三维细胞培养的意义
三维细胞培养——
提供更真实的体外生物模型
细胞2D培养与3D 培养的本质差异
细胞特征2D 培养3D 培养形态片状、平板、单层生长球状或聚集状的自然结构
增殖速度比活体内细胞更快因3D模型和细胞不同，可能比
2D培养的更快或更慢
在培养基/药物中的
暴露程度细胞均匀暴露于培养基中的营养物/
生长因子/药物
营养物/生长因子/药物可能无法
充分浸润到中心区域的细胞
基因/蛋白表达比体内细胞相比，基因和蛋白表达
水平都有所差异更接近体内细胞的状态。干细胞能更好地维持干性，也更容易被诱导分化
药物敏感性细胞对药物更敏感，药物似乎更有
效果细胞对药物更耐受，结果能更有效地指导体内药物治疗
3D与2D培养的干细胞生物学特性对比
3D培养的干细胞与2D培养的干细胞相比
●细胞活力更强
●能更好地维持干性
●更容易被定向诱导分化
参考文献：Ling Guo, et al. Epigenetic changes of
mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. J.
Cell. Mol. Med. 2014,18,(10):2009-2019
产品介绍
3D与2D培养的肿瘤细胞药敏性对比
●药物种类：阿霉素
●细胞类型：MCF-7
●结果：3D培养的肿瘤细胞IC50（达到50%死亡
率时所需的药物浓度）是2D培养细胞的100倍
3D培养的细胞与体内真正的3D肿瘤组织有更强的生物学相关性，因此更能预测临床结果。
对于大多数抗肿瘤药物，3D培养的细胞的药敏性要低于2D培养的细胞。
用传统的2D培养细胞筛选出来的药物，通过动物实验后，能通过三期临床实验的只有10%。
而最终被证明有效的只有5%。造成了极大的实验成本浪费。
3D 培养——更真实的体外生物模型3D culture
?得出更真实的结果
3D culture
?为临床试验节约成本
3D culture
?发表更高层次的论文
3D细胞培养常见方案
悬浮培养，使细胞自发聚集成球
?无法精确控制球的大小
?换液易损失细胞球
悬滴培养
?换液困难
?用微流体装置换液操作繁琐，代价高昂，较难普及
三维支架包裹培养
?生物相容性差
?细胞成活率低，难以长成类组织结构
活组织块培养
?微组织切块难
?营养吸收差，培养成功率低
HEK293FT细胞培养
293细胞培养 293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与https://www.360docs.net/doc/e99880167.html,ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。严禁过度生长，这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。 293细胞培养特性： 1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。 2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时90%以上细胞贴壁。293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。 3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。 4、复苏293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至2个50ml瓶中时较为合适。刚复苏的293贴壁很慢，复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。 5、转染：体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘，长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落，最好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落。 其它的经验： 1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取 2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度， 3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。
微重力磁悬浮三维细胞培养仪
三维微重力磁悬浮细胞培养系统 研究复杂的细胞和组织，及其信号传导与调控可不是件容易事。而模拟细胞或组织环境，建立最接近体内天然条件的实验系统同样困难。这就是3D细胞培养所面临的挑战，3D培养系统旨在更好的模拟细胞的体内生长环境，为其创造更天然的家。近来越来越多的证据表明，3D细胞培养系统比传统2D培养系统更贴近体内的生理条件。也许3D培养系统的最大价值在于，其更接近体内环境的系统能够有效的辅助药物研发。“3D细胞培养的主要优势在于，能够在研究早期的体外实验中模拟细胞在体内的行为，”。“传统2D细胞培养往往无法了解细胞在组织内的功能和应答反应，结果可能导致以2D细胞培养为基础的药物或生物学研究出现偏颇，并且也难以预测药物在体内的效果。而3D细胞培养可以为研究者们提供药物等更真实的早期信息，从而降低像市场推出新药的研究成本。众多的科研工作者一直在寻找简单方便最天然的3D细胞培养工具？？？？？？？？Micforce米力光国际CO.,LTD The Bio-Assembler? System The Bio-Assembler? system cultures cells in three-dimensions by magnetic levitation. The Bio-Assembler?uses nanoparticle-based Nanoshuttle-PL solution to deliver magnetic nanoparticles to cells. Magnetic drives then levitate cells to create the 3D cell growth environment. Using the Bio-Assembler? is as easy as performing standard monolayer (2D) culture. Preparation time and cell manipulation requirements are equivalent to 2D culture. Advantages of n3D’s 3-Dimensional Cell Culturing System: ?Rapid formation of 3D structures and cell-cell interactions ?More accurate representation of in vivo tissue ?Compatibility with virtually any cell type including primary and stem cells ?Compatibility with any media type, standard culturing protocols, and diagnostic techniques ?3D co-culturing capabilities ?Unique capability for moving and shaping tissue, applicable to invasion studies and tissue engineering As Simple as 2D There are only two simple additional steps that differentiate the Bio-Assembler? from 2D cell culturing:
原代细胞培养与分离
原代细胞的培养与建系 凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。 原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。 一、取材的基本要求 .1．取材要注意新鲜和保鲜 .2．应严格无菌 .3．防止机械损伤 .4．去除无用组织和避免干燥 .5．应注意组织类型、分化程度、年龄等 .6．作好记录 二、各类组织的取材技术 皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材 血液细胞的取材 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 动物组织取材 人胚体组织取材 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材 皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘
米。 内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。 血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。 动物组织取材 1、鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。 2、幼鼠胚肾（或肺）取材 幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，
体外细胞培养
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
大规模细胞培养技术
大规模细胞培养技术简介 大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。 所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。 随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70 年代以来，细胞培养用生物
细胞培养
1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。 2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。 3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。 4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。5．取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。 6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。7．打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。 8．将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。 9．取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。 10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。 11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。 12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。 13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。 293T细胞 培养条件： 37℃，5% CO2，PH值~，无菌恒温培养。 细胞相关操作： 细胞复苏 1. 37°C水浴预热培养基（DMEM+10% FBS）； 2. 从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3. 在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4. 弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀； 5. 置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。 细胞传代 1. 当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；
三维细胞培养技术在再生医学研究中的应用
三维细胞培养技术在再生医学研究中的 应用 摘要：体外细胞培养技术已成为细胞生物学、药学、毒理学、干细胞、系统生物学和新药创制等领域必不可少的工具。传统平板细胞培养方法使细胞单层生长于二维环境，不能产生体内的细胞外基质屏障。且细胞表型也异于原代细胞，而三维细胞培养技术通过模拟机体内细胞生长的生理微环境，利用各种支架或设备来促进细胞生长和组织分化，产生具有合理形态结构和功能性的组织，具有细胞培养直观性和条件可控性的优势，故其在再生医学应用方面有着非常大的发展潜力。本文从干细胞、血管再生、器官移植、以及组织修复等方面综述了近期三维细胞培养技术在再生医学研究中的应用，并介绍了三维细胞培养技术在功能性生物材料方面研究中的作用，有助于对功能性生物材料的表面改性设计研究。 关键词：三维细胞培养技术；再生医学；干细胞；血管再生；器官与组织修复 随着生物医学的发展．疾病的治疗方式已得到了极大改进。但组织器官严重损伤后修复缓慢，或由于创伤过大而致组织器官无法修复，使得再生医学成为当今生物医学的关注焦点和研究热点。体外建立适合细胞和组织生长的生理微环境对再生医学研究至关重要，而传统的单层平面培养的细胞无论是在形态，结构和功能方面都与在体内自然生长的细胞相去甚远．由于无基质支持，细胞仅能贴壁生长。