显微镜直接计数法
验——微生物细胞大小的测定和显微镜直接计数
录入时间:2011-4-13 9:35:15 来源：天津农学院精品课程
目的
1.1 学习接目测微计的校正方法，了解血球计数板的构造和计数原理
1.2 学习使用显微镜测微尺测定微生物细胞大小，掌握用血球计数板测定微生物细胞总数的方法。
2 原理
微生物细胞的大小是微生物分类鉴定的重要依据之一。微生物个体微小，必须借助于显微镜才能观察，要测量微生物细胞大小，也必须借助于特殊的测微计在显微镜下进行测量。
显微测微计由镜台测微计和目镜测微计两部分组成。后者可直接用于测量细胞大小。它是一块圆形玻片(图7—1)，其中央有精确等分到度，测量时将其放在接目镜中的隔板上。由于目镜测微计所测量的是微生物细胞经过显微镜放大之后所成像的大小，刻度实际代表的长度随使用的目镜和物镜放大倍数及镜筒的长度而改变，所以，使用前须先用镜台测微计进行标定，求出某一放大率下，目镜测微计每一小格所代表的长度，然后用目镜测微计直接测被测对象的大小。镜台测微计是一块中央有精确刻玻片(图7—1)，刻度的总长为lmm，等分为100小格，每小格长10um，专用于对目镜测微计进行标定的。
3 材料
3.1 器械
显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺，载玻片、盖玻片、血球计算板、擦镜纸、吸水纸、玻片架、肾形盘、洗瓶、接种环、酒精灯、火柴、滴管。
3.2 菌种
培养48h的啤酒酵母斜面菌体和菌悬液。
3.3 革兰氏染液
4流程
4.1 置目测微计→置台测微计→标定目测微计→测菌体大小→记录结果→用毕擦拭干净
4.2 检查计数板→稀释样品→加样→计数→计算→清洗
5 步骤
5.1 微生物菌体大小的测定
5.1.1 目镜测微尺的校正
5.1.1.1 更换目镜镜头
更换目镜测微尺镜头（标记为PF）；或者取下目镜上部或下部的透镜，在光圈的位置上安上目镜测微尺，刻度朝下，再装上透镜，制成一个目镜测微尺的镜头。
5.1.1.2 某一倍率下标定目镜刻度
将镜台测微尺置于载物台上，使刻度面朝上，先用低倍镜对准焦距、看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器使两尺重叠，并使二尺的左边的某一刻度相重合，向右寻找另外二尺相重合的刻度。记录两重叠刻度间的目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数(图7-1C)。5.1.1.3 计算该倍率下目镜刻度
目镜测微尺每格长度=镜台测微尺格数/目镜测微尺格数xl0um
5.1.1.4 标定并计算其他放大倍率下的目镜刻度
以同样方法分别在不同倍率的物镜下测定目镜测微尺每格代表的实际长度。如此测定后的测微尺的长度，仅适用于测定时使用的显微镜以及该目镜与物镜的放大倍率。
5.1.2 菌体大小的测定
5.1.2.1 将啤酒酵母制成水浸片。
5.1.2.2 大小换算
将标本先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺测定每个菌体长度和宽度所占的刻度，即可换算成菌体的长和宽。
5.1.2.3 求平均值
一般测量微生物细胞的大小，用同一放大倍数在同一标本上任意测定l0一20个菌体后，求出其平均值即可代表该菌的大小。
5.2 用血球计数板测定微生物细胞的数量
5.2.1 检查血球计数板
取血球计数板一块，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的菌体，若有污物则通过擦洗、冲洗，使其清洁。镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时才可使用。
5.2.2 稀释样品
将培养后的酵母培养液振荡振摇混匀，然后作一定倍数的稀释。稀释度选择以小方格中的分布的菌体清晰
可数为宜。一般以每小格内含4～5个菌体的稀释度为宜。
5.2.3 加样
取出一块干净盖玻片盖在计数板中央。用滴管取1滴菌稀释悬液注入盖玻片边缘，让菌液自行渗入，若菌液太多可用吸水纸吸去。静置5—10分钟。
5.2.4 镜检
待细胞不动后进行镜检计数。先用低倍镜找到计数室方格后，再用高倍镜测数。一般应取上下及中央五个中格的总菌数。计数时若遇到位于线上的菌体，一般只计数格上方（下方）及右方（左方）线上的菌体。每个样品重复3次。
5.2.5 计算
取以上计数的平均值，按下列公式计算出每毫升菌液中的含菌量。
菌体细胞数（cfu/mL）＝小格内平均菌体细胞数×400×104×稀释倍数
5.2.6 清洗
计数板用毕后先用95%的形酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。若计数的样品是病原微生物，则须先浸泡在5%石炭酸溶被中进行消毒，然后再行清洗。清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。
图7-2 血细胞计数板
6 结果
6.1计算出目镜测微尺在低、高倍镜下的刻度值。
6.2 记录菌体大小的测定结果。
6.3 计算样品中酵母菌浓度。
7 思考
7.1 为什么随着显微镜放大倍数的改变，目镜测微计每格相对的长度也会改变？能找出这种变化的规律吗？
7.2 根据测量结果，为什么同种酵母菌的菌体大小不完全相同？
7.3 能否用血球计数板在油镜下进行计数？为什么？
7.4 根据自己体会，说明血球计数板计数的误差主要来自那些方面？如何减少误差？
8 附录
目镜测数尺有两种：一是特制的目镜镜头，镜片上刻有50等分或100等分的刻度，使用时直接安装在显微
镜上，取代没有刻度的目镜镜头；另一种是一块直径大约17.5 mm的圆玻璃片，其中央刻有50等分或100
等分的刻度(图7-1A)，使用时将该玻璃片安装在原来的目镜镜头上即可。由于不同的显微镜放大倍数不同，
既使同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下其放大倍数也不同，故目镜测微尺每格实际表示的长度随显微
镜放大倍数不同而异。也就是说，目镜测微尺上的刻度只代表相对的长度。因此在使用前须用镜台测微尺
校正，以确定在一定放大倍数下目镜测微尺的每格长度。
血球计数板是一块特别的厚玻片，玻片中央分剖成两个平面，上面各刻有9区，中央一区为计数室，供计
数用(图7-2A)，此区的长和宽各为1mm。中央平面两侧有小沟，小沟外有两条突起的平台，平台比中央平
面高0.1mm，因此计数室体积为0.1mm3，容积为10-4ml。通常计数室分为25个大格，每大格又分为16个小
格，每小格容积为4×10-6ml，即lml菌液容积相当于400万个小格体积。因此只要将细胞悬液注人计算室，
计算出一定数量小格的平均菌数即可算出每毫升的细胞数。
显微镜直接计数法
基本原理
利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方
法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）
放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。
由于计数室的容积是一定的（ 0．1mm2），所以可以根据在显微镜下观察
到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是
活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。
血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。
中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，
每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就
在计数室中进行。血球计数板构造如图Ⅷ-1。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，
而每个中方格又分成25个小方格（图Ⅷ-2）；另一种是一个大方格分成
25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图Ⅷ-1，C）。但无论
是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即
16×25=400小方格，如图Ⅷ-2。
每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。
在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml 菌液中的总菌数。
下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数因1ml=1cm3=1000mm3，
（即0.1mm3中的细菌总数）=A*B*25/5
故1ml菌液中的总细菌数=A*25*10*1000*B/5
