饲料中黄曲霉毒素B1的毒害机理及其解毒措施

2004-4-15 （动物分子营养教育部重点实验室；浙江大学饲料科学研究所；杭州，310029）

摘要

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉产毒株产生的结构类似的一组毒枝菌素，在自然界广泛分布。AFB1是所有已知黄曲霉毒素中毒性最强的，其毒效相当于 KCN的10倍，砒霜的68倍；在毒理方面，AFB1能够致癌、致畸、致突变。迄今为止，国内外已经进行了大量关于黄曲霉毒素的研究工作，本文就目前已知的黄曲霉毒素的毒害机理及当前能够采取的解毒措施进行了综述。

关键词 AFB1 机理吸附纳米材料

前言

饲料中的霉菌毒素污染问题早上个世纪60年代已引起各个国家和地区的普遍重视。据FAO 统计，全球每年由于霉菌及其毒素污染饲料、粮食及食品所造成的损失高达数亿美元。

黄曲霉毒素是众多真菌毒素中的一种，主要是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌的产毒株产生的结构相似的一组毒素，饲料中常见的黄曲霉毒素有AFB1、AFB2、 AFG1、AFG2和主要出现在乳中的AFM1，其中AFB1毒性最强，危害最大，其次是AFM1，表1是B1、B2、G1、G2、M1的化学结构，表2 是B1、B2、G1、G2分子的大小。

1 AFB1的毒害机理

1.1抑制核酸的生物合成

最先发现的AFB1对组织和细胞的影响，其中一个就是抑制DNA的合成。在肝脏中，毒素的聚集会引起DNA合成的抑制，但却明显不影响RNA或蛋白质的合成，表明干扰DNA合成是一个初步的生化反应结果。AFB1阻止的是DNA复制的起始阶段，而不是延伸阶段。AFB1与DNA或蛋白质的共价结合可能会引起抑制的产生，导致DNA模板活性改变或DNA合成过程中的某些酶的失活。AFB1与膜蛋白的共价结合也可能会使胸腺嘧啶脱氧核苷和其它DNA合成所必须的核苷前体物的吸收下降。

AFB1能够迅速抑制大鼠肝脏RNA的合成，尤其是抑制与rRNA（18S和28S）或rRNA前体物（32S和45S）的形成有关的核仁RNA的合成。这种抑制从根本上是由于DNA模板活性的降低和RNA聚合酶II（在很大程度上负责mRNA的合成）的抑制以及核苷转运缺陷所引起的。另一方面来说， RNA聚合酶I的活性在很大程度上不受AFB1的影响。Yu发现，当AFB1在体内或体外激活后会优先结合大鼠肝细胞核染色质的生理活性区，这或许可以解释测定到的RNA合成的下降。在此之前，Yu还报道，AFB1可能阻断RNA链的延长。此外，染色体蛋白在AFB1与DNA结合的过程中起着一定作用，因为该蛋白的清除会引起上述特异结合的大量减少。然而，与此相反的是Ch’ih

等发现一些胞质蛋白（如白蛋白，丙酮酸激酶）能够比组蛋白更有效地结合AFB1。AFB1破坏负责把核仁RNA前体物加工成rRNA的细胞核RNA的后转录过程，阻断大鼠肝脏中45S

RNA的分裂（形成18S和28SrRNA）。转运RNA的加工也以类似的方式被阻断，导致tRNA的5S前体物细胞质水平的升高。在AFB1处理过的动物细胞中最显著的一些结果就是细胞核和核仁形态的改变。

1.2抑制蛋白质的生物合成

AFB1抑制蛋白质合成的直接原因可能是由于蛋白质生物合成酶的失活，间接原因可能是由于DNA模板活性的改变，或RNA合成、成熟、翻译受到抑制，或氨基酸转运被阻断。

在超微结构方面，已经有报道说在AFB1处理过的细胞中，核糖体在不断地从内质网上脱落下来。一些破坏性的改变都可能会导致从内质网上脱落下来的核糖体越来越多，这些改变包括对内质网膜的直接损伤，干扰内质网膜上核糖体的结合位点，干扰核糖体循环，抑制新合成的蛋白质的释放，抑制mRNA的合成等。核糖体从内质网上分离下来的结果是内质网媒介的蛋白质合成很可能被破坏。AFB1通过抑制核糖体与内质网的结合，从而抑制蛋白质的合成。