从而失去其原有的形态特征及生长分化能力，而三维细胞培养技术以其能为细胞和组织创造一个均衡获取营养物质、进行气体交换和废物排出的理想生理场所。又易于形成具有合理形态和生理功能的组织器官等特点，广泛应用于再生医学的研究[ ]。目前，三维细胞培养方式发展迅速，包括皮氏培养瓶、灌注小室、搅拌式生物反应器、中空纤维生物反应器、以及微重力旋转生物反应器等培养方式。其中微重力旋转细胞培养技术因其特有的微重力环境，使细胞与细胞、细胞与载体的交联度、沉降力、机械力、压力等发生相互作用、相互制约，模拟了近似生物体内细胞的生长状态和微环境，在再生医学领域应用中备受关注.。除再生医学以外，三维细胞培养技术也常被应用于药物载体、药物毒理、药物筛选、肿瘤治疗等方面的研究 1 三维细胞培养技术在再生医学应用中的优势 三维细胞培养技术使用三维支架或设备细胞提供类似体内生长环境的支架或基质．建立细胞问及细胞与胞外基质问的联系．促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动，形成一定的三维结构，既保留了体内细胞微环境的物质结构基础．又实现了细胞培养的直观性及条件可控制性，便于研究人体生理、病理状况，以及预防或疾病的治疗。三维细胞培养技术主要通过体内和体外两种方式。实现其在再生医学中的应用，两者皆采用从机体获得功能细胞。细胞体外扩增培养后，与三维结构的生物材料按一定比例混合。前者是直接植入体内
常规细胞培养方法(原代培养和传代培养)
原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 2010-12-02 10:29 来源：PriCells 点击次数：335 关键词：上皮细胞成纤维细胞培养分离纯化 分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 PriCells- 原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长，既有上皮样细胞又有纤维样细胞，纤维样细胞又包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等。混杂的细胞会直接影响实验结果。 在体外培养原代细胞时，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性、和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步，甚至需要从混杂的细胞群中分离出单个细胞来进行培养和开展实验研究。 一、原代细胞增殖优势纯化方法：
自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。此法花费时间长，留下的往往是成纤维细胞。仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来的，不断纯化而建立细胞系。 二、原代细胞常用纯化方法： 人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。 1 、细胞时间差酶消化法： 酶消化法是比较常用的纯化方法，不仅对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，是两者分开，达到纯化的目的；另外对贴壁细胞与半贴壁细胞及黏附细胞间的分离纯化也是十分有效的。
转化医学论文——3D细胞培养技术
3D细胞培养技术的发展和应用 摘要：传统细胞培养技术在模拟细胞体内生存环境方面做得还不够。 3D细胞培养技术的发明就是为了在细胞培养过程中，为细胞 提供一个更加接近体内生存条件的微环境。本文阐述了何为 3D细胞培养技术，3D细胞培养技术的发展过程以及其最新科 学进展。主要描述3D细胞培养技术的基础理论发展到临床实 践应用的过程，让读者了解并知道什么是3D细胞培养技术以 及其临床实践应用，使3D细胞培养技术更能有效、普遍地应 用于临床治疗中去，造福处在疾病中的人们。 关键词：3D细胞培养技术 3D心脏组织人工器官 正文： 一、什么是3D细胞培养技术 体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境,该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。3D 细胞培养技术(TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成3D的细胞载体复合物。3D细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中,细胞外基质(ECM)蛋白充当生长支架,使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构,所创建的细胞生长环境,则最大程度地模拟体内环境。TDCC作为体外无细胞系统及单层细胞系统的研究与组织器官及整体研究的桥梁,显示了它既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础,又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。近几年3D细胞培养技术在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域得到了广泛的应用。 二、3D细胞培养技术的原理 利用磁性微球载体和磁悬浮技术使贴有细胞的微球载体悬浮在培养液中，确保了高质量、高密度的细胞繁殖，突破了传统有盖培养皿、培养瓶或微孔板细胞培养耗时繁琐，细胞产量微小等局限性。 三、3D细胞培养技术的临床应用 1、神经系统
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
从二维到三维细胞培养的变迁
从二维到三维细胞培养的 变迁 Newly compiled on November 23, 2020
细胞培养技术进展概述及分析 细胞培养一直是细胞生物学中基础且核心的部分。无论是进行细胞性状研究，还是进行细胞产物的研发，都需要以细胞体外扩增技术-即细胞培养技术为基础。随着生命科学的发展，细胞培养技术更是被广泛应用于生物学、、新药研发等多个领域，成为生命科学最重要的基础技术之一。 传统的细胞培养即细胞的平面培养，细胞在培养过程中只能沿平面延伸，属于细胞的二维培养技术。这种培养方式经济、便利、易操作，符合某个历史阶段对细胞培养技术的要求。但随着研究的深入，传统的二维培养技术已经不能满足细胞培养需求。盖因生物体内的细胞是在立体三维的微环境中生长的，二维培养微环境与体内微环境差异太大，影响细胞的基因表达、信号转导等，导致所培养的细胞逐渐丧失其在生物体内的生物学特性及功能，失去研究及应用价值。传统的二维培养技术，已经成为细胞学为基础的众多学科进步的壁垒之一。 科学家开始寻求更贴近自然状态的细胞培养技术。一种与活体组织内的细胞外基质相似的，能更好的模拟细胞在体内生长环境的培养技术，即细胞的三维培养技术。 目前已开发出很多细胞三维培养技术，大致可分为需要支架的三维培养技术和不需要支架的三维细胞培养技术。支架类主要是在三维空间内构建供细胞附着和生长的类似脚手架的多孔结构, 细胞依附于支架进行三维生长和迁移, 主要的支架材料有胶原和水凝胶等；而不需要支架的三维培养技术主要是通过物理方法使贴壁细胞悬浮于培养基中以达到三维培养的目的, 目前主要的技术有微载体、磁悬浮、悬滴板和磁性三维生物印刷等技术。