=50000A·B（个）
二、器材
酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。三、操作步骤
1．稀释
将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。
2．镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。
3．加样品
将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。
4．显微镜计数
静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到
计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。
5．清洗血球计数板
使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
四、实验报告
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实验三十一平板菌落计数法
录入时间:2009-1-6 9:54:00 来源：青岛海博生物
一、基本原理
平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是
由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。
这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。
二、器材
大肠杆菌悬液，牛肉膏蛋白胨培养基， 1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4． 5 ml无菌水的试管，试管架和记号笔等。
三、操作步骤
1．编号：
取无菌平皿 9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4．5ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2．稀释
用1ml无菌吸管精确地吸取0．5ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出时，管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸0．5ml放入10-2试管中，吸吹三次，……其余依次类推。整个稀释过程如图Ⅷ-3。
3．取样
用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0．2ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。
4．倒平板
于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37℃温室中培养。
5．计数
培养24小时后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：
每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数
×5
一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算每毫升的菌
数最为合适。同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊，如相差较大，表示试验不精确。
平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。
平板菌蓓计数法的操作除上述的以外，还可用涂布平板的方法进行。二者操作基本相同，所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃温室中烘烤30分钟左右，使其干燥，然后用无菌吸管吸取 0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养皿中的培养基上，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20—30分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37℃的温室中培养。
四、实验报告
环境因素对微生物的影响
录入时间:2009-1-6 15:05:15 来源：青岛海博生物
微生物的生命活动要求一定的外界环境条件，外界环境条件适宜时，微生物进行正常生长繁殖；不适宜时，则会使微生物生长受到抑制或发生变异，甚至死亡。
不同的环境因素对微生物的影响不同；同一因素因浓度或作用时间不同，对微生物的影响也不一样；有的因素对某些微生物来讲是必需的，而对另一些微生物又是有害的，如好氧微生物必须在有氧条件下才能生长繁殖，而厌氧微生物在有氧情况下将会受到抑制。在有害因素中，有的起抑制作用；有的表现为杀菌作用。
本实验通过化学、物理、生物和营养等环境因素对微生物影响的了解，以便为有益微生物创造适宜的生存条件，而对有害的微生物则设法控制或杀灭，使微生物能更好地为人类所利用。
生物基本知识->实验三十三化学因素对微生物的影响
实验三十三化学因素对微生物的影响
录入时间:2009-1-6 15:06:24 来源：青岛海博生物
一、基本原理
常用的化学消毒剂主要有重金属及其盐类，酚、醇、
醛等有机化合物以及碘、表面活性剂等。它们的杀菌或抑
菌作用主要是使菌体蛋白质变性，或者与酶的—SH基结合
而使酶失去活性所致。
本实验是观察某些常用的化学药品在一定浓度下对
微生物的致死或抑菌作用，从而了解它们的杀菌或抑菌性
能。
为了比较各种化学消毒剂的杀菌能力，常以石炭酸为
标准，即将某一消毒剂作不同稀释后，在一定条件下，一
定时间内致死全部供试微生物的最高稀释浓度，与达到同
样效果的石炭酸的最高稀释度的比值，称为这种消毒剂对
该种微生物的石炭酸系数（酚系数）。石炭酸系数越大，
说明该消毒剂杀菌能力越强。
二、器材
大肠杆菌，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）；
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2．5％碘酒，0．1％升汞
（HgCl2），5％石炭酸，75％酒精，1％来苏尔，0．25％
新洁尔灭， 0．005％龙胆紫，0．05％龙胆紫；
培养皿，滤纸片，试管，吸管等。
三、操作步骤
1．各种化学药品的杀菌作用
(1)用无菌吸管吸取培养18小时的白色葡萄球菌菌液
0．2ml于无菌平皿内。
(2)倒入已溶化并冷至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基于上述平皿内，充分摇匀，水平放置，待凝。
(3)将上述已凝固的平皿用记号笔在平皿底划成八等份，每一等份内标明一种药物的名称。
(4)用无菌镊子将小圆形滤纸片分别浸入各种药品中，取出，并在试管内壁上除去多余药液后，以无菌操作将纸片对号放入培养皿的小区内，如图Ⅸ-1。
(5)将上述放好滤纸片的含菌平皿，倒置于37℃温室中培养24小时后，取出测定抑菌圈大小，并说明其杀菌强弱。
2．石炭酸系数的测定
（1）将5％（1：20）的石炭酸液按表Ⅸ-1配成不同浓度，每管5ml。
（2）将待测药物（来苏尔）先配成1：20的原液，再按表Ⅸ-2配成不同浓度，每管 5ml。
（3）取肉膏蛋白胨液体培养基30管，1—15管标明石炭酸的5种浓度，每种浓度3管，每3管分5、10、15分钟处理，16—30管标明来苏尔的5种浓度，同样每种浓度3管，每3管分5、10、15分钟处理。
（4）在上述不同浓度的石炭酸和来苏尔溶液中，各接入0．5ml大肠杆菌液，摇匀。注意每管自接种时起在5、10、15分钟，用同一接种环从各管内取一环接入上述已标记的液体培养基试管中。
（5）置37℃温室中培养 48小时，观察并记录生长情况。生长者溶液混浊，以“+”表示；不生长者溶液澄清，以“-”表示。
（6）计算系数值找出在5分钟生长，而在10分钟
和15分钟均不生长的石炭酸及来苏尔的最大稀释度，计
算二者的比值。例如石炭酸在10分钟内杀死大肠杆菌的
最大稀释度是1：70，来苏尔是1：250，则来苏尔的石炭
酸系数为250/70=3．6。
四、实验报告
实验三十四氧对微生物的影响
录入时间:2009-1-6 15:07:49 来源：青岛海博生物
一、基本原理
各种菌对氧的要求是不同的，根据它们对氧的要求或所能耐受的量可
将细菌分为四个类型。专性好氧菌必须在有氧的情况下生存，例如枯草芽
孢杆菌；专性厌氧菌则要求在完全无氧的条件下生长繁殖，分子氧对它们
有害，例如破伤风梭菌（Clostridiumtetani）、丙酮丁醇梭菌
（C．acetobutylcum）等；兼性厌氧菌无论在有氧或无氧的情况下均能生
长，一般在有氧情况下生长快，例如酵母菌、肠道杆菌等属于兼性厌氧菌；
