 构建pcDNA3112Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导入BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR 受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR 和S outhern 方法检测鼠尾DNA 鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer 1基因表达。结果 显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR 检测获得6只阳性鼠,S outhern 检测6只均为阳性。对S outhern 检测阳性转基因小鼠子代进行RT 2PCR 检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达。对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常。结论 成功建立Dicer 1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER 1基因功能及miRNA 的表达及功能等奠定基础。 【关键词】 Dicer 1;显微注射法;转基因小鼠 【中图分类号】R -33 【文献标识码】A 【文章编号】100524847(2008)0420258203 Establishment of a Dicer 1Transgenic Mouse Model ZHE NG Zhi 2hong 1,G AO Feng 2,Y ANG Wei 1,W ANG Y ing 1,Y U Y ang 1,ZH OU Sheng 2lai 1,LI Zhao 2yang 1 , LU X iang 2chuan 1,ZH ANG Mei 2ying 1,W ANGLu 2zeng 1(https://www.360docs.net/doc/7315606790.html,boratory Animal Center ,China Medical University ,Shenyang 110001,China ; 21The First A ffiliated H ospital of China Medical University ,Shenyang 110001,China ) 【Abstract 】 Objective T o establish a Dicer 1transgenic m ouse m odel.Methods pcDNA3112Dicer1construct was constructed ,linearized ,purified and then injected into superovulated pronuclear zyg otes to produce transgenic mice.The injected zyg otes were transplanted into the oviduct of pseudopregnant mice.The genotype of transgenic founders were identified by PCR and S outhern blot.The expressions of human Dicer 1protein in the tissues of the transgenic mice were detected by immunohistochemistry.R esults 172zyg otes were injected and 119zyg ote cells were transplanted into oviducts of 3recipients.15viable offsprings were born from 2of the 3recipients.G enomic DNA from baby tails was extracted.PCR and S outhern blot were used to identify transgenic founders of Dicer 1,and showed 6of the 15offsprings were positive transgenic mice of Dicer 11Dicer 1was expressed in the liver ,kidney and lung.Conclusion Dicer 1transgenic mice have been established success fully.The m odels will contribute to the research of Dicer gene function and the expression of miRNA. 【K ey w ords 】 Dicer1;M icroinjection ;T ransgenic mice [基金项目]国家自然科学基金:30571836;辽宁省重点实验室专项资金:辽科发[2005]36号。 [作者简介]郑志红(1969-),女,研究方向:实验动物转基因与 基因敲除。E -mail :zhihongzheng @1631com [通讯作者]王禄增。E 2mail :wanglz @1631com DICER 1基因与表观遗传调控密切相关,是 2000年被克隆的,定位于人染色体14q32113,编码 蛋白属于RNA 酶Ⅲ家族[1],在许多组织中广泛表 达。其功能是将具有颈环结构的RNA 或双链RNA 剪切成长约21个碱基的成熟miRNA (或siRNA )[1]。 DICER 1蛋白是成熟miRNA 产生所必需的酶, DICER 1基因异常可导致不同组织、不同发育阶段miRNA 表达异常,DICER 1基因敲除的小鼠在胚胎发育过程中就发生死亡[2],无法通过敲除来详细研究该基因的功能。由于DICER 1基因是发育过程中重要的调控基因,建立DICER 1转基因小鼠模型对研究该基因的功能具有重要的意义。1 材料方法 111 Dicer 1基因克隆及转基因构件制备按Dicer 1mRNA 序列设计正、反向引物,以
基因敲除小鼠的制作方法
.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.