1.3干扰糖类和脂类代谢

有些动物种类在摄入AFB1后，会出现肝糖水平下降和血糖水平上升的情况。原因可能是肝糖酶的抑制（如肝糖合成酶），肝糖元生成的抑制，葡萄糖转运进入肝细胞的减少，糖元前体物代谢酶类活性的提高（如G-6-P脱氢酶）。

已知AFB1能够引起肝脏中脂类的聚集，一般认为这是由于脂类运输被破坏（而不是脂类合成增加）所导致的。Chou和Marth报道，在给貂注射AFB1 后，发现肝脏脂类水平上升，而酯酸盐类的吸收并没有变化。他们据此认为，貂肝脏脂类水平的上升是由于脂肪氧化减弱或脂类合成提高所致。在这一点上，线粒体的损伤（在被AFB1处理过的细胞中经常会观察到）可能会导致这些细胞器的氧化性能降低，伴随着肝脏脂类的积累。

日常水平AFB1引起的脂类运输或合成的变化不会影响生长率或RNA的合成。对小鸡来说，AFB1不仅影响脂类合成与运输，而且影响脂类的吸收和降解。因此，对甘油三酯运输的破坏是一种初级损害，而不是由于核酸代谢被破坏以后导致的次级损害。AFB1能够刺激神经节后副交感神经末梢中乙酰胆碱的释放，间接地通过类胆碱功能系统来引起几尼猪回肠的收缩，这个可以用来说明AFB1在人和动物胃肠道中引起的急性反应。

1.4抑制正常的免疫反应

目前已经有很多综述性文章报道AFB1对试验动物的免疫反应造成损害。总的来说，AFB1对蛋白质合成的抑制会引起血清蛋白浓度的变化，导致非特异性的体液物质的的抑制。亚急性剂量的AFB1致使几内亚猪补体缺乏，火鸡体内干扰素产生延迟，淋巴因子的激活延迟。更高剂量的AFB1会降低小鸡体内免疫球蛋白 G和A的水平，导致获得性免疫失常。

Pier等报道，AFB1会降低接种疫苗后获得性免疫的功效，在体外AFB1对B-淋巴细胞的作用会导致淋巴基因应答的抑制。18日龄鸡的胚胎经AFB1 作用后引起T淋巴细胞（2倍）和B淋巴细胞（6～8倍）的姐妹染色单体交换呈剂量相关的增加。低剂量的AFB1也会呈剂量相关地引起人淋巴细胞有丝分裂的失常。

AFB1通过影响细胞媒介免疫反应，在火鸡和小鸡上引起T-淋巴细胞对植物血凝素响应的抑制，胸腺萎缩和施用疫苗后的免疫失败。试验中还发现，AFB1能够减少抗体的产生，降低巨噬细胞的噬菌能力，减少补体，降低T细胞的数量和功能并引起胸腺先天性萎缩。

AFB1对体外的腹膜巨噬细胞作用会导致剂量相关细胞损伤的增加和巨噬细胞黏附能力的降低，还有巨噬细胞中NO产量的降低。巨噬细胞负责机体对肿瘤和微生物的非特异性免疫，同时释放具有细胞毒性的化合物，包括NO。AFB1能够影响信号分子的功能，如鸟嘌呤核苷结合蛋白(G蛋白)、蛋白激酶C（PKC）和钙离子(Ca2+)。经AFB1预处理过的巨噬细胞在受到脂多糖刺激后，其PKC活性和酪氨酸磷酸化活性显著降低。这个可能是由于AFB1抑制了巨噬细胞中负责NO产生的蛋白质磷酸化(由蛋白激酶介导的巨噬细胞内的信号转导)，从而使NO的生物合成减少。AFB1对免疫系统的影响，使得家畜很容易感染疾病，导致生产性能的降低，或因并发症而死亡。