微好氧菌适宜于在氧浓度较低的环境中生长，例如链球菌属中的个别种。
本实验采用深层琼脂法来测定氧对细菌生长的影响，在葡萄糖牛肉膏
蛋白胨琼脂培养基试管中接入某种细菌，通过适宜的培养条件，若细菌只
生长在培养基表面，则为好氧菌；只生长在培养基底部，为厌氧菌；若表
面及全部培养基中都生长，为兼性厌氧菌；生长在培养基中上部，为微好
氧菌（图Ⅸ-2）。这样，根据细菌在试管培养基中生长的部位，就可以判
断各种细菌对氧的需要程度。
二、器材
大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，丙酮丁醇梭菌；
肉膏蛋白胨琼脂试管培养基4支。
三、操作步骤
1．将肉膏蛋白胨琼脂培养基试管置于水浴锅中加热溶化。
2．待培养基冷却至50℃左右时，按无菌操作分别用接种环接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌各一环于试管培养基中，另一支试管中不接种作对照。搓动试管，使细菌均匀混于培养基内。
3．待凝固后，置于28℃温室中培养48小时后开始观察，连续观察几天，直至结果清晰时为止。
四、实验报告
实验三十五温度对微生物的影响
录入时间:2009-1-6 15:08:31 来源：青岛海博生物
一、基本原理
温度是影响微生物生长与存活的重要因素之一。当微生物处于最适生长温度时，有刺激生长的作用；不适宜的温度可以导致细菌的形态和代谢的改变或使微生物的蛋白质凝固变性而导致死亡。不同的微生物对温度的抵抗力不同，如大肠杆菌在60℃10分钟内致死，而枯草芽孢杆菌在100℃6—17分钟内才能致死，这是因为芽孢不仅含水量低，有厚而致密的壁，而且还含有特殊的物质——吡啶二羧酸，所以芽孢杆菌的抗热能力比大肠杆菌强。
二、器材
大肠杆菌，枯草芽孢杆菌；
肉膏蛋白胨液体培养基试管16支，吸管，恒温水浴，温度计等。三、操作步骤
1．将培养48小时的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌斜面加入无菌生理盐水各5ml，用接种环刮下菌体，制成菌悬液。
2．取肉膏蛋白胨液体培养基试管16支，从1至16编号并注明各管所接菌种的名称和处理的温度及时间。
3．在单号1、3、5、7、9、11、13、15管中各接入大肠杆菌悬液0．2ml，
在双号2、4、6、8、10、12、14、16管中各接入枯草芽孢杆菌悬液0．2ml。
4．将已接种的1—8管同时放入50℃水浴中，10分钟后取出第1—4
管。再过10分钟（即处理20分钟）后取出第5—8管；同法将接过菌种
的第9—16管同时放入100℃水浴中，10分钟后取出第9—12管。再过
10分钟（即20分钟）后取出第13—16管。
5．上述各管取出后，立即用冷水冲凉，然后置37℃恒温室内培养24
小时后，观察生长情况。
四、实验报告
知识->实验三十六渗透压对微生物的影响
实验三十六渗透压对微生物的影响
录入时间:2009-1-6 15:09:12 来源：青岛海博生物
一、基本原理
若将细菌置于低渗液或水中，菌体因吸收水分膨胀甚至破裂；如果将菌体置
于高渗液中，则菌体内的水分就会渗出，结果发生质壁分离现象。不同的细菌对
渗透压的抵抗力不同。但不论哪种细菌，对渗透压的抵抗力是有一定限度的，超
过一定限度则使菌体生长受到抑制，只有在等渗溶液中，微生物才能正常生长、
繁殖，一般细菌在浓盐液或浓糖液中不能生长、繁殖，所以糖或盐可以保存食品。
二、器材
大肠杆菌，酿酒酵母；
含蔗糖量分别为2％、10％、20％、40％的合成培养基，含NaCl量分别为2％、
10％、20％、40％的肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌平皿等。
三、操作步骤
1．将不同含蔗糖量和不同含NaCl量的肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化，冷至
45℃左右，各倒平皿二个，待凝固。
2．在已凝固的平皿背面用记号笔划成两半，一半划线接种大肠杆菌，另一
半划线接种酿酒酵母。
3．于28℃温室中倒置培养4天后，观察其生长情况。
实验三十七 pH对微生物的影响
录入时间:2009-1-6 15:09:58 来源：青岛海博生物
一、基本原理
不同的微生物要求的最适pH值不同，一般来说，细菌和放线菌要求
中性或微碱性的pH值，而酵母和霉菌则在偏酸的环境中生长。当环境中
的pH值超过或低于其适于生长的pH值范围时，微生物的生长就会受到抑
制。了解这个特性后，就可以配制不同pH值的培养基来培养不同的微生
物，或选择性地分离某种微生物。
二、器材
枯草芽孢杆菌，细黄链霉菌（Streptomyces microflavus，5406放
线菌），酿酒酵母，黑曲霉（Aspergillus niger）。
盛有豆芽汁蔗糖培养液8ml的试管20支，
0．2mol/L K2 HPO4溶液，0．2mol/L H3 BO3 ，0．1mol/L柠檬
酸溶液，0．2mol/L NaOH溶液，1ml和2ml吸管若干支等。
三、操作步骤
1．按表Ⅸ-3配制不同pH值的培养基，每种pH值配4管。
2．将配好的培养基，进行间歇灭菌（100℃蒸三次，每次20分钟）。
3．取同一pH值的培养基4管，按无菌操作手续，分别接入枯草芽孢
杆菌、细黄链霉菌（5406放线菌）、酿酒酵母、黑曲霉。
4、置28℃温室培养3天后，取出观察结果，并与未接种的培养基对
照
实验三十八生物因素对微生物的影响
录入时间:2009-1-6 15:10:44 来源：青岛海博生物
一、基本原理
许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊的代谢产物，具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用，例如抗生素。不同抗生素的抗菌谱是不同的，某些抗生素只对少数细菌有抗菌作用，例如青霉素一般只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，多粘菌素只对革兰氏阴性菌有作用，这类抗生素称为窄谱抗生素；而另一些抗生素则对多种细菌有作用，例如四环素、土霉素对许多革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有作用，这类抗生素称为广谱抗生素。
如果将产生某种抗生素的菌划直线接种在豆芽汁葡萄糖琼脂培养基平板上，经培养后，就会长出一条菌带，并产生某种抗生素向菌带周围扩散。再与这条菌带相垂直划直线接种某些不同的试验菌，就会产生不同长度的抑菌带，如图Ⅸ-3。根据抑菌带的长短，即可判断该抗生素对不同微生物的影响。本实验说明产黄青霉产生的青霉素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果。
二、器材
产黄青霉（Peenicillium chrysogenum）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌；
豆芽汁葡萄糖琼脂培养基，无菌平皿，接种环等。
三、操作步骤
1．将豆芽汁葡萄糖琼脂培养基溶化后，冷至45℃左右倒平板，凝固待用。
2．用接种环挑取产黄青霉的孢子在平板上按图Ⅸ-3，1所示划一直线。
3．接种后，倒置于28℃温室中培养2—3天。
4．待上述平板形成菌苔后，再用接种环从产黄青霉菌的菌带边缘但
不要接触菌苔分别垂直向外划直线（图Ⅸ-3，2）接种大肠杆菌、金黄色
葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。
5．倒置于37℃温室培养24小时。
6．观察结果。
微生物的生理生化反应
录入时间:2009-1-6 15:11:11 来源：青岛海博生物
各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳
水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一
样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这
些都反映了它们是有不同的酶系统。
细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一、使自
然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相
作用和互相依赖的基础，例如，一种微生物能利用另一种微生物所分解的
产物。
另一方面，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类
方法来利用。
本部分是通过细菌对大分子物质的水解试验、糖发酵试验、鉴定肠道
菌的其他不同生化反应和微生物的代谢产物抗生素的测定等几个实验，来
证明不同的细菌其生化功能的多样性和微生物之间的互相作用
十大分子物质的水解试验
实验四十大分子物质的水解试验
录入时间:2009-1-6 15:12:47 来源：青岛海博生物
一、基本原理
