白腐菌
野生白腐菌分离与纯化的初步试验
前言
白腐真菌是一类使木材呈白色腐朽的真菌,能够分泌胞外氧化酶降解木质素,且降解木质素的能力优于降解纤维素的能力,这些酶可以促使木质腐烂成为淡色的海绵状团块——白腐,故称为白腐真菌
白腐菌: white rot fungi
定义: 属担子菌纲丝状真菌，因腐朽木材呈白色而得名。代表菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，在污染土壤修复中常有应用。
白腐菌是属于担子菌亚门的真菌,因腐朽木材呈白色而得名，是能够降解木材主要成分的微生物之一。木材在白腐过程中大部分纤维仍保持完整，且纤维素结晶度变化不大。由此设想利用对降解木质素选择性好的白腐菌进行生物制浆，能开辟制浆方法的新途径。白腐菌除了能降解木质素用于预理、生物漂白、生物制浆外，对其它有机异生物质也有很强的分解能力，因而在废水处理中也有广泛的应用前景。
为降低制浆能源消耗，可在制浆之前依靠白腐菌对木质素进行分解和改性，用选择过的微生物培养基对原料进行预处理。通过白腐菌对原料的预处理，可降低后阶段制浆能耗的50%，并且纤维强度性能也得到改进。
白腐菌预处理制浆不仅在木质材料制浆当中应用研究较多，在非木质制浆原料(如芦苇、蔗渣、剑麻、黄麻等)预处理制浆中的应用研究同样广泛。
可以看出，白腐菌预处理在硫酸盐法、碱法、机械法和烧碱-蒽醌法等制浆方法中都可以不同程度地降低制浆成本、提高纸张质量。但是菌种筛选困难和预处理周期较长是制约白腐菌应用的最大障碍，大规模应用于制浆预处理还需要相关方面技术的突破。
利用白腐菌可以降解木质素、半纤维素和纤维素的特性，白腐菌在制浆造纸各个环节的应用都得到了很广泛的研究，但是利用白腐菌直接制浆却鲜见报道。筛选对纤维素没有影响或影响较小的选择性极高的白腐菌种直接处理原料制浆是一个新的研究方向。20世纪90年代末，日本神户制钢所应用白腐菌在常温常压下分解木材成功制出优质纸浆。选定适宜温度，可以分解出80%的木质素，比一般化学制浆法成本降低了50%。这种白腐菌对木质素的脱除分解率极高，而对纸浆纤维中的纤维素分解极少，这样可使纸浆得率高达60%，超过化学法得浆率的50%。据此计算，木材的消耗量可节约1/9。此种制浆方法将是传统制浆方法的巨大挑战。同样，制浆周期长、白腐菌筛选困难是大规模生产的最大障碍。
在造纸工业中，为了使最终产品的白度既高又稳定，必须把浆中残余木质素所造成的棕黑色通过漂白来除去。用生物方法脱除浆中的残余木质素是现阶段人们研究最多的一种方法，普遍认为白腐菌是最有效的菌种。
白腐菌可以直接攻击木质素，很有效地除去浆中残余木质素，并且能使漂白废水中的很多有毒物质最终降解成二氧化碳和水，降低漂白废水的COD、BOD及有毒物质含量，从而降低废液的污染负荷。很多国家的实验室进行了这方面的研究，尤其是日本。
在利用白腐菌进行漂白纸浆时，不免有纤维素被降解。因此，筛选出选择性高的白腐菌种是当前存在的最突出的问题。
制浆造纸工业的废液由于含有毒、致突变、难降解的有机氯化物而日益受到高度的重视。白腐菌具有能降解木质素和变性木质素的活酶系统，能将漂白废水中的有机氯化物转变成无机氯和二氧化碳，并破坏发色基团组织和结构，降低漂白废水中的总有机氯化物、BOD、COD和色度。
白腐菌除了可以降解废水中的木质素，还可以降解废水中异生物质，减轻造纸废水对环境的污染，具有很高的应用价值。但是如何缩短处理周期，提高处理效率仍然是一个亟需解决的问题。
由于白腐菌特有的降解木质素的功能，在原料预处理、生物漂白、废水处理和生物制浆等各个环节的应用都得到了重视，并且实验室阶段研究已取得了显著成效。但是，白腐菌在大规模生产中应用还存在很多问题：处理效率低、周期长、连续化培养生产各种白腐菌的生物反应器尚待进一步研究和完善、菌种筛选困难、白腐菌的作用机制还不完全清楚。因此，研究如何培养处理效率高、选择性强、生长迅速、可以连续使用的菌种，必将引起污染严重的传统制浆工艺的较大改革。
关键词: 白腐菌: white rot fungi 黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)
材料和方法: 在自然界中采集腐木,放入培养箱中不加任何药品和试剂进行陪.以加大培养和分离的成功率.然后将经过初步培养的腐木经过人工分割处理,放入蛋白胴培养基和孟加拉红培养基中分别进行培养.
