芽孢杆菌筛选分离
实验方法：
样品：外购菌种 商品微生物制剂（固体或液体） 土壤水体或枯枝烂叶，腐烂稻草（记录取样位置 PH 植被情况等）。
培养基：蛋白胨10g/L 牛肉膏3-5g/L NaCl5g/L PH7.2
富集培养：
取5g底泥或肠道内溶物0.5g，加入45（50）mL无菌水/250mL三角瓶（带玻珠）中，振荡15-20min，取5mL菌悬液或5mL水样加入45mL促芽培养基/250mL三角瓶中，75℃-80℃水浴15-20min，降至35℃-37℃ 150-200r/min振荡24h，染色镜检，连续两至三次培养备用。或取1g底泥（土）置于20mL肉汤培养基/250mL三角瓶，八层纱布封口，75℃-80℃水浴处理15-20min，然后150-200r/min振荡24h。镜检形成芽孢情况，挑取具有芽孢的菌落进行划线纯化培养，获得单菌落。
分离纯化：
取富集菌液置于75℃-80℃水浴15-20min，梯度稀释10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，选择三个合适的梯度混菌或涂布于营养琼脂麦芽汁培养基或直接涂布于酪素培养基上初筛，也可划线分离（划线法先将平板置于30℃（24-48 h）或37℃（18-24h），无菌检查，表面冷凝水干燥）。每个梯度二个平皿，将平板倒置，于35℃-37℃ 24-48h。对长出的单菌落进行编号，选择生长快、菌落大，表面干燥，粗糙，不透明的菌落转接于斜面备。挑取少许菌苔涂片，做芽胞染色判断是否为芽孢杆菌。
蛋白酶产生菌株筛选：
操作程序：样品溶解稀释—热处理（75-80℃）--梯度稀释—平板涂布培养—单菌落编号（转接斜面）--镜检（涂片芽孢染色）--初筛（点接酪素平板）—复筛（接产酶培养基培养，离心取清液蛋白酶活力测定）--转接斜面保藏。一般选择菌株表面干燥 粗糙 不透明，作为目标菌。以判定为芽胞杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔做成菌悬液，划线于或适当稀释涂布于酪素平板，35℃-37℃ 24-48h，菌落周围出现透明圈，挑取C/H大菌，转接于斜面或进行复筛。产蛋白酶发酵培养基35℃-37℃ 振荡培养24-48h，发酵过滤或离心，取清液检测蛋白酶活力进行复筛。自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶的活力有很大差异，有的活力大于4000U/ml。C/H大菌落，其蛋白酶不一定大，因此，对初筛C/H大菌落进行发酵培养，取发酵液进行酶活测定进行复筛。
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
配制具体步骤
1．称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于
一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。
2．溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。
3．调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。 对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。
4．过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。
5．分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装装置见图Ⅴ-1。 分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。 (1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。 (2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，如图Ⅴ-2。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 (3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
6．加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）。
7．包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
8．灭菌
将上述培养基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
9．搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
10．无菌检查
将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。
革兰氏染色
鉴定原理
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁
结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。
实验流程
1、 取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2、 涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
3、 晾干：让涂片在空气中自然干燥。
4、 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
5、 染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
6、 水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。
7、 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。
8、 脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。
9、 复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。
可能误差
在实验中经常会出现假阳性和假阴性的结果，假阳性主要是由于脱色不完全，可能是由于涂片过厚，或者是结晶紫染色过度，导致脱色不完全。假阴性可能是因为细胞固定过度，造成细胞壁通透性的改变，而出现假阴性结果；另外，细胞培养时间太长，可能已经有部分细胞发生死亡或者自溶，也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果。
革兰氏（Gram's）染液
用此液染色因先用甲液染色，再加乙液固定，用丙液处理，最后用丁液复染。
四种液体的配方如下：
甲液（结晶紫液）
（1）结晶紫 2克 95%酒精 20毫升
（2）草酸铵 0.8克 蒸馏水 80毫升 使用（1）、（2）液相混，静置48小时后使用。
乙液(碘液)
碘 1克 碘化钾 2克 蒸馏水 300毫升
将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘，待碘全部溶解后，加水稀释至300毫升。
丙液 95%酒精溶液
丁液（番红花红液）2.5%番红酒精溶液 10毫升 蒸馏水 100毫升
芽孢染液 用此配方染色
是用甲液染色后，用乙液复染。
甲液 取5克孔雀绿，加入少量蒸馏水，使它溶解后，用蒸馏水稀释到100毫升，即成孔雀绿染液。
乙液 取番红花红0.5克，加入少量蒸馏水，使它溶解后，用蒸馏水稀释到100毫升，集成番红花红复染液。
平板划线法
平板划线法平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表点击此处添加图片说明面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
实验步骤
划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线,第一区(A区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区)是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落,平板上四区面积的分配应是D＞C＞B＞A。
编辑本段步骤
用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到纯化分离微生物的一种方法。是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。用于目的微生物的分离。
实验步骤
1．融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。 2．倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15m1)，平置，待凝固。 倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 3．作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120℃左右（平板转动一定角度约60℃），以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。 4．划线操作 (1) 挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。 (2) 划A区：将平板倒置于煤气（酒精）灯
旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。 (3) 划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。 5．恒温培养：将划线平板倒置，于37℃（或28℃）培养，24hr后观察。