细菌对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪
酶将大分子物质分解。胞外酶能分泌扩散到细胞外，将物质分解成小单位如糖、氨基酸、甘油与脂肪酸。这些小单位的物质能被细菌吸收和利用。水解过程可通过底物的变化来证明，如细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色；水解明胶可观察到明胶被液化；脂肪水解后产生脂肪酸改变培养基的pH，其中的中性红指示剂使培养基从淡红色变为深红色。
二、器材
金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，绿脓杆菌（Bacte-rium Pyocyaneum）斜面各一支；
油脂培养基，淀粉培养基，明胶培养基，无菌平皿，接种环和接种针，革兰氏染色用卢戈氏碘液（Lugols iodine solution）等。
1．油脂水解试验
(1)将溶化的油脂培养基冷至45℃左右时，充分振荡，使油脂均匀分布，用无菌操作倒入平皿中，待凝。
(2)将制成的平板用记号笔划成两半，一半接种金黄色葡萄球菌作为对照，另一半接种枯草芽孢杆菌作为试验菌，均用无菌操作画“+”接种，如图Ⅹ-1。
(3)将接种的平板倒置于37℃温室中培养24小时。
(4)取出平板，观察平板底层长菌的地方，如出现红色斑点，说明脂肪被水解，为阳性反应。
2．淀粉水解试验
(1)将淀粉培养基溶化后，冷至45℃左右，以无菌操作制成平板。
(2)用记号笔将平板划成两半，一半接种大肠杆菌作为试验菌，另一半接种枯草芽孢杆菌作为对照菌，均用无菌操作划线接种，如图Ⅹ-2。
(3)将上述已接种的平板倒置于37℃温室中培养24小时。
(4)将已培养24小时的平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于平板上，轻轻旋转平皿，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解。透明圈的大小、说明该菌水解淀粉能力的强弱。
3．明胶液化试验
(1)取三管明胶培养基，用记号笔标明各管接种的菌名。分别以无菌操作用接种针穿刺接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌。
(2)接种后，置20℃温室中培养2—5天。
(3)观察明胶培养基液化情况（图Ⅹ-3）。
四、实验报告
实验室常用贮存液的配制参数（上）
录入时间:2011-4-19 10:01:16 来源：互联网
1.30%丙烯酰胺溶液
【配制方法】将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene 滤器(0.45μm孔径)过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。
【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂(MB-1Mallinckrodt)，搅拌过夜，然后用Whatman 1号滤纸过滤以纯化之。在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。
2.40%丙烯酰胺
【配制方法】把380g丙烯酰胺(DNA测序级)和20g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。
【注意】见上述配制30%丙烯酰胺的说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。
3.放线菌素D溶液
【配制方法】把20mg放线菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀释贮存液，用100%乙醇作空白对照读取OD440值。放线菌素D(分子量为1255)纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21，900，故而1mg/ml的放线菌素D 溶液在440nm处的吸光值为0.182，放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于-20℃。
【注意】放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。
药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。
4.0.1mol/L腺苷三磷酸(ATP)溶液
【配制方法】在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH调至pH值至7.0，用蒸馏水定容1ml，分装成小份保存于-70℃
5.10mol/L乙酸酰溶液
【配制方法】把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。
6.10%过硫酸铵溶液
【配制方法】把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4℃保存数周。
7.BCIP溶液
【配制方法】把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(BCIP)溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃
8.2×BES缓冲盐溶液
【配制方法】用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸]、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4，室温下用HCl 调节该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml，用0.22μm 滤器过滤除菌，分装成小份，保存于-20℃。
9.1mol/L CaCl2溶液
【配制方法】在200ml蒸馏水中溶解54g CaCl2?6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20℃。
【注意】制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml，用Nalgene滤器(0.45μm孔径)过滤除菌，然后骤冷至0℃。
10.2.5mol/L CaCl2溶液
微生物的计数——血球计数板法
微生物得计数——血球计数板法 【摘要】测定微生物细胞数量得方法很多，有分光光度法、显微直接计数法与平板计数法。分光光度法比较简便，易操作，但就是会使数据严重偏大。而平板计数法则会使实验数据严重偏小.?显微计数法适用于各种含单细胞菌体得纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质，常不易分辨.菌体较大得酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(PetｒｏｆHausｓｅr)细菌计数板。两种计数板得原理与部件相同，只就是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。而血球计数板较厚,不能使用油镜，计数板下部得细菌不易瞧清.本实验采用血球计数板法，主要目得就是了解血球计数板法得构造与使用方法，学会用血球计数板对酵母菌细胞进行计数。 一、实验目得与要求 １、了解微生物计数常用得三种方法：分光光度法;平板计数法；血球计数板法。 2、了解血球计数板得构造与使用方法。 3、学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。 二、基本原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数，就是一种常用得微生物计数方法。此法得优点就是直观、快速.将经过适当稀释得菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间得计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室得容积就是一定得（０、1mｍ2），所以可以根据在显微镜下观察到得微生物数目来换算成单位体积内得微生物总数目。由于此法计得得就是活菌体与死菌体得总与，故又称为总菌计数法. 血球计数板,通常就是一块特制得载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间得平台又被一短横槽隔成两半，每一边得平台上各刻有一个方格网,每个方格网共分九个大方格,中间得大方格即为计数室，微生物得计数就在计数室中进行。 计数室得刻度一般有两种规格,一种就是一个大方格分成１６个中方格，而每个中方格又分成25个小方格;另一种就是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论就是哪种规格得计数板,每一个大方格中