杂草
39℃平板扩增，在平板表面出现大量白色菌丝，6～8d内形成丰富的粉状分生孢子；再将孢子无菌地移入灭菌蒸馏水中，轻轻振动，使其充分分散，制成乳白色的孢子悬浮液，置于4℃下保存。
固体生长培养基：
每升固体生长培养基含：200g土豆浸出液，20g葡萄糖，20g琼脂，3g
KH2PO4，1.5g MgSO4。
液体营养限制培养基
每升液体营养限制培养基含：0.2g KH2PO4，0.05g MgSO4.7H2O，0.01g CaCl2，10g葡萄糖，0.5mL有机溶液(其组成见表1)，1mL无机溶液(其组成见表2)，1.2mmol/L酒石酸铵。以酒石酸钠溶液或琥珀酸钠溶液为缓冲液。
：属担子菌纲丝状真菌，因腐朽木材呈白色而得名。代表菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，在污染土壤修复中常有应用。
白腐菌可以降解木质素、半纤维素和纤维素的特性，白腐菌具有能降解木质素和变性木质素的活酶系统，能将漂白废水中的有机氯化物转变成无机氯和二氧化碳，并破坏发色基团组织和结构，降低漂白废水中的总有机氯化物、BOD、COD 和色度。
白腐真菌
白腐真菌 前言 白腐真菌(white rot fungi)为丝状真菌，系木腐真菌(wood—degrading fungi)的一种，绝大多数为担子菌纲，少数为子囊菌纲，着生在木材上，因其能降解木材中的木质素、纤维素和半纤维素使木材呈现特征性的白色腐朽状而得名。日前研究最多的有：黄孢原毛平革菌(Phanerochete chrysosporium)[1]、彩绒草盖菌(Coridusversicolor)、变色栓菌(Thametes versicolor)、射脉菌(Phlebia radiata)、风尾菇(Pleurotus pul—mononanus)等。其中黄孢原毛平革菌是其典型种，也是研究木质素降解的模式菌。白腐真菌是已知的唯一能在纯系培养中有效地将木质素降解为CO2和H2O 的一类微生物。木质素是由苯丙烷单元通过醚键和碳一碳键连接而成的具有三维空间结构的高分子芳香族类聚合物。组成单元的结构及其连接键复杂而稳定，使得木质素很难降解[2]。木质素结构的异质性和不规则性，决定了对其生物降解的复杂性和特殊性。白腐真菌经过长期进化，形成了相应的适应性特性：白腐真菌能分泌氧化酶到胞外，在催化氧化过程中形成自由基，进而攻击木质素结构，此过程不需要特异的电子供体，因此其作用具有非特异性[3]。1983年Kirk和Gold两个研究小组发现能够利用白腐真菌的上述生物学特性降解染料[4,5]。此后，白腐真菌受到许多研究者的高度关注，并在将白腐真菌应用于降解诸如染料、三硝基甲苯(TNT)等许多难降解有机物方面进行了有成效的探索[6]，在木质素降解酶的生理生化过程以及基因调控方面获得了一些有意义的研究成果。以下就酶系统基因结构，催化机制，应用及新发展几方面进行介绍。木质素降解酶系统 白腐真菌依赖一系列酶催化反应实现对难降解有机物的转化，这一过程殊为复杂，其中的关键酶系为木质素降解酶系。木质素降解酶主要包括了3 种酶:木质素过氧化物酶( lignin peroxidase，LiP) 、锰过氧化物酶( mangnase peroxidase，MnP) 、漆酶( laccase，Lac) 这3 种木质素降解酶均能单独降解木质素，也能两两联合，或者3 种酶一起作用对木质素进行降解。 1、木质素降解酶的比较 1.1 LiP、MnP 和Lac 三种酶的结构及组成特点
漆酶催化活性中心结构及应用的研究进展
第8卷第2期2000年 6月 纤维素科学与技术 Journal of Cellulose Science and T echnology V ol.8 N o.2 Jun. 2000 综述评论漆酶催化活性中心结构及应用的研究进展Ξ 李光日 余惠生3 付时雨 秦文娟 (中国科学院广州化学研究所纤维素化学开放研究实验室 广州 510650) 文 摘:综述了漆酶催化活性中心结构及应用的研究进展。漆酶的催化 反应发生在铜离子形成的活性中心,但其氧化能力与氨基酸配体有密切 的关系。漆酶可应用于带有羟基或氨基的芳香族单体的聚合反应,偶氮 染料的合成及降解,稠环芳烃的降解去毒等。同时在纸浆的洁净漂白,化 学分析中痕量物质的检测,食品的保鲜及改良和环保等方面有重要应用。 关键词:漆酶,催化活性中心结构 中图法分类号:Q55 0 前 言 漆酶是一类含铜的多酚氧化酶(P—diphenol:oxidoreductase,EC1.10.3.2)。早在1883年,Y oshida从漆树的分泌物中发现了一种蛋白质,它可使油漆迅速固化[1]。1894年Bertrand将这种蛋白质命名为漆酶[2]。随后人们发现这种酶不仅存在于漆树的分泌物中[3～5],而且存在于多种植物[6～8]、昆虫[9,10]和高等真菌中[11～15]。 近年来,漆酶在痕量物质的分析、染料合成与降解、食品性质的改良、环保和皮革工业等领域显示了较高的应用价值。尤其重要的是漆酶在氧化还原介体的协助下具有降解木素的能力[16],可以用于纸浆中残余木素的脱除,有利于发展全无氯的纸浆漂白技术。与传统的氯漂工艺相比,利用漆酶来脱除纸浆中的残余木素,不会产生有毒性的氯酚类化合物,对减少环境污染有着重要的意义。因此漆酶作为一种具有很大的潜在应用价值的酶越来越受到人们的关注。关于漆酶产生方面的研究大多数是以白腐菌为研究对象,只有少数是以细菌[17]为研究对象。王佳玲等人对产漆酶白腐菌菌种,培养方式及产漆酶效果的影响因素等方面做过较为系统的总结[18]。本文将分以下三个方面对近年来有关漆酶的一些研究结果进行扼要的综述。 1 漆酶的催化活性中心结构 漆酶一般以单蛋白体的形式存在,其分子量范围一般是从52K Da到110K Da,也有些漆酶分子的分子量大于110K Da。不同来源的漆酶其分子被不同程度地糖基化,碳水化合物含量占10%～45%(质量分数),一般情况下真菌漆酶的碳水化合物含量要低于植物漆酶的碳水化合物含量[19]。含有糖基的蛋白不易结晶,为了研究漆酶蛋白多肽的 收稿日期:2000-01-06 国家自然科学基金和广东省科学基金资助课题 3通讯联系人
白腐真菌的木质素降解酶