1.5降低激素作用的生物学效率

生长激素或类固醇激素都能够特异性地通过细胞膜受体蛋白与靶细胞膜非共价结合来调节细胞功能。激素与相应受体结合后，激素-受体复合物被转运进入细胞核并通过与染色质上的受体位点结合来诱导特定基因的转录（mRNA）。AFB1能够与DNA共价结合（尤其是与鸟嘌呤结合），从而减少激素受体复合物在核内的受体位点，进而降低激素活性。已知AFB1能够减少大鼠肝脏中肾上腺糖皮质激素与其胞液受体复合物在核内的受体位点，但不影响激素与其受体的结合。

1.6抑制ATP产生

在急性AFB1的暴露水平下，主要的代谢影响就是抑制细胞能量的产生。AFB1能够抑制组织匀浆中氧的吸收，抑制大鼠肝脏线粒体电子传递链上细胞色素b与 c或c1之间的电子传递过程。AFB1还影响细胞色素氧化酶的水平。AFB1对肝脏线粒体的这些生化影响并不需要转化为其有代谢活性的环氧化物。还有学者报道，大鼠肝脏线粒体单氧酶系统中的细胞色素P450的存在会产生具有亲电活性的代谢物，来共价修饰线粒体DNA、RNA和蛋白质。

解偶联氧化磷酸化会导致细胞内ATP的耗竭，从而影响细胞内钠和钾的梯度。AFB1作为一种解偶联剂，能够有效地抑制电子传递和ATP酶的活性。

1.7 致突变、致畸、致癌作用

AFB1（确切地说是其环氧化物）是黄曲霉毒素中致突变力最强的一种，而且AFB1的致突变能力与其致癌力密切相关。AFB1能够在动植物细胞中引起染色体失常（染色体断裂，染色单体桥接和破损）和DNA破损。

AFB1还有致畸作用，它是蛋白质合成的有效抑制物，能够影响原始细胞的发育和胎儿的分化。

正常细胞向肿瘤细胞的转化分为两个阶段：起始阶段和促进阶段。致癌化学物质可以被划分为诱发剂、促进剂或两者兼有三类，AFB1就属于两者兼有的类型。在起始阶段，RNA，尤其是DNA上的生化损伤会随着细胞的分裂过程变成细胞的固有特征；从而，正在分裂的细胞发生突变的可能性也就较静止状态的细胞骤然增加，因为在DNA复制过程中，AFB1-DNA（或RNA）加合物被转化为突变体，而供DNA修复错误的时间却不够充分。发生以上改变的细胞就开始具有潜在的致癌性，但还必须在适宜的条件下经过促进阶段才会最终使发生突变的细胞转化为癌细胞，一种能够独立于正常的细胞调节机制而无限制地增生扩散的细胞。

AFB1能够选择性的、非随机的结合大鼠DNA：如特异性地结合肝细胞线粒体DNA，肝细胞核内核糖体DNA的RNA基因序列，肝细胞核仁染色单体上的转录活性区域等。这种结合与DNA 上相应结合区域对该毒素的可接受度有关；通常这种区域缺少组蛋白，同时rRNA区域由于其较高的转录活性而保持弥散型的构象。有人在体外研究了AFB1与不同蛋白质结合的能力，发现AFB1与组蛋白的结合力相对较弱，含NLS（细胞核定位信号）的蛋白质能够推动AFB1向细胞核内的迁移，在细胞核内AFB1被活化以及形成加合物。AFB1与线粒体DNA共价结合的亲和力要比其与细胞核DNA共价结合的亲和力高3～4倍。一旦线粒体DNA发生损伤，这种变化就往往是稳定而又持久的，这可能反应出线粒体中缺少一种适当的切除修复机制，因而线粒体的转录和翻译过程就会持久地被这些损伤所抑制，导致细胞发生转化。