转基因动物及其产品的主要管理制度【最新版】
转基因动物及其产品的主要管理制度 摘要:转基因三文鱼被美国FDA 批准上市，成为世界上首个获批可直接食用的转基因动物食品，开启了转基因动物商品化的大门。为对转基因动物及其产品进行有效的监管，世界各国均在不同程度上制订了管理制度，其中主要包括安全性评价制度和转基因成分标识管理制度。文中对猪、牛、羊等转基因动物的研发现状和转基因动物的检测技术进行了阐述，对世界主要国家/地区的转基因动物及其食品安全性评价制度和转基因成分标识制度的发展现状进行了综述，最后对转基因动物及其产品的发展做出了展望。 转基因动物是指通过基因工程等技术对基因组进行修饰，使其出现与原品种不同的性状或产物。自1982 年美国科学家将生长激素基因导入小鼠受精卵中获得转基因“超级鼠”，开启转基因动物研发的大门后，转基因鱼、兔子、猪、牛、羊等20 多种转基因动物相继被培育出来。转基因动物在提高生产性能、增强抗病能力、培育新品种、建立疾病模型、器官移植等方面有着广泛的应用。以转基因动物为原料加工生产的产品称为转基因动物产品。目前，世界上针对转基因动物及其产品的主要管理制度为安全性评价和标识管理制度。转基因动物及其产品的生物安全性受到了各国研究机构和组织的关注，在其进入人们生活之前，均经过严格的安全性评价。同时，针对批准上市的转基因产品，为了保障消费者的知情权和选择权，各国根据自己的国
情制定了转基因生物的标识管理制度。同时转基因动物及其产品的检测技术是保障安全性评价和标识管理制度顺利实施的重要手段。 一、转基因动物及其产品概述 1、转基因动物及其产品的研究概况 转基因动物的研究主要集中在提高生长速率、疾病模拟的建立、增强抗性和表型改变等方面。近年来，学者通过研发显性致癌基因的转基因小鼠，酪氨酸酶基因双等位猪和PARK2、PINK1 双基因敲除猪等，为肿瘤、动脉粥样硬化、白化病、帕金森综合征和乙型肝炎等疾病建立了模型，同时也为一氧化氮合酶及eGFP 相关染色质的功能研究提供新思路。肌肉生成抑制素基因(MSTN) 敲除的猪和表达外源纤维素酶和木质素酶的转基因小鼠的成功研制，为提高动物的瘦肉率和饲料转化率打下了基础。通过构建双重shRNA 表达系统的转基因牛和短发卡RNA 结构转基因鸡等转基因动物，有效防范了疾病的传播。为了增加动物的观赏性，相继出现了转绿色荧光蛋白基因猪，转黄色荧光蛋白斑马和转红色荧光蛋白基因唐鱼等。转基因牛的研制主要集中在乳腺生物反应器，如转人乳铁蛋白基因牛，转人血清白蛋白基因牛等。中国农业大学的学者相继研发出转人乳铁蛋白、人溶菌酶、人α -乳清白蛋白基因奶牛。最近，华南农业大学的学者报道了用转基因小鼠中的唾液腺作为生物反应器，成功生产出人神经生长因子蛋
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展_百替生物
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展 沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏 [摘要]动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。 [关键词]肿瘤，小鼠模型，转基因 肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。 1.常规转基因（transgenic） 上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。Li等5构建了乳腺癌WAP-Tag转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP启动子和SV40大T抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA突变及修复机制等方面的研究。在慢性粒细胞性白血病(CML)的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl和crkl双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl参与
转基因小鼠的方法概述
转基因小鼠的应用及其制 备法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。 转基因小鼠的应用及其制备法
（西北农林科技大学动物科技学院，凌712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验法；应用前景 Methods and Applications of Transgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@126.；Tel： *通讯作者：E-mail：mailto:zhangjianqin1356@126.
动物转基因技术及其应用