２６生物学通报２００５年第４０卷第８期 １２００ｍ以下的山地林中，在四川和云南垂直分布可达到３５００ｍ。 从系统位置看，上述植物都是裸子植物中较进化的科属类群。由于它们的种子常常为假种皮等附属结构所全部或部分包被，而使种子呈核果状、坚果状或浆果状。这些情况不但反映出裸子植物与被子植物之间的系统亲缘关系，而且对于裸子植物的进化与适应辐射也具有重要的意义。一方面，这些结构能够对种子起到良好的保护作用；另一方面，这类肉质营养组织可以作为传播其种子的食果动物的食物，从而吸引并促进动物对裸子植物种子的传播。裸子植物由种子及肉质假种皮或种鳞所构成的传播体在种子传播功能上，以及鸟类等食果动物对这类裸子植物种子取食与传播的方式和途径方面也是与被子植物的肉质果实完全相同的［４－５］。事实上，即使在被子植物一些适应于鸟类等食果动物传播种子的植物类群中，如荔枝属（Ｌｉｔｃｈｉ）和卫矛属（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ）等，它们的核果或蒴果中的肉质结构也并非来源于子房壁发育而来的果皮，而是同样为包被种子的假种皮。 参考文献 １周云龙．植物生物学，第２版．北京：高等教育出版社，２００４，３６５—３６６． ２ＲａｖｅｎＰ．Ｈ．ＪｏｈｎｓｏｎＧ．Ｂ．．Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＦｏｕｒｔｈＥｄｉｔｉｏｎ．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｍｃｇｒａｗ－ＨｉｌｌＣｏｍｐａｎｉｅｓ，１９９６：７３１—７３３． ３中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志，第７卷，北京：科学出版社，１９７８：１—５４２． ４李新华，尹晓明，贺善安．南京中山植物园秋冬季鸟类对树木果实的取食作用，动物学杂志，２００１，３６（６）：２０—２４．５李新华，尹晓明，贺善安．南京中山植物园秋冬季鸟类对植物种子的传播作用，生物多样性，２００１，９（１）：６８—７２． （ＢＦ） 木质纤维素（ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）主要由纤维素（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、半纤维素（ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）和木质素（ｌｉｇｎｉｎ）所组成，是自然界中广泛存在的可再生的数量巨大的生物质（ｂｉｏｍａｓｓ）资源。木质素是由苯丙烷衍生物单体（如香豆醇、松柏醇和芥子醇等）构成的一种结构复杂的立体网状物质，是植物细胞胞间层和初生壁的主要填充物。在植物组织中，木质素与半纤维素一起构成了包裹在纤维素周围的基质，占植物细胞化学组成的１５％～３６％。木质素是第２大类天然聚合物，在数量上仅次于纤维素。由于木质素立体结构的复杂性，所以绝大多数微生物不易对其进行生物学降解。木质素的微生物降解作用是维持自然界生物碳素循环的重要组成部分。白腐真菌所产生的木质素降解酶可有效地分解木质素和芳香族污染物，因而在生物制浆、纸浆的生物漂白和环境保护等方面具有重要的研究价值和应用前景。１木质素降解酶的来源 迄今为止，已知参与降解木质素的微生物包括真菌、放线菌和细菌，其中，真菌是最为重要的一类。由于微生物的作用，木材腐朽时形态上发生变化，人们把参与木材腐朽的真菌分为白腐真菌（ｗｈｉｔｅ－ｒｏｔｆｕｎｇｉ）、褐腐真菌（ｂｒｏｗｎ－ｒｏｔｆｕｎｇｉ）和软腐真菌（ｓｏｆｔ－ｒｏｔｆｕｎ－ｇｉ），其中白腐真菌是一类能够引起木材白色腐朽的真菌，它们绝大多数属于高等担子菌，也是目前已知在自然界中降解木质素能力最强的一类真菌。在整个木质素生物降解系统中，虽然细菌、放线菌、软腐菌和褐腐菌也能够发挥一定作用，但是，一般认为它们仅起次要作用。降解木质素的微生物主要是一些可分泌胞外过氧化物酶的白腐真菌。目前，用于木质素降解研究 的只有１０余种，主要是烟管菌属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、香菇菌属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、平革菌属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、侧耳属（Ｐｌｅｕ－ｒｏｔｕｓ）和栓菌属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）中的一些种。白腐真菌所产生的参与木质素降解的酶系主要由木质素过氧化物酶（ｌｉｇｎｉｎｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＬｉＰ）、锰过氧化物酶（ｍａｎｇａｎｅｓｅｐｅｒ－ｏｘｉｄａｓｅ，ＭｎＰ）和漆酶（ｌａｃｃａｓｅ）等所组成，这些酶类合称为木质素降解酶或木质素酶。 ２木质素降解酶的催化反应机理 木质素过氧化物酶（ＬｉＰ）以低浓度Ｈ ２ Ｏ ２ 为氧化剂，经历一个双电子氧化步骤和两个单电子还原步骤，使非酚型芳香族底物形成阳离子自由基，后者再进行一 系列非酶催化的反应从而导致芳香环裂解。当Ｈ ２ Ｏ ２ 和二羧酸螯合剂（如丙二酸盐和草酸盐）存在时，锰过氧化物酶（ＭｎＰ）能氧化Ｍｎ２＋成为Ｍｎ３＋，后者再进一步氧化各类酚型化合物，如２，６－二甲氧基酚、香草丙酮和苯酚等。在许多真菌中，ＭｎＰ是木质素起始降解的关键酶，因为ＭｎＰ可产生强氧化态的Ｍｎ３＋，Ｍｎ３＋作为可扩散的氧化还原介质再进一步裂解木质素聚合物中的芳香 白腐真菌的木质素降解酶 陈素华（菏泽市牡丹区北城中学山东菏泽２７４０００） 摘要简述了白腐真菌木质素降解酶的概念、催化反应机理及在纸浆的生物漂白和染料脱色中的应用。 关键词白腐真菌木质素降解酶木质素生物漂白染料脱色 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
生物法降解秸秆木质素研究进展
生物法降解秸秆木质素研究进展 摘要秸秆中的木质素是潜在的可再生资源。近年来,利用生物法对其进行降解已成为研究热点。从木质素生物降解性出发,对降解木质素微生物、酶系以及降解条件进行介绍,以期为木质素生物降解法的推广应用提供参考。 关键词生物法降解;秸秆;木质素 秸秆是一种丰富的纤维素可再生资源,我国农作物秸秆年产量逾6亿t,除少量被用于造纸、纺织等行业或用作粗饲料、薪柴外,大部分以堆积、荒烧等形式直接倾入环境,造成极大的污染和浪费[1]。能源紧张、粮食短缺及环境污染日趋严重是目前世界各国所面临的难题。而可再生资源的转化利用,能在有利于生态平衡的条件下缓解或解决问题。 木质素又称木素,是植物界中含量仅次于纤维素的一类高分子有机物质,是一种极具潜力的可再生资源[2-4],每年全世