常见的微生物检测方法
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
微生物大小的测定及微生物数量的直接计数法
微生物大小的测定及微生物数量的直接计数法摘要：本文使用了目镜测微尺和镜台测微尺来测量野生酵母的细胞大小，得到的结果是宽在5.78~11之间，长在8.25~20之间。然后用血细胞计数板对酵母菌进行计数，并绘制其生长曲线，有四个时期，分别是延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。 关键词：细胞大小血细胞计数板酵母菌生长曲线 前言 生产生活中利用微生物时，需要了解微生物的一些基本物理属性，如菌体的大小形状等。本实验利用显微测微尺对野生酵母进行测量，并用血球计数板对酵母菌进行其生长曲线的测定，了解去生长规律。通过此综合性实验加深对无菌操作的印象，并将其掌握。 1实验材料与仪器 1．1实验材料与试剂 麦芽汁培养基、生理盐水、果汁（自制）、活化的酵母菌、酒精 1．2实验仪器 锥形瓶、试管、接种环、移液枪、显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、血细胞计数板、吸水纸、酒精灯 2实验方法 2．1预准备 2.1.1培养基的制备 麦芽汁培养基（130.1g/L）200ml*4瓶 麦芽汁琼脂培养基（145.1g/L）5ml*2支试管150ml*1瓶 生理盐水9ml*20支 （制备后高压蒸汽灭菌121℃，20min） 2.1.2酵母分离纯化 平板划线分离：先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释, 微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少, 并逐步分散开
来。经培养后,可在平板表面形成分散的单 个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细 胞形成的，需再重复划线1-2次, 并结合显 微镜检测个体形态特征, 才可获得真正的 纯培养物。 斜面接种是从已生长好的菌种斜面上 挑取少量菌种移植至另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2-3cm的位置。点燃酒精灯。用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。 简述如下：1)手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。2)旋松管塞：先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。3)取接种环：右手拿接种环(如握钢笔一样)，在火焰上将环端灼烧灭菌。然后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。4)拔管塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。5)接种环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。6)取菌：待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使带菌接种环通过火焰。7)接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，切勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。8)塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。塞棉塞时不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。9)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。
微生物计数方法
微生物的显微直接计数法 一、实验目的 了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。 二、实验原理 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。 使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。 已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3 所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106。 因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d） 三、实验器材 1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。 2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。 四、实验方法 1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。 2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。 5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
微生物大小测定和显微镜直接计数
实验五微生物大小测定和显微镜直接计数 一、实验目的： 1、了解显微测微尺的结构； 2、掌握显微测微尺用于测量菌体的方法； 3、学习使用血细胞计数板计算酵母细胞数的原理和方法； 4、了解微生物活体染色的原理的技术的方法。 二、实验原理： 1、显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。用于校正目镜测微尺没小哥的长度.目镜测微尺其中央刻有50等分或100等分的小格.测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大镜下,目镜测微尺每小格所代表的实际长度,再以后作为测量微生物 细胞的长度.目镜测微尺每格长度/μm = 两条重合线间镜台测微尺的格数×10/两条重合线间目镜测微尺的格数 2、利用血球计数板直接在显微镜下计数微生物的细胞（或孢子）数目。优点：直观、快速、操作简便，其缺点为：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察 1ml菌液中的总菌数=（5个方格中的总菌数/5）×25×104×稀释倍数 本实验中暂规定：计上不计下，计左不计右，即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中 三、实验步骤： （一）微生物大小的测定： 1、放置目镜测微尺：取出目镜，旋开目透镜，目镜测微尺放在光阑上，旋上目镜，将目镜插入镜筒 2、将镜台测微尺放在井台上，调焦看清镜台测微尺的刻度 3、低倍镜下使镜台测微尺与目镜测微尺刻度平行，一段起止线重合，分别数出格数并求出目镜测微尺每小格的实际长度，同样的方法在高倍镜下重复进行 4、按公式计算目镜测微尺每格的长度 5、测量菌体的大小：取下镜台测微尺，制作酵母菌涂片，分别在低倍镜、高倍镜下测量10个菌体的长宽，求其平均值，用长（μm)*宽（μm）表示 （二）显微镜直接计数 1、制备酵母菌的稀释液，将菌液稀释10倍 2、将计数板的盖玻片放在计数室上面的两边平台架上，混匀后酵母菌悬液吸取滴加在盖玻片与计数板的边缘缝隙处，待菌液渗入计数室，菌体自然沉降与稳定后计数 3、在计数室移至视野中央，选取25中格（4觉与中央）计含菌数，重复计数2-4个计数室内的含菌量，求其平均值。 四、材料和器皿： 酵母菌液，显微镜，镜台测微尺，目镜测微尺，擦镜纸，二甲苯，血细胞计数板，配套的计数板厚盖玻片，试管，移液管，吸水纸。 五、实验结果：
显微镜直接计数法
实验九显微镜直接计数法 实验目的 1．明确血细胞计数板计数的原理。 2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 实验内容 1．酵母菌细胞数的测定。 2．酵母菌出芽率的测定。 实验原理 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。 图9-1 血球计数板构造（一）图9-2血球计数板构造（二） 1 血细胞计数板；2盖玻片；3计数室 用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短槽隔成两半，每一边的平台上各自刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如下图。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。 计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均数，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。 实验器材