动物转基因技术及其应用 摘自（作者：幸宇云任军江西农业大学来源：《百名专家谈转基因》） 转基因是指利用现代分子生物学技术，将某些生物的基因导入到其他物种中，由于导入基 因的表达，引起这些物种性状发生可遗传的变化。转基因动物就是利用转基因技术获得的、具 有正常表达和可稳定遗传外源基因的动物。自1982年第一只转基因动物——一只因导入大鼠 生长激素基因而使生长速度倍增的转基因鼠诞生以来，各种转基因动物，如鱼、兔、猪、牛、 羊等先后问世，1997年，举世轰动的“多莉”克隆羊的诞生使转基因克隆动物成为现实，转 基因动物研究得到了进一步发展。 生产转基因动物的方法有很多，如：显微注射法、精子载体法、逆转录病毒载体法、胚胎 干细胞介导法、体细胞克隆介导法、人工染色体介导的基因转移法等，这些方法各有其优缺点，在转基因动物生产中有着不同程度的应用。 显微注射法是动物转基因技术中最早使用的方法。1982年，美国人Gordon就是利用这种 方法获得了名噪一时的转基因鼠。其基本原理是在显微镜下直接将目的基因注射到受精卵细胞 的原核内，在目的基因与胚胎基因组融合后进行体外培养，最后移植给受体母畜“借腹怀胎”。这种方法的优点是：可靠性高，重复性好，目的基因的整合效率相对较高，导入基因片段的大 小和类型不受限制，转基因在世代之间可以稳定遗传。该方法也有其缺点，主要体现在导入基 因整合的随机性和不可见性，这样会导致基因表达不稳定及可能出现不希望的插入突变。该方 法成功的范例很多，如：美国科学家Hammer等在1985年获得一批转基因兔、绵羊和猪；荷兰 科学家KrimPenfort等于1991年获得了转基因牛；1985年，我国朱作言院士等成功获得了世 界上首例转基因鱼；由中国农业大学李宁院士领导的课题组于2008年获得了一头导入人CD20 抗体基因的转基因奶牛——贝贝。 有的学者另辟蹊径，创立了精子载体转基因法。该方法是将精子与目的DNA进行预培养后，使精子具有携带目的基因进入卵子的能力，精子与卵子结合后，该基因被整合到受精卵的DNA 中。同显微注射法相比，该方法有几个明显的优点：无需显微注射操作，不会对胚胎造成损伤，整合率高，成本很低，不需要对动物进行胚胎移植手术处理等。但该方法成功率不高、效果不 稳定，有待科研人员进一步探索和改进。与显微注射法相比，该方法成功的例子不多。1989 年意大利Lavitrano等首次报道利用精子载体法获得转基因鼠；1996年意大利Sperandio科 研小组报道了采用该方法生产转基因牛和猪。 谈到病毒，人们往往面容失色，殊不知病毒在科学上有很多妙用。逆转录病毒是一种RNA 病毒，在转基因技术中有着独特的应用。人们将目的基因结合到逆转录病毒上，通过病毒感染 可将目的基因插入到宿主基因组中去。该方法具有可同时感染大量胚胎、不需要昂贵的显微注 射设备等优点，但也存在插入外源DNA大小有限、外源基因易发生重排和丢失、逆转录病毒的 序列可能干扰转基因表达等缺点。应用该方法，美国人Salter等（1987）生产出转基因鸡； 德国学者Hofmann等获得绿色荧光蛋白转基因猪（2003），随后又生产出转基因牛（2005）； 来自冷泉港实验室的Michael获得能够发荧光的山羊（2006）。 胚胎干细胞是生命体中保留的未成熟细胞，具有再分化形成其他细胞和组织器官的潜力， 被称为“万能细胞”。利用胚胎干细胞生产转基因动物的原理是将外源基因导入分离好的胚胎 干细胞，然后将转基因的胚胎干细胞注射于受体动物胚胎后，参与宿主的胚胎融合形成嵌合体，从而得到转基因动物。这一方法的优点是可以对胚胎干细胞进行特定选择。缺点是目前只有小 鼠干细胞系比较成熟，而家畜干细胞系还未完全建立，有不少问题尚待解决。 体细胞克隆介导的转基因是动物转基因技术中的“高级版本”。说到体细胞克隆，很多人都会想到一位“动物明星”——多莉羊，它是于1997年由英国Wilmut等获得的杰作。转基因 克隆技术是转基因技术和动物克隆技术的有机结合，其基本原理是将目的基因导入动物体细胞
简述转基因技术原理
转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 1992年荷兰培育出植入了人促红细胞生成素基因的转基因牛，人促红细胞生成素能刺激红细胞生成，是治疗贫血的良药。转基因技术标志着不同种类生物的基因都能通过基因工程技术进行重组，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，创造新的生命类型。同时转基因技术在药物生产中有着重要的利用价值。转基因技术，包括外源基因的克隆、表达载体、受体细胞，以及转基因途径等，外源基因的人工合成技术、基因调控网络的人工设计发展，导致了21世纪的转基因技术将走向转基因系统生物技术2000年国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程与转基因技术。 1.转基因的细胞学原理： (1)细胞周期及MPF：细胞周期可人工分成4个时期，分别为G1期、S期、G2期和M期。细胞在正常情况下，沿着G1-S-G2-M路线运转。S期为DNA合成期，M期为有丝分裂期，M期结束到S期开始之前为G1期，S期末到有丝分裂期(M期)为G2期。有丝分裂的启动由成熟促进因子也叫M期促进因子(maturation/mitosism/meiosis promoting factor，MPF)调控，MPF 在细胞分裂中呈周期性变化即分裂后逐渐积累，到G2晚期达到高峰，由中期向后期转换时骤然消失。因此推测MPF是真核细胞M期的一个基本调节物质，能引导细胞由间期向M期转变。MPF由蛋白激酶激活，存在于所有的真核细胞中(包括减数分裂的性细胞)。