界植物可生长1 500亿t木质素,且木质素总与纤维素伴生,具有无毒、价廉、较好的可热塑和玻璃化特性。木质素是苯丙烷结构单元组成的复杂的、近似球状的芳香族高聚体,对羟基肉桂醇(phydroxy cinamylalcohols)脱氢聚合而成,一般认为木质素共有3种基本结构(非缩合型结构),即愈创木基结构、紫丁香基结构和对羟苯基结构。木质素结构单元之间以醚键和碳-碳键连接,连接部位可发生在苯环酚羟基之间,或发生在结构单元中3个碳原子之间,或是苯环侧链之间。木质素于分子量大,溶解性差,没有任何规则的重复单元或易被水解的键,因此木质素分子结构复杂而不规则[5,6]。 从20世纪开始,国内外学者一直在寻找降解木质纤维素的最佳途径,研究内容主要包括以下几方面:物理法、化学法、物理化学法、生物降解法[7]。物理法包括辐射、声波、粉碎、整齐爆破等[8,9]。化学法包括无机酸(硫酸、乙酸、盐酸等)、碱(氢氧化钠、氨水等)和有机溶剂(甲醇、
真菌漆酶的研究进展及其应用前景
万方数据
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真菌漆酶的研究进展及其应用前景 作者：周雪婷， 张跃华， 罗志文， 潘亭如， 缪天琳 作者单位：佳木斯大学,黑龙江佳木斯,154007 刊名： 农业与技术 英文刊名：Agriculture & Technology 年，卷(期)：2012,32(9) 参考文献(33条) 1.王光辉;季立才中国漆树漆酶的底物专一性 1989 2.Nina H;Laura-Leena K Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear coper site 2002(08) 3.雷福厚;蓝虹云漆树漆酶和真菌漆酶的异同研究[期刊论文]-中国生漆 2003(01) 4.李慧蓉白腐真菌生物学和生物技术 2005 5.Harald Claus Laccases:structure.reactions,distrihution 2004(35) 6.张丽白腐真菌产漆酶对染料废水降解的研究 2004 7.张敏;肖亚中;龚为民真菌漆酶的结构与功能[期刊论文]-生物学杂志 2003(20) 8.Gimifreda L;Xu F;Bollag J-M Laccases:a useful group of oxido reductive enzymes 1999(03) 9.Xu F;Kulys J J;Duke K Redox Chemistry in Laccase-Catalyzed Oxidation of N-Hydroxy Compounds 2000(66) 10.堵国成;赵政;陈坚真菌漆酶的酶活测定及其在织物染料生物脱色中的应用[期刊论文]-江南大学学报（自然科学版） 2003(02) 11.缪静;姜竹茂漆酶的最新研究进展[期刊论文]-烟台师范学院学报(自然科学版) 2001(17) 12.刘尚旭;赖寒木质素降解酶的分子生物学研究进展[期刊论文]-重庆教育学院学报 2001(14) 13.何为;詹怀宇;王习文;伍红一种改进的漆酶酶活检测方法[期刊论文]-华南理工大学学报（自然科学版） 2003(31) 14.季立才;胡培植漆酶结构,功能及应用 1996(18) 15.侯红漫白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶及对蒽醌染料和碱木素脱色的研究 2004 16.Huang Z Y;Huang H P;CaiR X Organic solvent enhanced spectrofluorin etric method for determition of laccase activity 1998(01) 17.Badiani M;Felici M;Luna M Laccase assay by means of highperfomance liquid chromatography 1983(02) 18.Wood D.A Production,Purification and Properties of Extracelluar laccase of Agaricus bisporus 1980(17) 19.林俊芳;刘志明;陈晓阳真菌漆酶的酶活测定方法评价[期刊论文]-生物加工过程 2009(04) 20.望天志;李卫莲;万洪文微量热法测定漆酶的活性[期刊论文]-自然杂志 1997(06) 21.Kirk T K;Farrell R L Enzymatic "combustion":The microbial degradation of lignin 1987(10) 22.张爱萍;秦梦华;徐清华漆酶在制浆造纸中的应用研究进展[期刊论文]-中国造纸学报 2004(02) 23.Reid I D Biological pulping in paper manufacture 1991(08) 24.Bergbauer M;Eggert C;Kraepelin G Degradation of chlorinated lignin compounds in a bleach plant effluent by the white-rot fungus Trametes Versicolor 1991(35) 25.林建城酶在食品工业,轻工业和环境保护上的应用分析[期刊论文]-莆田学院学报 2005(02) 26.林鹿;陈嘉翔白腐菌对纸浆CEH漂白废水的脱色、消除毒性和芳香化合物的降解 1996(11) 27.E Rodriguez;MA.Pickard;R Vazquez-Duhalt Industial dye decolorization by laccases from ligninolytic fungi 1999(38) 28.Bollag J M;Myers C Detoxification of aquatic and terrestrial sites through binding of pollutants to humic substances 1992(117-118) 29.Majcherczy A Oxidation of ploycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) by laccase of Trametes versicolor 1998(22) 30.刘涛;曹瑞饪漆酶在环境保护领域中的研究及应用进展[期刊论文]-云南环境科学 2005(03) 31.Collins P J;Kotterman M J J;Field J A;Dobson A Oxidation of Anthracene and Benzo[a]pyrene by Laccase from Trametes versicolor[外文期刊] 1996(12)
白腐菌对玉米秸秆木质素降解的效果