酿酒酵母 血细胞计数平板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管等。 实验步骤 一、酵母菌细胞数的测定 1．菌悬液制备：以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。 2．镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。 3．加样品：将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。 4．显微镜计数：加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。 若计数区是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格（即100小格）的菌数； 如果是25个中方格组成的计数区，除数上述四个中方格外，还需数中央l个中方格的菌数（即80个小格）； 如菌体位于中方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差； 如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。 计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。 16×25型血细胞计数板的计算公式： 25×16型血细胞计数板的计算公式： 5．清洗血细胞计数板：使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。 二、酵母菌出芽率的测定 1．方法步骤基本同上：观察酵母菌出芽率并计数时，如遇到菌体大小超过细胞本身50％时，不作芽体计数而作酵母细胞计数。 2．计算 实验结果及讨论 1．实验结果 (1) 酵母菌细胞数的测定
土壤微生物计数法
土壤微生物计数法 土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。 1.1培养计数法 1.1.1概要 在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。 稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。 最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。 1.1.2稀释平板法 一、试剂配制
常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。凝固后的培养基可加热溶解后使用。 二、仪器设备 广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。 三、操作步骤 （1）土壤系列稀释液制备 取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。迅速用灭菌的移液管吸取10-1土壤稀释液10ml，放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中，塞上橡皮塞，混合均匀，此为10-2土壤稀释液。再如此依次配制10-3、10-4、10-5和10-6系列土壤稀释液。上述操作均在无菌条件下进行，以避免污染。 （2）平板制备和培养 从两个稀释倍数的土壤稀释液中（细菌和放线菌通常用10-5和10-6土壤稀释液，真菌用10-2和10-3稀释液）吸取1.00ml（吸前摇匀），分别放入五套培养皿中（注意每变换一次浓度，须更换一支移液管）；再向培养皿内注入45～50℃的培养基10ml，立即混合均匀，静置凝固后，倒置放于培养箱中培养。细菌和放线菌在28℃下培养7～10d，真菌在25℃下培养3～5d。 （3）镜检计数
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
湖南湘大兽药有限公司工作标准文件 一、目的：为规定非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的检测方法和操作要求，特制定本操作规程。 二、引用标准：中华人民共和国兽药典（2015年版一部附录P179）。 三、适用范围：适用于本公司检品采用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的质量检测。 四、责任者：理化分析员对本标准的实施负责。 五、正文： 1简述： 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 2.计数方法 计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，
MPN 法可能是更适合的方法。 供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。 3.计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。 表 1 试验菌液的制备和使用
微生物直接计数法及测微技术
微生物直接计数法及测微技术 实验类型：基础 学时：4(参考) 内容： 一、实验目的 1.了解血球计数板计数原理，并掌握计数方法。 2.掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 二、实验原理 显微镜直接计数法是将一定稀释的菌体或孢子悬液注入血球计数板的计数室中，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。因为计数板是一块特别的载玻片。其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(见图2—3—44)；另一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格，无论哪种每个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。计数时，通常只用5个中格内的菌体(孢子)数即可。然后求出每个中方格的平均值，再乘上25或16，得出一个大方格中的总茵数，再换算成lml菌液中的总菌数。若设5个中方格中总菌数为N，菌液稀释倍数为M，如果是25个中方格计数板，则计算方法为： lml菌液中的总菌数=平均每个中格中菌的个数×25×104×M=50000N·M(个) 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长0．01mm(即10pm)。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。 三、试剂与器材 1.材料酿酒酵母、藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片、酿酒酵母24h马铃薯斜面培养物。 2.实验器材细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、显微镜等。 四、实验内容 1.微生物直接计数法 菌悬液制备→镜检计数室→加样品→显微镜计数→清洗血细胞计数板 2.微生物测微技术 装目镜测微尺→校正→菌体大小测定 五、关键步骤及注意事项 1.防止加样空气泡产生。 2.调节显微镜光线的强弱适当。 六、思考题 1.根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差、力求准确? 2.某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。 3.为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正?
显微镜直接计数法