AFB1与DNA的共价结合可能会抑制DNA的甲基化，从而改变基因表达和细胞分化。然后，致癌基因可能被激活，通过在已经发生改变的基因上产生可遗传的转录水平的突变，促使哺乳动物细胞内致癌基因的转化形成。

2 饲料中黄曲霉毒素B1的防治措施

2.1饲料中AFB1的吸附

目前用于AFB1解毒的方法主要有两种，即化学方法和添加吸附剂。尽管大多数化学方法都很有效，但是它们并不能满足多方面的要求，尤其是反应产物的安全性、被处理的食品、饲料中营养成分的稳定性等方面。此外，化学处理使成本增加，难以满足畜牧生产者的需要。

添加吸附剂是一种简单、经济、有效的解毒方法，能够达到较好的预期效果。尽管已经有大量关于吸附解毒的试验资料，目前仍然没有搞清楚吸附材料与毒素间的作用机制。下面是饲料中使用过的霉菌毒素吸附剂。

2.1.1酯化葡配甘露聚糖（EGM）

EGM是一种酵母细胞壁提取物，其本质是一种多孔性碳水化合物。G..

Devegoda等的研究结果表明，EGM能够在广泛范围内（PH3～8）吸收霉菌毒素，尤其是能够特异性、高比例（85.23％）、稳定地结合黄曲霉毒素（包括AFB1）；同时对消化道中的营养成分破坏较少。而且它的作用环境与大多数畜禽消化道PH值接近，在饲料中的有效添加量低， 0.5～1.0Kg/T。但是EGM的提取与合成工作量很大，大批量生产存在一定难度，因此，在实际生产中的广泛应用受到限制。

2.1.2无机矿物吸附剂

目前在生产上常采用的对付饲料中霉菌毒素的办法是吸附或稀释，即降低毒素在机体内的有效浓度，使之不进入消化道或尽可能减少其在消化道的吸收。现在常用的霉菌毒素吸附剂有水合铝硅酸钙钠盐（HSCAS）、沸石粉、膨润土、粘土、蒙脱石和活性炭等。上述物质在消化道环境中，能够通过螯合作用、分子间作用力等与霉菌毒素分子的某些基团发生作用，从而吸附毒素，尤其是AFB1；或者在吸附过程中使毒素结构发生改变（可逆或不可逆），使其毒性降低或消失。但是由于这类物质添加量大，往往会稀释饲料中的养分浓度，不利于动物发挥最佳生产性能；而且可能吸附消化道内的营养成分或有益微生物，降低饲料利用率。

2.1.3纳米材料吸附剂

纳米材料(nano-material)又称为超微颗粒材料，由纳米粒子组成。粒子尺寸范围在1－100nm之间，它处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域，具有表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应；在光学、热学、电学、磁学、力学以及化学方面的性质和大块固体时相比有显著的不同。纳米材料表面原子数增多，原子配位不足及高的表面能，使这些表面原子具有高的活性，极不稳定，很容易与其它原子结合。

由于纳米材料本身的具有的上述特殊性质，以及学科的发展与交叉，使得其在动物营养与饲料科学领域的应用前景极为广阔，有望被用来吸附饲料中存在的霉菌毒素污染问题，同时解决动物产品中的残留问题。

2.2抑制AFB1的产生

目前，关于抑制黄曲霉菌和寄生曲霉菌菌株产生AFB1的研究最多的是柠檬醛。

余伯良等（2002）报道，柠檬醛对黄曲霉产生黄曲霉毒素B1的抑制较强，能够减少81％以上的毒素产生。

根据罗曼等（2001）所做的柠檬醛对黄曲霉的抑菌试验，柠檬醛对黄曲霉的MIC为0.5mg/L 。柠檬醛的抗菌性不仅是由于它破坏了黄曲霉菌的细胞膜，细胞壁以及膜的选择通透性，提高膜的电导率，破坏氧化还原反应，而且还由于它损伤了黄曲霉菌的线粒体和核DNA。因此，柠檬醛的抑菌效果是多方面作用的结果，但最重要的是柠檬醛通过损伤质膜而进入细胞，最终导致黄曲霉核DNA的损伤。