白腐菌对玉米秸秆木质素降解的效果 摘要 摘要: 添加不同品种和比例的白腐菌，研究其对玉米秸秆中木质素的降解情况。结果表明，在尿素与白腐菌的共同作用下，玉米秸秆的粗蛋白含量平均提高180% ; 在白腐菌的单独作用下 摘要: 添加不同品种和比例的白腐菌，研究其对玉米秸秆中木质素的降解情况。结果表明，在尿素与白腐菌的共同作用下，玉米秸秆的粗蛋白含量平均提高180% ; 在白腐菌的单独作用下，平均降解木质素33. 4% 。2 株白腐菌对玉米秸秆中木质素的降解速率不同，白腐菌2 ( 编号GIM3. 393) 对木质素的降解能力优于白腐菌1 ( 编号GIM3. 383) 。 关键词: 白腐菌; 木质素; 粗蛋白; 玉米秸秆 玉米秸秆是丽水最常见农作物的废弃资源，使玉米秸秆资源化利用既可美化农村环境，保护水资源环境，营造农旅结合的优美环境，又为畜牧养殖业提供可食性的资源，丰富饲料的品种，达到资源循环利用的目的。但玉米秸秆用作草食性动物的饲料还存在几个缺点，主要是粗蛋白含量低、木质素含量偏高、食口性差[1]。本试验通过在玉米秸秆中加入不同比例、不同品种的白腐菌，作用不同时间后，测定白腐菌对玉米秸秆中的木质素降解及粗蛋白的含量变化的影响[2-3]，了解白腐菌对玉米秸秆的木质素降解情况，为玉米秸秆的进一步利用提供理论依据。 1 材料与方法 1. 1 供试菌株 白腐菌来源于上海名劲生物科技有限公司，编号GIM3. 383 ( 标记为A) 、GIM3. 393 ( 标记为B) ，黄孢原毛平革菌。 1. 2 材料 来源于丽水市莲都区收集而来的成熟后的玉米秸秆，将其截成3 ～5 cm 的长度，加入10% 的尿素，处理4 ～5 h。此时玉米秸秆湿度为60% 左右。
最新微生物对污染物的降解和转化
微生物对污染物的降解和转化 ?有机污染物生物净化（天然物质、人工合成物质） ?无机污染物生物净化 第一节有机污染物的生物净化机理 ?净化本质——微生物转化有机物为无机物 ?依靠——好氧分解与厌氧分解 一、好氧分解 ?细菌是其中的主力军 ?原理：好氧有机物呼吸 ? C → CO2 + 碳酸盐和重碳酸盐 ? H → H2O ? N → NH3→ HNO2→ HNO3 ? S → H2SO4 ? P → H3PO4 ?二、厌氧分解?厌氧细菌 ?原理：发酵、厌氧无机盐呼吸C → RCOOH（有机酸）→CH4 + CO2 ?N → RCHNH2COOH → NH3（臭味） + 有机酸（臭味） ?S → H2S（臭味） ?P → PO 3- 4 ?水体自净的天然过程中 厌氧分解（开始）→好氧分解（后续）第二节各类有机污染物的转化 一、碳源污染物的转化
?包括糖类、蛋白质、脂类、石油和人工合成的有机化合物等。 1．纤维素的转化 ?β葡萄糖高聚物，每个纤维素分子含1400~10000个葡萄糖基（β1-4糖苷键）。 ?来源：棉纺印染废水、造纸废水、人造纤维废水及城市垃圾等，其中均含有大量纤维素。 A．微生物分解途径 B．分解纤维素的微生物 ?好氧细菌——粘细菌、镰状纤维菌和纤维弧菌 ?厌氧细菌——产纤维二糖芽孢梭菌、无芽孢厌氧分解菌及嗜热纤维芽孢梭菌。?放线菌——链霉菌属。 ?真菌——青霉菌、曲霉、镰刀霉、木霉及毛霉。 ?需要时可以向有菌种库的研究机构购买或自行筛选。 2．半纤维素的转化 ?存在于植物细胞壁的杂多糖。造纸废水和人造纤维废水中含半纤维素。 ?分解过程 ?分解纤维素的微生物大多数能分解半纤维素。 ?许多芽孢杆菌、假单胞菌、节细菌及放线菌能分解半纤维素。霉菌有根霉、曲霉、小克银汉霉、青霉及镰刀霉。 3．木质素的转化自然界中哪些微生物能够进行木质素的降解呢？?确证的只有真菌中的黄孢原毛平革菌，疑似的有软腐菌。 黄孢原平毛革菌(Phanerochaete chrysosprium)是白腐真菌的一种，隶属于担子菌纲、同担子菌亚纲、非褶菌目、丝核菌科。 白腐—树皮上木质素被该菌分解后漏出白色的纤维素部分。*木质素降解的意义何在呢？（二）油脂的转化
漆酶对环境污染物降解的研究
《环境生物技术》论文 ——漆酶对污染物降解的研究 漆酶对环境污染物降解的研究 摘要：漆酶是一种含铜多酚氧化酶，该酶是一种氨基酸残基在500个左右的单体酶，一般都为酸性蛋白，漆酶的应用集中在以下几方面：生物漂白，环境治理，漆酶降解有害物质，工业废水处理；其他方面的应用；等等。本文进行了漆酶对废水降解的初步研究，并对染料废水的降解机理和部分影响因素进行了一定的分析探讨。 关键词：漆酶、应用、降解机理、影响因素。 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白属铜蓝氧化酶家族中的同一小族，在结构和功能上存在着许多相似之处。它最早是从日本漆树的汁液中发现的，后来也发现其存在于多种植物、昆虫和高等真菌中【1】。不同来源的漆酶具有不同的催化性质．即使是相同来源，比如同一白腐菌菌种，可分泌多种具有不同性质的漆酶组分，包括氧化能力，酶蛋白分子量，最适pH值、底物的专一性等等…，因此所起的作用是各不相同的。在漆酶降解木素方面已进行了较多较深入的研究，漆酶除了能氧化木质素以外，还被证明能催化多种底物，如酚类化合物及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及甾体激素等【2】。由于许多漆酶氧化的底物为环境污染物，因此利用白腐真菌产生的漆酶处理印染废水，降解染料化合物的研究在环境保护中具有十分重要的意义。应用漆酶来实现纸浆的生物漂白正是研究的一个热点【3】；另外，漆酶还具有降解氯化有机物去除环境中有毒污染物毒性的作用，本文就漆酶的这一性质做一介绍。
1 漆酶的催化机理 一般认为生物法降解主要有两种机理在起作用：吸附和降解，以降解为主。生物降解又分为两步：一是染料分子吸附到菌体上，部分透过细胞膜进入细胞体内；二是利用微生物产生的酶催化氧化还原染料分子，破坏不饱和共轭体系，达到去色的目的，中间产物进一步氧化还原分解并最终分解为C02和水或转化为所需的营养物质，组成新的原生质【4】。 根据对漆酶光谱学、动力学和晶体衍射的研究，漆酶催化底物的方式可能如下：底物结合于酶活性中心的I型铜原子位点，通过cys．His途径将其传递给三核位点，该位点进一步把电子传递给结合到活性中心的第二底物氧分子，使之还原为水。整个反应过程需要连续的单电子氧化作用来满足漆酶的充分还原，还原态的酶分子再通过四电子转移传递给分子氧，因此漆酶又被称为分子电池。在此过程中，氧还原很可能分两步进行，两个电子转移产生过氧化氢中间体，该中间体在另两单电子作用下被还原为水。 2 漆酶的主要用途 2. 1 环境治理 生物整治包括染料脱色、工业废水处理和土壤修复等领域。因漆酶对底物的专一性要求不高，含介体的酶催化系统能氧化大范围的化合物，所以在环境污染控制中有广泛的应用。由于合成染料广泛的用于印染工业，目前已超过10，000种。