血球计数板计数法 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（㎜3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。 血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。 计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，共400小格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，总共也是400小格。所以无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的。 每一个大方格边长为1㎜，则每一大方格的面积为1㎜2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为㎜，所以计数室的容积为㎜3。其计算方法如下： 1．16×25的计数板计算公式 细胞数/ml=(100小格内的细胞数/100)×400×1000×稀释倍数 2．25×16的计数板计算公式 细胞数/ml=(80小格内的细胞数/80)×400×1000×稀释倍数 器材酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管等。 操作步骤 1．稀释：将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。 2．镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。 3．加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。静置5—10分钟即可计数。 4．显微镜计数：将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。若选用25×16规格的计数板则每个计数室选5个中方格，可选4个角和中央的中格（即80个小格），若选用16×25规格的计数板，则数四个角：左上、右上、左下、右下的四个中方格，（即100小格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。 5．清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其化沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。 实验报告 将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。
实验四 微生物平板菌落计数法
实验四微生物平板菌落计数法 一、实验目的 学习并掌握平板菌落计数的基本原理和方法。 二、实验原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低，为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。 三、实验器材 1 ．菌种：酵母菌。 2 ．培养基：YEB培养基。 3 ．仪器或其他用具： 1ml 无菌吸管，无菌平皿，盛有 4.5ml 无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。 四、实验步骤 1 ．编号 取无菌平皿 9 套，分别用记号笔标明 10-4、 10-5、 10-6（稀释度）各 2 套，另取 6 支盛有 4.5ml 无菌水的试管，依次标是 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6。 2 ．稀释 用 1ml 无菌吸管吸取 1ml 已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放0.5ml 至 10-1的试管中，此即为 10 倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。
微生物大小的测定及显微镜直接计数法
微生物学实验报告 题目：微生物大小的测定及显微镜直接计数法 姓名：学号：年级班级：组别： 同组者：时间： 【目的要求】 1．学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。 2．了解血球计数板的构造、明确其计数原理。 3．学习并掌握使用血球计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。 【基本原理】 l．测微尺的构造：显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在5mm 刻尺上分50 份。目镜测微尺每格实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。 镜台测微尺为一专用的载玻片，中央有精确等分线将长为1mm 的直线等分成100 个小格，每格长10μm，专用于校正目镜测微尺。 2.球菌用直径表示大小；杆菌用宽和长来表示 图一：测微尺的校正 3．显微直接计数法：将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或Hawksley计数板。三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。计数区由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则：
实验七 微生物数量的测定――――显微镜直接计数法
实验七微生物数量的测定――――显微镜直接计数法 一目的要求 了解血球计数板的结构，学习并掌握血球计数板计数微生物数量的技术，包括样品的点样、菌数计数的方法与计算； 二实验原理 镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(图Ⅳ-2)。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图5)。 每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。 图Ⅳ-2 血球计数板的构造 a.平面图(中间平台分为两半，各刻有一个方格网)
b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙) 图Ⅳ-3 血球计数板计数网的分区和分格 三实验材料 1、菌种：酿酒酵母； 2、血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管； 3、菌种：大肠杆菌菌悬液。 4、1ml无菌吸管，无菌平皿，无菌水，试管，恒温培养箱牛肉膏蛋白胨培养基。四实验内容与步骤 1．菌悬液制备以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当地菌悬液。 2．镜检计数室在加样前，先对计数板地计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能细菌计数。 3．加样品 取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。也可以将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)。 4．显微镜计数 加样后静置约5分钟，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。 计数时用16中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格(即100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板。除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数(即80小格)。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。 凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数2-3次(每次数值不应招差过大，否则应重新操作)，取其平均值，按下述公式计算出每毫升菌液所含酵母菌细胞数。 每毫升菌液含菌数＝每小格酵母细胞数×4000×1000×稀释倍数 5．清洗血细胞计数 血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干。 五实验报告
微生物计数方法