但并非所有的细胞都是周期中细胞，某些细胞在一定的条件下可以脱离细胞周期进入G0期或分化为不分裂的细胞，而且G0期细胞可通过诱导重新进入周期。 (2)通过MⅡ期的卵母细胞转基因：MⅡ期的卵母细胞的MPF含量很高，可以诱导细胞核发生一系列变化包括核膜破裂(NEBD)和早熟染色体凝集(premature chromosome condensation，PCC)，处于减数分裂MⅡ期的卵母细胞无核膜的时间远远长于有丝分裂M期的细胞。所以此时期的卵母细胞可作为基因导入的受体。据此1998年Anthonv等对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎方法加以改进，用逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞，注射完毕的卵母细胞同获能后的精子共同孵育后，体外发育至囊胚，再移植到母牛体内得到了转基因小牛。1999年Anthonv等又将精子与外源基因共孵育，然后将精子头部显微注射入MⅡ期的卵母细胞，这两种方法共同之处都是利用MⅡ期的卵母细胞无核膜，外源基因易导入的 特点。 2.转基因的胚胎学原理： (1)哺乳动物转基因的胚胎学原理：精子和卵子只有发育成熟后，精卵相遇时才能完成受精过程。精子进入卵子后头尾分离，胞核出现核仁，形成核膜，头部膨大形成雄原核；同时卵子排出第二极体形成雌原核。一般来说雄原核比雌原核大。接着雌雄原核的核膜消失，雌雄原核融合。随后细胞周期性卵裂，分裂球增加到32个时形成桑葚胚，进入子宫再发育至囊胚，此前的胚胎细胞具有很强的分化能力。从哺乳动物受精卵分裂发育的规律来看，转基因操作时较合适的部位是受精卵的雄原核，精子进入卵细胞后的1小时，雄原核和雌原核还未融合，在显微镜下容易看到雄原核。多数研究者在此时期把外源基因显微注射到雄原核，通
转基因动物生产综述
转基因动物生产综述 【摘要】近几年，转基因技术已成为生物界的研究热点，转基因动物作为一项生物高新技术成果，涉及到农牧业、生物医学和药物产业等诸多方面，显示出了广阔的应用前景与重要的经济价值。转基因技术对影响21世纪人类生存的重大环境、健康等问题的最终解决将发挥不可估量的作用，如改良动物经济性状提高经济效益、建立疾病动物模型从而加快人类疑难杂症的治愈、生产高价值的生物药品等。随着理论上和技术上的不断完善，转基因动物必将真正进入产业化和市场化，成为生产行业中的一种新兴产业。本文就转基因动物生产的方法、转基因动物的应用及存在的问题等作一综述。 【关键词】转基因；动物；生产；应用；问题 遗传的基本物质是DNA，基因则是位于染色体上有遗传效应的DNA片段，对于储存在生物全套染色体中的全部遗传信息，可称其为基因组。由于不同种类、不同个体的生物基因组成是不同的，因此对动物个体来说，非自身的基因成分属于外源基因，如果把外源基因整合或导入动物染色体基因中，那么这个外源基因就被称为转基因 (即转移来的基因)，这种动物就是转基因动物。1976年，Jaenisch 首次利用反转录病毒感染胚胎的方法获得了转基因小鼠。1980年Gordon等人采用受精卵原核显微注射的方法，将外源基因导入小鼠受精卵，获得了转基因小鼠。随后各种转基因动物相继出现，直到1997年，英国科学家Wilmut等获得了世界首例体细胞克隆动物，成为转基因技术的一个转折点。从此，利用体细胞克隆生产转基因动物的研究在世界各地广泛而深入地开展起来，取得了一系列重要成果。自 20 世纪70年代初诞生以来，转基因技术一直是生命科学研究和讨论的热点之一。随着研究的不断深入和实验技术的不断完善，它的研究成果在提高生产力、改善畜产品质量、生产生物医药产品、研究人类疾病模型，治疗人类的疑难病症方面都显示出了广阔的应用前景。 1 生产转基因动物的方法 生产转基因动物的常用方法有：原核期胚胎显微注射法、精子载体法、慢病毒载体法、胚胎干细胞介导法、体细胞克隆介导法、人工染色体介导的基因转移法等。 1.1原核期胚胎显微注射法 原核内显微注射是由美国人Gordon发明的，是目前应用最广泛、发展最早的方法之一。这种方法的优点是外源基因易整合入染色体，导入的基因大，可使用任何载体承载基因片段，也可注射无载体的基因片段，外源基因的长度可达100kb，实验周期相对比较短。但其不足
基因敲除小鼠技术共9页word资料
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项 高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程 图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建
动物转基因技术的研究现状与应用