合成染料被人们设计成防水、抗光照、抗氧化的生物难降解化合物，以通常的活性污泥方法处理纺织废水很难达到预期目的，同时存在着花费高和污泥再处理的问题。而筛选的染料降解细菌，对降解的染料结构有高度的专一性，不适用于化学结构多样性的纺织废水处理【5】。 由于漆酶具有降解残余木素、氧化去除有毒氯酚化台物的作用．因此不少研究者尝试将漆酶用于处理含酚的工业废水。效果还是比较显著的。木材剥皮废水中含有有色的酚型化台物，使用漆酶处理该废水。通过催化氧化聚合反应，可去除90％以上的鞣酸类和其他酚型化台物，废水经硫酸铝絮凝后，色度下降82％；同样的混台废水经漆酶处理lh随后经硫酸铝絮凝，由色谱分析证实86％的氯代酚，99％的氯代愈疮木酚和80％的氯代香草醛，92％的氯代儿荣酚可被去除掉。漆酶还可以降低造纸厂漂白车间碱抽提段废水，漆酶经固定化后，可进一步提高漆酶处理废水脱色的有效性，每一单位酶活所降低的废水色度值．就白腐菌处理废水与漆酶处理废水的脱色效果比较而言，白腐菌处理3天可使废水脱色30％-50％，与漆酶处理几小时的脱色效果相近。但随着处理时间的延长，白腐菌总的废水脱色率达到70％一80％，比用漆酶处理的废水的脱色率高20％～30％，这可能是由于白腐菌处理时，分泌出的多种酶所起的协同作用。因此结合使用两种或多种酶可能提高处理废水的效果【6】。
真菌漆酶的研究进展
真菌漆酶的研究进展 宋瑞（安徽大学生命科学学院合肥230039） 【摘要】漆酶是一种蓝色多铜氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶，哺乳动物的血浆铜蓝蛋白属同族，能够催化多种有机底物和无机底物的氧化[1,2]，同时伴随分子氧还原成水。漆酶广泛分布于真菌、高等植物、少量细菌和昆虫中，尤其在白腐真菌中普遍存在。漆酶特有的结构性质和作用机理使其具有巨大的应用价值。本文就真菌漆酶结构，功能的研究进展作一综述，并对其应用作简单介绍。 【关键词】真菌漆酶三维结构功能应用 1真菌漆酶结构特征 1.1 漆酶的组成 漆酶是一种糖蛋白，肽链一般约由500个氨基酸组成[3]，糖基含量差异较大，占整个分子质量的10%—80%[4]，据相关报道，漆酶的热稳定性可能与其糖基化有关。糖组成包括半乳糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、氨基己糖和阿拉伯糖等。Mayer[5]认为漆酶并不均一，它由多条5000~7000分子量的糖肽链基本结构单元组成。由于结构单元之间的缔合度不同，造成了各种漆酶分子量的不同。另外，分子中的糖基的差异，也会引起漆酶的分子量随来源不同会有很大的差异，从59—390ku不等。真菌漆酶约含19种氨基酸，绝大部分为单体酶，但也有例外，如双孢蘑菇和长绒毛栓菌漆酶由两个亚基组成[6]，而柄孢壳漆酶I由四个亚基组成。漆酶种类繁多，不同种类的真菌产生的漆酶种类不同，即使同一种真菌在不同环境下也产生不同种漆酶。
1.2漆酶的晶体结构 由于漆酶是含糖蛋白质，且糖质量分数较高，一直以来很难获得X-衍射分析所用的单晶体，因此阻碍了关于漆酶结构的研究进展。1998年第一个漆酶晶体是Ducros V[7]制备的来自灰盖鬼伞(Coprinus cinereusv)T1Cu缺失型漆酶晶体，并分析了其结构。至今为止，Bacillus subtilis(CoA)[8]；Melanocarpus albomyces(MaL)[9]；Rigidoporus lignosus(RiL)[10]；Pycnoporus cinnabaricus(PcL)[11]；Coprinus cinereus(CcL)[12]和Trametes versicolor(TvL)[13]漆酶的三维结构已相继被报道。 漆酶分子整体由3个杯状结构域所组成，分别称作结构域A、B、C，每个结构域主要由β-折叠桶，α-螺旋，loop结构所组成。三者紧密结合形成球状结构。这是铜蓝蛋白家族所共有的结构形式[7,9]。分子当中含有二硫键，漆酶种类不同，二硫键数目也不一样，MaL 漆酶分子由3个二硫键，分别是位于结构域A Cys4～Cys12、结构域A和C界面上Cys114～Cys540、结构域C Cys298～Cys332，而CcL，RiL漆酶中则含有两个二硫键。在CcL漆酶分子中，由结构域A的Cys85和结构域B的Cys487形成一个二硫键，另一个二硫键存在于结构域A和结构域B(Cys117—Cys204)之间。一个伸展的loop(氨基酸284—327)连接结构域B和结构域C。Asn343上有N连接的N—乙酰葡萄胺。 1.3 漆酶的催化中心 真菌漆酶分子中一般都含有4个Cu原子，根据磁学和光谱学性
漆酶在制浆造纸中的应用研究进展
收稿日期:2004 07 19(修改稿) 作者简介:张爱萍,女,1980年生;山东轻工业学院硕士研究生;主要研究方向:纤维资源的制浆造纸特性与生物技术应用。 E mail:zhap@https://www.360docs.net/doc/7611587684.html, 漆酶在制浆造纸中的应用研究进展 张爱萍 秦梦华 徐清华 (山东轻工业学院制浆造纸工程省级重点学科,山东济南,250100) 摘 要:漆酶是一种多酚氧化酶,参与木素的降解或聚合,具有氧化木素的能力,在制浆造纸中的应用已拓展到脱墨、漂白、制浆、废水处理、增加湿强性能等诸多方面。本文综述了近年来漆酶在制浆造纸工业中的应用研究进展。关键词:漆酶;脱墨;漂白;湿强中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:1000 6842(2004)02 0161 05 漆酶是一种含酮的多酚氧化酶(p diphenol oxidore ductase,EC 1 10 3 2),最早是1883年Yoshida 从漆树的分泌物中发现的[1],以后的研究进一步发现漆酶广泛存在于昆虫、植物和真菌中,尤其在一些能够降解天然木素的白腐菌(T versicolo r )中大量存在。 作为一种木素降解酶,漆酶可以降解生物体中的木素。漆酶的氧化还原电势比较低,为300~800m V (对标准氢电极)[2],只能氧化降解木素中的酚型结构单元(图1),而不能氧化占木素90%的非酚型结构。1990年[3] 发现如果有低分子质量的化合物作为氧化还原介体,漆酶能氧化非酚型木素结构(图2),最适合的介体是一些酚型化合物和杂环如卟啉类化合物,这些介体物质有的来自真菌次生代谢产物或木素降解产物,如紫丁香醛和来自P ycno porus cinnabarinus 的3 羟基邻氨基苯甲酸(3 hydroxyanthranilicacid,3 HAA);有的来自人工合成化合物,如AB TS[2,2 联氨 二(3 乙基 苯并噻唑 6 磺酸)]、HB T (1 羟基苯并三唑)、VI O (紫尿酸)、NHA(N 羟基 N 乙酰苯胺)等[4]。