1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他 稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制 成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。 另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。 2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。 操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。 3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。 4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。 在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免 吸管外部粘附的检液溶于其内。 为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。 5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1%蛋白 胨水），后者对食品中已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。 倾注培养 1．操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。 将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养 琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。 2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝 因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。
死活细胞的鉴定和显微镜直接计数
死活细胞的鉴定和显微镜直接计数 学院：生命科学专业：生物科学年级：2010级姓名：王亚军 指导老师：张琪白璐陈勇 摘要：酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。其细胞的大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。通过美蓝染液水浸片和水—碘液水浸片可在显微镜下观察到啤酒酵母的形态和出芽生殖方式。用美蓝对啤酒酵母的活细胞进行染色，可对啤酒酵母的死细胞和活细胞进行鉴别。 测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法等。显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载片上，在显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。 关键词：啤酒酵母菌美蓝染料血细胞计数板 引言：酵母菌的繁殖方式包括无性繁殖和有性繁殖。无性繁殖方式包括芽殖和裂殖。芽殖是酵母菌最普遍的繁殖方式。其过程是：成熟的母细胞在其形成芽体的部位长出芽细胞，芽细胞脱离母体，成为新的个体细胞。如果不脱离母细胞，又长出新芽，子细胞就和母细胞连接在一起，形成藕节状或竹节状的细胞串，称为假菌丝或真菌丝。少数酵母以裂殖方式进行繁殖，当母细胞长到一定大小时，细胞核开始分裂，之后，在细胞中间产生一隔膜，将细胞一分为二。还有些酵母菌可形成一些无性孢子如节孢子、掷孢子、厚垣孢子等。有性繁殖则是通过形成子囊和子囊孢子。 常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母菌、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。其中用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。 实验内容： 实验原理： 美兰是一种无毒性染液，有两种形态还原型：无色氧化型：蓝色。活细胞因新陈代谢而有强还原力，使美兰从氧化型变为还原型；死细胞无此能力，而被美兰染成蓝色。以此可以区分死活细胞。 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽构成3个平台.中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数区的刻度有两种：一种是25×16：计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是16×25：一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。技术时，通常数五个中方个的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘以25或16，就得出一个大方格中德总菌数，再换算成一毫升菌液中的总菌数。 实验材料 1.菌种：啤酒酵母 2.染色液：0.1%吕氏碱性美蓝 3.器材：载玻片，显微镜、血球计数板、盖玻片、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。 三、实验步骤 （一）酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定 1、在载玻片上各滴加一滴染色液和酵母菌培养液，盖上盖玻片，（勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片）
微生物检测菌落总数测定方法(精)
微生物学检验菌落总数的测定 1 原理 微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。它是通过将样品制成均匀的一系列 不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL ）样品中的活菌数量。 2 材料和仪器 2.1 平皿：φ90mm 。 2.2 无菌锥形瓶：容量250mL ，500 mL 。 2.3 无菌吸管：1mL （具0.01mL 个度）,10mL （具0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.4 灭菌锅。 2.5 恒温培养箱 2.6 涂棒。 2.7 酒精灯。 2.8 超净工作台。 2.9 磁力搅拌器。 2.10 漩涡振荡器 3 检验程序 菌落总数的检验程序见下图。 方法①↙ ↘方法② ↘ ↙
4 操作步骤 4.1 培养基和试剂的配制 4.1.1 平板计数琼脂培养基：LB培养基（最常用） 牛肉膏5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂20g 蒸馏水1L pH 7.0～7.2 将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。 4.1.2 无菌生理盐水的配制： 称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。 4.2 样品的稀释： 4.2.1 固体样品：称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装 数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。 4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀 释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。 4.2.3按照4.2.2操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL 无菌吸管或吸头。 4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。 4.2 平板接种与培养 接种方法1： 用1mL无菌吸管或微量移液器分别吸取不同稀释度的菌悬液1mL于一个无菌培养皿中（每个稀释度做三个重复），再在培养皿中分别倒入10～15mL已融化并冷却至45~50℃的培养基，盖好平皿盖子，趁热轻轻转动培养皿，使菌液与培养基充分混合均匀，冷凝后在恒温培养箱中倒置培养24～２８ｈ，培养温度为36℃±1℃。同时以无菌水作空白对照。 注：比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为：10-8，10-9，10-10。 接种方法2： 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取0.2ｍＬ稀释液均液于计数培养基平板上，将稀释液涂布均匀，吸附，在恒温培养箱中倒置培养24～２８ｈ，培养温度为36℃±1℃。同时以无菌水作空白对照。（计算时需要把0.2mL的倍数也计算在稀释倍数内） 注：比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为：10-7，10-8，10-9。 ４.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时借用放大镜或菌落计数器，以防遗漏。记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units,CFU）表示 4.3.1 选取菌落数在30~300之间，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用3个平行平板的平均数。