罗曼等（2002）还报道，柠檬醛能够扩大黄曲霉菌丝体细胞壁和质膜通道，然后渗入细胞壁和质膜，损伤线粒体结构、破坏线粒体氧化还原系统、降低耗氧量和呼吸速率，从而抑制菌丝体的生长，发挥抑菌作用。此外，柠檬醛有两种构型，任何一种构型都不能单独发挥抑菌效果，因此，柠檬醛的抑菌作用是两种构型共同作用的结果。

吴子健等（2002）报道，柠檬醛能够有效抑制黄曲霉细胞内苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的活力；苹果酸脱氢酶活力的降低会影响到线粒体膜上乙酰基穿梭体系正常功能的顺利进行，从而影响脂肪酸的合成。琥珀酸脱氢酶活力的降低会直接引起细胞内能量的缺乏，同时也影响黄曲霉细胞内的三羧酸循环过程，使细胞内用于生物合成所需的NADPH减少，最终影响黄曲霉体内的物质代谢。

国外还有学者采用生物学方法来解决霉菌毒素污染问题。他们在田间接种不产毒素的寄生曲霉或黄曲霉菌株，使之与产毒菌株竞争营养物质，从而抑制产毒菌株的生长，间接减少黄曲霉毒素的产生。

霉变的饲料原料和配合饲料中，受AFB1污染的机会几乎是100％，动物食用这种被污染的饲料后，AFB1势必会在一定程度上残留在动物体内，最终经食物链威胁到人类健康。因此研究并解决AFB1对动物性产品的污染问题已迫在眉睫。

目前，在动物营养与饲料科学中，针对黄曲霉毒素，尤其是AFB1的研究还不够系统、深入，一般仅限于使用防霉剂和霉菌毒素吸附剂，从而达到毒素与机体隔离的目的。而且饲料中普遍使用的霉菌毒素吸附剂还存在很大的问题，通常在吸附毒素的同时，毒素吸附剂也吸附机体代谢所必需的营养成分，如维生素和矿物元素等；另一方面毒素吸附剂在饲料中添加量较大，稀释了养分浓度。这些都亟需在吸附技术和吸附材料的选择上加以改进，霉菌毒素污染问题仍然是当前饲料工业面临的一大难题。

浙江大学饲料科学研究所目前正致力于这方面的研究与攻关，通过构建纳米材料，同时对其进行有机改性处理，使之对黄曲霉毒素产生高亲和力、特异性的吸附。将纳米科技与动物营养与饲料科学紧密结合进行研究，浙江大学饲料科学研究所在国内外数首家，在这一开创性的领域走在世界最前列。我们已经成功构建了多种经有机改性后的纳米材料，并且进行了体外黄曲霉毒素吸附试验和前期的饲养试验。试验结果均表明，改性后的纳米材料在吸附黄曲霉菌毒素方面较常规吸附剂（如沸石粉、膨润土等）表现出优异的吸附特性。

我们下面的工作将就纳米材料对黄曲霉毒素毒素的吸附机理及吸附复合物在体内的代谢动力学进行深入研究，以期找到更为合理的材料、方法或途径来解决饲料中的霉菌毒素污染问题。

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Toxic Mechanism of Aflatoxin B1 and its detoxification in Feedstuff Feng Jian-lei Xu Zi-rong Shi-yinghua

(Feed Science Institute of ZheJiang University, The Key Laboratory

of Molecular Animal Nutrition, Ministry of

Education；HangZhou,310029)

Abstract The aflatoxins are a group of closely related mycotoxins

that produced by Aspergillus flavus and/or Aspergillus parasiticus, widely distributed in nature. AFB1 is the most potent toxin of the

group, sixty-eight folds of arsenic and ten folds of KCN in acute

toxicity. Toxicologically, aflatoxin B1 is a mutagen，a teratogen and a carcinogen.

Up to now, lots of research on aflatoxin B1 have been performed, the toxic mechanism of AFB1 and its detoxification in feedstuff are

reviewed in this article.

Keywords AFB1 mechanism adsorption nano-material

来源：饲料工业