据报道,在氧气存在的条件下,漆酶能将介体转化成共介体,由于这种共介体尺寸较小,能够渗透进入纤维而与木素反应,脱木素机理基于自由基的形成[5 6]。目前,漆酶在制浆造纸工业的诸多方面得到了广泛的应用,如二次纤维回用、漂白、制浆、废水处理、纤维性能的改善,湿强剂及纤维板制造等,本文就这些方面的研究进展进行了综述。 1 漆酶在二次纤维回用中的应用 近年来,二次纤维在原料中所占的比例日益增加, 脱墨技术引起了越来越多的关注,酶法脱墨是一种经济有效的脱墨方法,可以减少化学脱墨带来的环境污染,而且酶处理可以改善浆料滤水性能和纸页强度,降 低漂白化学品用量。 图1 漆酶氧化酚型木素结构 图2 漆酶介体体系氧化非酚型木素结构 161 Vol 19,No.2,2004 Transactions of China Pulp and Paper 中 国 造 纸 学 报
白腐真菌在环境保护中研究与应用进展
摘要综述了近年来白腐真菌在环境保护中的研究进展，主要包括在多种工业废水处理、垃圾堆肥及其渗滤液处理、煤炭脱硫、作物秸秆发酵、土壤生物修复等方面的应用。关键词 白腐真菌 环境保护 应用 中图分类号 Ｘ７０３．１ＴＱ０８５＋．４１３ 白腐真菌在环境保护中研究与应用进展 吴林林 阮宇鹰 武琳慧黄民生 华东师范大学环境科学系（上海 ２０００６２） 环境保护 ０前言 环境中难降解有机污染物日积月累并持久存在 的结果已严重危害生态系统的健康和人类社会的可持续发展。这些污染物产生于各种工农业生产及人类生活活动中，除难以降解外它们还具有较高的生物毒性和致癌、致畸、致突变危害性，是环境治理与保护工作的重点和难点。白腐真菌通过木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶等关键酶催化自由基链式反应，对环境中难降解有机污染物具有高效、广谱的降解功能。自２０世纪８０年代以来，国内外许多学者开始应用白腐真菌进行环境治理与修复的实验和应用研究。本文对白腐真菌在多种工业废水处理、垃圾及其渗滤液处理、煤炭脱硫、作物秸秆发酵、土壤生物修复等方面的研究与应用进展进行了综述。 １ 白腐真菌在工业废水处理中的研究与应用 １．１ 造纸废水处理 吴涓等研究了不同白腐真菌对灰法造纸黑液废 水的处理效果，考察了黑液废水浓度和碳氮源添加量对黑液脱色及ＣＯＤＣｒ去除率的影响。研究结果表明，变色栓菌（Ｔｒａｍｅｔｅｓｖｅｒｓｃｏｌｏｒ）对黑液废水的 ＣＯＤＣｒ和色度的去除率分别达到６４．２５％和４７．３１％， 在添加０．２％纤维二糖和０．０２％天冬酰胺的情况下应用自行分离、筛选的白腐真菌（ＡＨ２８－２）处理黑液废水时ＣＯＤＣｒ去除率也达到了６０％以上。该研究还发现，锰过氧化物酶（ＭｎＰ）和木质素过氧化物酶（ＬｉＰ）酶活相对比值对造纸黑液的ＣＯＤＣｒ去除率有明显影响，ＭｎＰ／ＬｉＰ酶活比值越高时ＣＯＤＣｒ去除率也越高，说明在该降解系统中ＭｎＰ起到主要作用［１］。 Ｍａｒｗａｈａ等分别采用黄麻绳、棉花和小麦作为黄孢 原毛平革菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ，简称ＰＣ菌，下同）生长、挂膜载体在厌氧条件下对造纸黑液进行预处理，结果表明，以黄麻绳为载体时废水的脱色率和ＣＯＤＣｒ去除率最高，相应的运行参数为温度４０℃、ｐＨ５．５、 菌丝体负荷３４０ｍｇ、外加葡萄糖浓度１％（ｍ／ｖ）、 停留时间７２ｈ。Ｊｏｙｃｅ等应用ＰＣ菌构建新型生物转盘（ＭｙＣｏＲ反应器，即真菌生物转盘反应器）来处理纸厂漂白废水。实验结果表明，这种生物转盘能够有效降低白水的ＣＯＤＣｒ和ＢＯＤ５并使氯化木质素脱氯。秦文娟等［２］将几种不同的白腐真菌菌丝悬浮液与海藻酸钠、氯化钙混合后凝固成球状，用于造纸Ｅ段氯漂废水的脱色处理，结果发现Ｐｏｌｙｓｔｉｃ－ ｔｕｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ和Ｐｈｌｅｂｉａｒａｄｉａｔｅ两种ＰＣ菌对废水的 脱色效果最好（２４ｈ内废水色度下降５０％左右）。王双飞等在８％ＰＶＡ、０．５％海藻酸钠、３％细胞浓度的条件下制备固定化ＰＣ菌间歇式处理造纸Ｅ段氯漂废水。实验结果表明，在连续运行１个月内，处理效果稳定，废水的脱色率保持５０％左右，ＴＯＣ去除率分别保持５０％～５８％，比游离态ＰＣ菌间歇式连续处理分别高出１７％和１２％。 １．２染料及印染废水处理 张朝晖等应用ＰＣ菌生物膜反应器进行酸性染 料卡布龙红和弱酸大红的降解实验。结果表明，在限碳培养条件下挂膜培养５ｄ后，木素过氧化物酶活力达到最高，此时分别加入酸性染料卡布龙红和弱酸大红，质量浓度分别为２５、５０、１００ｍｇ／Ｌ和１２．５、 ２５、５０ｍｇ／Ｌ，４８ｈ后培养液基本脱色，较高浓度下菌膜上有少量吸附的残余染料，５ｄ后染料质量降解 率分别为１００％、８８％、９２％和５８％、６５％、３８％［３］。 李慧第一作者简介：吴林林男１９８１年生华东师范大学环境科学系在读硕士主要从事水污染控制与生物修复研究 Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．１Ｊａｎ．２００６ 上海化工 ＳｈａｎｇｈａｉＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙ ８??
白腐菌
野生白腐菌分离与纯化的初步试验 前言 白腐真菌是一类使木材呈白色腐朽的真菌,能够分泌胞外氧化酶降解木质素,且降解木质素的能力优于降解纤维素的能力,这些酶可以促使木质腐烂成为淡色的海绵状团块——白腐,故称为白腐真菌 白腐菌: white rot fungi 定义: 属担子菌纲丝状真菌，因腐朽木材呈白色而得名。代表菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，在污染土壤修复中常有应用。 白腐菌是属于担子菌亚门的真菌,因腐朽木材呈白色而得名，是能够降解木材主要成分的微生物之一。木材在白腐过程中大部分纤维仍保持完整，且纤维素结晶度变化不大。由此设想利用对降解木质素选择性好的白腐菌进行生物制浆，能开辟制浆方法的新途径。白腐菌除了能降解木质素用于预理、生物漂白、生物制浆外，对其它有机异生物质也有很强的分解能力，因而在废水处理中也有广泛的应用前景。 为降低制浆能源消耗，可在制浆之前依靠白腐菌对木质素进行分解和改性，用选择过的微生物培养基对原料进行预处理。通过白腐菌对原料的预处理，可降低后阶段制浆能耗的50%，并且纤维强度性能也得到改进。 