动物转基因技术的研究现状与应用 课程：基因工程姓名：迪丽努尔·尼扎木墩学号：2013081605 摘要转基因动物就是指通过人工的方法将外源基因导人动物染色体基 因组，使之稳定表达并能遗传给后代的一类动物。转基因技术的一般方法有原核期胚胎的显微注射法（Microjection）、逆转录病毒载体法、精子载体法、体细胞核移植技术、胚胎干细胞介导的基因转移，这几种方法各有其公优缺点，在动物转基因上均有不同的应用，目前在动物抗病育种、建立诊断和治疗人类疾病的动物模型、利用转基因动物生产药用蛋白质等方面应用越来越广泛。 关键词转基因技术方法研究现状 转基因动物（transgenicanimal）指通过基因工程技术将目的基因导入生殖细胞、早期胚胎干细胞和早期胚胎，并整合到受体细胞的基因组中，它们经过各种发育途径形成所有细胞都包含目的基因的个体，称转基因动物（也称个体表达系统）。导入的基因称为转入基因（transgene），而整个技术则称为转基因技术（transgenictechnology或transgenesis）[1]。现代转基因动物（tx-ansgenicanimal）研究始于20世纪80年代以后,1980年，Gordon等首次获得转基因小鼠目前除转基因小鼠外，转基因兔、绵羊、猪、牛及转基因山羊、转基因鸡、转基因大鼠、转基因猴等陆续育成[2，3]。本文将从转基因动物的原理、主要方法和应用等方面作一综述。 1转基因技术的一般方法
能否将在细胞中进行的遗传修饰过渡到整体以及实现向后代的传递，主要取决于所进行修饰的细胞类型和与其相应的育种技术。迄今为止，能够被有效地用来进行转基因动物研究的途径主要有以下几种[4]： 1.1原核期胚胎的显微注射法（Mi-crojection） 该法由美国人Gordon发明，其主要步骤包括：（1）分离、克隆和重组外源基因，构建载体；（2）将融合基因注入受精卵的原核（一般是雄原核）；（3）将微注射后的受精卵移入假孕母畜的输卵管继续发育。Palmiter等（1982）将带有小鼠金属硫蛋白I基因启动子的大鼠生长激素基因导入小鼠的受精卵，获得“巨型小鼠”，在生命科学领域引起了不小的轰动。按照转基因小鼠的思路，转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊都相继成功。显微注射方法相对简单，整合率高，是目前应用比较广泛，效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。但该方法的整合位点随机，整合一般是多拷贝首尾串联相接，不利于研究基因的结构、功能及表达调控。 1.2逆转录病毒载体法 1.2.1逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎：该方法主要利用逆转录病毒的长末端重复序列（longtermi-nalrepeats，LTRs）区域具有转录启动子活性以及逆转录病毒可以直接整合到宿主染色体上的特点，将外源基因连接到LTRs下部，构建重组载体，直接感染受精卵或微注入囊胚腔中。达到外源基因在宿主染色体上的整合、表达。Salter和Haskell等分别用此方法作出了转基因鸡和牛[5]。 1.2.2逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞：Anthony等[6]（1998）对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎的方法进行了改进。他认为逆转录病毒载体介导的基因整合的关键在于细胞分裂时出现核膜分解。有丝分裂时核膜降解的时间很短。细胞分裂完成后，核膜很快重新形成。而处于减数分裂中期（MⅡ）的卵母
转基因小鼠的方法概述
转基因小鼠的应用及其制 备方法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。
转基因小鼠的应用及其制备方法 （西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验方法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验方法；应用前景 Methods and Applications ofTransgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@https://www.360docs.net/doc/7315606790.html,；Tel： *通讯作者：E-mail： 兴的最有效的动物实验模型。小鼠是最早建立的转基因动物模型，利用转基因小鼠进行生物学或生物医
转基因小鼠制备实验
转基因小鼠制备实验方法 1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。 2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。 3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。 5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。 6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。 7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。 8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。 9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。 10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。 (一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)