叶绿素及蓝绿藻二合一在线监测仪验收方案

产品名称：叶绿素在线监测仪

型号：TETHYS400

量程：0-400ug/L

检验项目：

（1）重复性

（2）准确度

（3）直线性

（4）最低检出限

标准样品：叶绿素a标准样品，蓝绿藻标准样品（推荐使用荧光藻蓝蛋白标准提取样品）；

零点校正液：测试叶绿素a时推荐使用50%乙醇溶液作为零点校正液（也可使用重蒸馏水），测试蓝绿藻时使用重蒸馏水作为零点校正液。

量程校正液：使用80%F.S标准溶液。

试验条件：

环境温度：在（5～35）℃之间，试验期间的温度变化在±5℃以内。

相对湿度：相对湿度在85%下。

大气压：在（95～106）kPa压力下，其变化幅度在5%以内。

电源电压：（220±22）VAC。

电源频率：（50±0.5）Hz。

现场测试时，确保无外界强光直射仪器。

一、仪器现场调试方案：

1、实验准备

实验器具：1L棕色容量瓶，量筒，漏斗，1L试剂瓶，天平，洗瓶、药匙试剂：叶绿素a标准样品、荧光藻蓝蛋白标准样品

溶剂：95%乙醇溶液、去离子水（或者重蒸馏水），5%硫酸溶液

50%乙醇溶液准备：在1L试剂瓶中加入95%乙醇溶液500ml，在加入500ml 去离子水，稀释至刻度、摇匀。

2、标准样品的准备

叶绿素a标准试剂推荐使用由“和光纯业株式会社”出品的，标准试剂在运输过程中做好低温贮藏和避光措施。

蓝绿藻采用的是激发波长为590nm，发射波长为650nm左右的单一波长的荧光分光光度计的原理。

由于现行国家对水中蓝绿藻的测量没有任何标准，所以截止到本公司制定此企业标准为止，暂无用于测量水中蓝绿藻的标准物质。通过本公司实验测试后，使用藻蓝蛋白的荧光特性符合试验要求。

藻蓝蛋白（C-PC）晶体是从螺旋藻中分离纯化的，为具强烈荧光的蓝色冻干粉末能发出强烈的荧光，具有很好的吸光性能和很高的量子产率，在可见光谱区有很宽的激发及发射范围。

藻蓝蛋白晶体在4℃可稳定保存一年。不能冷冻。根据郎伯-比尔定律：

C = K * F

式中： C —荧光物质浓度；

K —物质荧光系数；

F —荧光强度。

K一般为常数，可见，荧光强度和荧光物质浓度呈正比，所以仪器测定的蓝绿藻浓度及与荧光强度成正比，因此校正仪器本身实际是校正仪器测定荧光物质荧光强度的过程。

3、标准溶液的配置

3.1 叶绿素a标准溶液的配置

将冰冻存放的10mg叶绿素A标准物晶体用无水乙醇溶解并定量移至500mL 棕色容量瓶中，用95%的乙醇溶液稀释刻度、捣匀。存放于-20℃的冰箱中。此储备液叶绿素a的浓度为20mg/L。（叶绿素a由“和光纯业株式会社”出品）。调试液的配制：（在对叶绿素a溶液进行稀释配置时乙醇溶液可根据实际情况适当增高）