白腐菌预处理制浆不仅在木质材料制浆当中应用研究较多，在非木质制浆原料(如芦苇、蔗渣、剑麻、黄麻等)预处理制浆中的应用研究同样广泛。 可以看出，白腐菌预处理在硫酸盐法、碱法、机械法和烧碱-蒽醌法等制浆方法中都可以不同程度地降低制浆成本、提高纸张质量。但是菌种筛选困难和预处理周期较长是制约白腐菌应用的最大障碍，大规模应用于制浆预处理还需要相关方面技术的突破。 利用白腐菌可以降解木质素、半纤维素和纤维素的特性，白腐菌在制浆造纸各个环节的应用都得到了很广泛的研究，但是利用白腐菌直接制浆却鲜见报道。筛选对纤维素没有影响或影响较小的选择性极高的白腐菌种直接处理原料制浆是一个新的研究方向。20世纪90年代末，日本神户制钢所应用白腐菌在常温常压下分解木材成功制出优质纸浆。选定适宜温度，可以分解出80%的木质素，比一般化学制浆法成本降低了50%。这种白腐菌对木质素的脱除分解率极高，而对纸浆纤维中的纤维素分解极少，这样可使纸浆得率高达60%，超过化学法得浆率的50%。据此计算，木材的消耗量可节约1/9。此种制浆方法将是传统制浆方法的巨大挑战。同样，制浆周期长、白腐菌筛选困难是大规模生产的最大障碍。 在造纸工业中，为了使最终产品的白度既高又稳定，必须把浆中残余木质素所造成的棕黑色通过漂白来除去。用生物方法脱除浆中的残余木质素是现阶段人们研究最多的一种方法，普遍认为白腐菌是最有效的菌种。
真菌漆酶的研究进展及其应用前景_周雪婷
真菌漆酶的研究进展及其应用前景 周雪婷,张跃华＊ ,罗志文,潘亭如,缪天琳 (佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007) 摘 要:漆酶生产菌株多为白腐真菌,常用的漆酶活性测定方法有分光光度法、ABTS 法、微量热法等,其降解工业“三废”中的有毒有害物质被认为是一种效率较高,成本较低的且最有前途的方法,其对环境保护的研究以逐渐成为国内外研究的热点,本文阐述漆酶的性质、活性中心、结构特点以及其在环境治理方面的应用。关键词:漆酶;结构;活性中心;环境修复 中图分类号:X592 文献标识码:A 基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助(项目编号:12521573) ＊为本文通讯作者 漆酶最早由Yoshi 从日本紫胶漆树(Rhus vernicifera )漆液 中发现。19世纪末,G .Betranel 首次将能够使生漆固化的活性物质进行分离,命名为“Laccuse ”,即漆酶。漆酶属蓝色多铜氧化酶家族[1,2],与抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆中铜蛋白同源。人们将自然界中得到的漆酶分为漆树漆酶和真菌漆酶,其中真菌漆酶极具研究价值。漆酶在生物制浆、污水处理、防腐剂、杀虫剂等化工产品的降解效果显著,用于环境保护、环境监测等领域,在食品工业等方面也有应用[3],已逐渐成为自然科学的研究热点之一。漆酶催化氧化不同种类型的底物已达200余种,广泛用于食品、废水处理、造纸等领域。 国内外真菌漆酶研究主要是以担子菌、子囊菌、脉孢霉、柄孢壳菌和曲霉等真菌来研究漆酶的生物学活性,细菌和放线菌的研究较少,现已在细菌生脂固氮螺菌(Azospirillum lipofer -um )中发现了漆酶的存在。而高等担子菌中的研究对象包括白腐真菌、杂色云芝、平菇、变色栓菌,其中白腐真菌所产的漆酶为胞外酶,可作为主要的产酶者和研究对象。1 漆酶的性质1.1 理化性质 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,不同来源的漆酶铜含量也有所不同,多含有4个铜原子[4]。漆酶多为1条多肽链组成的单聚体,由500～550个氨基酸分子所组成,相对分子质量主要集中在50～80kD ,其碳水化合物约占15%～20%,等电点pI 为3～6,反应温度为30～60℃,pH 低的环境,漆酶的生物活性较高[5-7]。1.2 活性中心 漆酶催化中心根据其光谱性质,存在3种不同的功能:1.2.1 Ⅰ型铜 含铜的蓝色蛋白质,Ⅰ型铜与2个组氨酸和1个半胱氨酸配位,紫外可见光谱λ=600nm 时出现峰值,在EPR (电子顺磁共振)谱上有1个平行超精细耦合结构,Ⅰ型铜参与分子内的电子传递,将电子从底物传递到其它铜原子上。1.2.2 Ⅱ型铜 II 型铜与2个组氨酸和1个水分子配位,形成T 型几何结构,没有明显的可见吸收光谱,但有EPR (电子顺磁共振)信号。1.2.3 Ⅲ型铜 与漆酶的催化作用密切相关,经实验研究其为活性中心, 由2个铜原子通过1个-OH 桥配位连接起来组成四面扭曲的四方立体双核铜区结构,铜原子之间具有抗磁性,其距离是0.38n m 。在紫外可见光谱λ=330nm 处有最大吸收峰,在EPR 上无谱带[8～14];为了测定漆酶活性中心,将其经过抑制剂处理后,Ⅲ型铜在EPR 上出现有裂分峰,表明外源性配体与Ⅲ型铜发生了配位,1个Ⅱ型铜和2个Ⅲ型铜形成三核铜簇,双氧还原的反应位置在三核铜簇,此时Ⅲ型铜已结合5个配体,使其氧化性降低,限制了还原,同时也抑制O 进入三核中心区。 另有实验表明,将漆酶晶型结构被完全还原,Ⅰ和Ⅱ型铜的配位环境不变,Ⅲ型铜的-OH 桥配体则在反应中消耗,2个Ⅲ型铜之间距离亦增加[15]。1.3 检测方法 检测漆酶活性方法有分光光度法[16]、ABTS 法、微量热法、测O 2法、高效液相色谱法[17]、极谱法[18]等。AB TS 法测定漆酶,常用醋酸钠溶液作为缓冲溶液,反应体系内ABTS 的浓度为0.5mmol /L 。漆酶对不同种底物的亲和力也有显著地差异,但其对ABTS 的亲和力和催化能力普遍很高,测得的酶活性值也高,此方法反应条件不高,使用安全,常温下性质稳定,测定的OD 值相对稳定而准确[19]。微量热法测定漆酶的活性,利用LKB -2107Batch 型微量热系统,将其温度调至298K ,pH 调至7.4,此方法漆酶的提取物样品用量较少,可直接对酶的悬浮液进行测定,其对反应体系没有任何限制或干扰,适合研究酶促反应中的酶活。分光光度法测定漆酶酶活的基本原理是选定某种漆酶作用的底物,底物在漆酶催化作用下首先形成底物自由基,底物自由基浓度与吸光值成正相关,其在一定的光波波长下存在吸光系数的最大值,依据吸光值随时间变化的关系计算出酶活。分光光度法因其操作简单、快速、较准确、无需配备昂贵仪器设备等特点,得以在漆酶测定实验中广泛应用[20]。 2 漆酶的应用2.1 工业污水治理 真菌降解木质素目前主要集中于生物制浆方面。传统的氯法漂白,在去除纤维原料中木质素的过程中,仍有3%～12%的残留。在漂白废水中会产生大量有毒、有害物质,严重污染 农业与技术 第32卷 第9期 2012年9月 2 AG RIC ULTURE AND LTECHNOLOG Y