①空白溶液（用于仪表调零）50﹪乙醇溶液或者用二次蒸馏水；

②80ug/L的叶绿素a溶液：取上述浓度为20mg/L的溶液4.0mL，于1000mL 棕色容量瓶中，用50﹪乙醇溶液稀至刻度、摇匀。

③200ug/L的叶绿素a溶液：取上述浓度为20mg/L的溶液10.0mL，于1000mL棕色容量瓶中，用50﹪乙醇稀释至刻度、摇匀。

④320ug/L的叶绿素a溶液：取上述浓度为20mg/L的溶液16.0mL于1000mL棕色容量瓶中，用50﹪乙醇稀释至刻度、摇匀。

⑤400ug/L的叶绿素a溶液：取上述浓度为20mg/L的溶液20.0mL于1000mL棕色容量瓶中，用50﹪乙醇稀释至刻度、摇匀。

⑥50ug/L的叶绿素a溶液：取上述浓度为20mg/L 的溶液0.25mL于1000mL棕色容量瓶中，用50﹪乙醇稀释至刻度、摇匀。

在深色的容量瓶中贮存高浓度的标准溶液。溶液应避光、低温、密封保存。稀释的标准溶液应现用现配。浓溶液储存在-20℃的密闭环境下有效期时间为半年。

3.2 蓝绿藻标准溶液的配置

将干燥存放的50mg荧光藻蓝蛋白标准物晶体用蒸馏水溶解并定量移至1000mL棕色容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度、摇匀。此时储备液的浓度为50mg/L。（荧光藻蓝蛋白由“美国sigma aldrich公司”出品）

调试液的配制：

①空白溶液（用于仪表调零）：蒸馏水

②5mg/L的藻蓝蛋白溶液：取上述浓度为50mg/L的溶液100mL于1000mL 棕色试剂瓶中，加900mL蒸馏水稀释至刻度、摇匀。

③10mg/L的藻蓝蛋白溶液：取上述浓度为50mg/L的溶液200mL于1000mL 棕色试剂瓶中，加800mL蒸馏水稀释至刻度、摇匀。

④15mg/L的藻蓝蛋白溶液：取上述浓度为50mg/L的溶液300mL于1000mL 棕色试剂瓶中，加700mL蒸馏水稀释至刻度、摇匀。

⑤20mg/L的藻蓝蛋白溶液：取上述浓度为50mg/L的溶液400mL于1000mL 棕色试剂瓶中，加600mL蒸馏水稀释至刻度、摇匀。

荧光藻蓝蛋白储备液和调试液应现用现配，配制在1000mL棕色试剂瓶中。

4、仪器调试

仪器出厂前已经过性能测试并合格，现场本公司售后调试工程师可按照以下方法进行仪器的二次调校：

4.1 叶绿素a测量通道的调校

1）首先通入5%的稀硫酸清洗仪器流通池，仪器清洗完毕后（如果清洗不干净可换用10%的稀硫酸溶液），通入二次蒸馏水对仪器进行调零。

2）调零稳定后，可以通入浓度为320ug/L叶绿素a标准样品溶液，进行手动测量，计算其测量值是否在仪器性能指标范围内，如果在范围内则无需在对仪器进行线性调校。

3）对仪器进行多点调校。依次通入浓度为80ug/L、200 ug/L、320 ug/L、400ug/L 的叶绿素a标准样品溶液进行手动测量，在仪器线性调校界面输入每种浓度的测量平均值，及完成仪器的线性调校（可以根据现场要求增加不同的浓度点）。

4）仪器线性调校完毕后，通入不同浓度的标准溶液，进行线性验证。

4.2 蓝绿藻测量通道的调校

1）首先通入5%的稀硫酸清洗仪器流通池，仪器清洗完毕后（如果清洗不干净可换用10%的稀硫酸溶液），通入二次蒸馏水对仪器进行调零。

2）调零稳定后，可以通入浓度为15mg/L藻蓝蛋白标准样品溶液，进行手动测量，计算其测量值是否在仪器性能指标范围内，如果在范围内则无需在对仪器进行线性调校。

3）对仪器进行多点调校。依次通入浓度为5mg/L、10 mg/L、15mg/L、20mg/L 的藻蓝蛋白标准样品溶液进行手动测量，在仪器线性调校界面输入每种浓度的测量平均值，及完成仪器的线性调校（可以根据现场要求增加不同的浓度点）。

4）仪器线性调校完毕后，通入不同浓度的标准溶液，进行线性验证。

当两个测量通道都验证合格并测量稳定后，即可对仪器进行性能测试试验。

二、仪器性能测试

1、叶绿素a测量性能测试

考虑到叶绿素a溶液的不稳定性，推荐在仪器现场调试正常完毕后，立即用标准溶液对仪器进行性能试验。

1．1 准确度（示值误差）

单参数零点和量程校正后，分别用满量程80ug/L、320ug/L浓度工作标准溶液与空白溶液进行连续交替三次测量，计算每次测量的浓度平均值。求出每次平均值与对应标准液的浓度之差相对于标准溶液的百分率。

1．2 直线性

依次测量下面表1中的各质量浓度叶绿素a标准溶液。

表1 叶绿素a标准溶液

分别对表1中4种质量浓度工作标准溶液与空白溶液进行连续交替三次测量，计算每次测量值的平均值。用最小二乘法对4种标准溶液的质量浓度和测量平均值进行处理，得到线性相关系数γ，即为测量线性的检定结果。

1．3 重复性:：

测定零点校正液6次，将各次显示值的平均值作为零值。在相同的条件下，测定量程校正液 6 次，将各次测定值扣除零值后计算相对标准偏差。

标准偏差s c：

1)

( Sc 2

1

--

=

-=

∑

n

c

c

i

n

i

式中：i c为第i次显示值（i=1、2、3 …6），n=6；

再求出其相对标准偏差RSD（%）：

%

100

RSD(%)?

=

c

Sc

1.4 最低检出限

选取质量浓度为50ug/L 叶绿素a标准溶液。对空白溶液与标准溶液进行连续交替11次测量。如果在测量中，有1次数据确认是由外界干扰或操作引起的粗大误差，应将该次数据剔除。

由下式计算每次测量的荧光强度：

C

i = C

i1

– C

i0

(2)

式中：C

i1

—标准溶液的测试值；

C i0— 空白溶液的测试值。

测量值的平均值为： ∑==n i i C n C 1

1 （3） 式中：n — 测量次数。

检出极限指二倍于标准偏差读数的物质浓度。用符号DL 来表示； )/(2L ug s C

c DL ?= （4） 式中：C — 11次测量的平均值；

c — 标准溶液的质量浓度；

s — 单次测量的标准偏差。

2、蓝绿藻测量性能测试

2．1 准确度（示值误差）

单参数零点和量程校正后，分别用满量程5mg/L 、15ug/L 浓度藻蓝蛋白工作标准溶液与空白溶液进行连续交替三次测量，计算每次测量的浓度平均值。求出每次平均值与对应标准液的浓度之差相对于标准溶液的百分率。

2．2 直线性

依次测量下面表1中的各质量浓度藻蓝蛋白标准溶液。

表2 藻蓝蛋白标准溶液

分别对表2中4种质量浓度工作标准溶液与空白溶液进行连续交替三次测量，计算每次测量平均值。用最小二乘法对4种标准溶液的质量浓度和测量平均值进行处理，得到线行相关系数γ，即为测量线性的检定结果。

2．3 重复性:：

测定零点校正液6次，将各次显示值的平均值作为零值。在相同的条件下，测定15mg/L 的藻蓝蛋白标准样品溶液 6 次，将各次测定值扣除零值后计算相对标准偏差。

标准偏差s c ：

1)(Sc 2

1--=-

=∑n c c i n i 式中：i c 为第i 次显示值（i=1、2、3 …6），n=6；

再求出其相对标准偏差RSD （%）：

%100RSD(%)?=c Sc

三、现场对比实验：

由于叶绿素受外界环境因素影响大，所以在做现场水样对比试验时，务必按照下列方案实施。

对比实验条件：

环境温度：在（5～35）℃之间，试验期间的温度变化在±2℃以内。最好选择在一个固定时间段进行对比实验。

电源电压：（220±22）VAC ；电源频率：（50±0.5）Hz 。（电气环境稳定） 现场测试时，确保无外界强光直射仪器，对比实验时，确保在一个相对比较稳定的天气情况下进行。

对比实验方案：

多取一些现场水，取出一部分作为现场水样，剩余水作为储备样品，并做好储备样品的遮光、恒温措施；将水样在国家标准实验室进行化验（用棕色瓶盛装水样，且水样在运输过程中做好恒温措施），检验出水样中叶绿素A 的实际浓度值（作为标准值）。将剩下的部分水分别稀释1倍、2倍、3倍等。首先用此已知浓度的现场水样校准仪器。

校准完仪器后，连续测量现场储备样品6次，计算出六次测量的平均值，求出该平均值对应标准值之差相对于标准值的百分率，此为实际水样比对试验相对误差。

ΔC =%100?--

S S C C C 式中：ΔC ——实际水样比对试验相对误差；

-

C ——测量平均值；

C——现场水样实际值。

S