3D细胞培养
3D多细胞肿瘤球的培养 原创2017-04-20医生科研助手 3D多细胞肿瘤球是在体外应用组织培养方法使肿瘤细胞以多细胞集聚体的形式生长成为具有三维结构的球体。 与传统的2D贴壁细胞培养模型相比，3D多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征。 因此，3D多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用于干细胞培养和分化、癌症研究、药物和毒性筛选及组织工程等特定应用中。 虽然3D多细胞肿瘤球模型具有更显著的实体肿瘤生理相关性，但是与2D贴壁细胞培养模型相比，获得大量相对统一的3D多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养过程和表征手段。 本文利用Liquid Overlay的制备方法，以乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7为模型制备3D多细胞肿瘤球并采用倒置显微镜、激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜对其进行详细表征。
1 实验前准备工作 1.提前24 h取12 mL DMEM和RPMI 1640完全培养基（含10%FBS，下同）于50 mL离心管内，置于4℃冰箱中预冷； 2. 将分装好的Matrigel基质胶提前24 h从-20℃放入4℃，使其融化成液体状态； 3. 将无菌的1 mL移液器枪头放入无菌50 mL离心管内，置-20℃冰箱预冷。 2 琼脂糖包被96孔板 1. 准确量取6 mL RPMI 1640培养基（或DMEM培养基）于2个10 mL的注射玻璃瓶内，加入90 mg琼脂糖，盖塞后放入80℃的水浴锅内加热溶解30 min； 2. 加热结束后，将注射瓶放入灭菌锅内，115℃灭菌30 min；
3. 灭菌完成后，迅速取出注射瓶放入超净台内。将注射瓶内的琼脂糖溶液倒入无菌的加样槽中，用多通道移液器以每孔60 μL的量加入96孔板内。 注意：由于琼脂糖溶液在室温时会凝固，因此从灭菌锅内取出琼脂糖溶液后一定要快速转移至超净台内并迅速加入至96孔板中。 此外，为保证加样时琼脂糖不冷却，需要同时灭菌加样槽和100 μL的移液器枪头。 4. 加入完成后，96孔板要保持水平约30 min使孔内的琼脂糖凝固。 3 配置含Matrigel基质胶细胞悬液 1. 取对数生长期的MDA-MB-231细胞（或MCF-7细胞），胰蛋白酶消化后进行细胞计数，用RPMI 1640完全培养基（或DMEM完全培养基）将细胞悬液浓度调整至 2.0×105cells/mL，备用。
MDCK细胞培养基本技术方法 -2011本
MDCK细胞培养 一、目的MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。 二、适用范围适用于疾控中心所有技术人员。 三、程序 （一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-1所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。 （二）材料 1.生长成片的MDCK细胞 2.无菌的T25细胞培养瓶 3.D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 4.青、链霉素母液（10000U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃ 5.HEPES缓冲液，1M母液 6.胎牛血清 7.EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mMEDTA-4Na），分装后保存于-20℃8.7.5%牛血清白蛋白组分V9.1mL、10mL无菌移液管10.70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。 （三）实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 1.D-MEM培养液的准备 500mLD-MEM液中加入：青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素），HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL 2.细胞生长液的准备 胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 3.首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 4.温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。
5.重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 6.加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。 7.加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。 8.取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞） 9.每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。 10.于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
三维细胞培养的意义
三维细胞培养—— 提供更真实的体外生物模型
细胞2D培养与3D 培养的本质差异 细胞特征2D 培养3D 培养形态片状、平板、单层生长球状或聚集状的自然结构 增殖速度比活体内细胞更快因3D模型和细胞不同，可能比 2D培养的更快或更慢 在培养基/药物中的 暴露程度细胞均匀暴露于培养基中的营养物/ 生长因子/药物 营养物/生长因子/药物可能无法 充分浸润到中心区域的细胞 基因/蛋白表达比体内细胞相比，基因和蛋白表达 水平都有所差异更接近体内细胞的状态。干细胞能更好地维持干性，也更容易被诱导分化 药物敏感性细胞对药物更敏感，药物似乎更有 效果细胞对药物更耐受，结果能更有效地指导体内药物治疗
3D与2D培养的干细胞生物学特性对比 3D培养的干细胞与2D培养的干细胞相比 ●细胞活力更强 ●能更好地维持干性 ●更容易被定向诱导分化 参考文献：Ling Guo, et al. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. J. Cell. Mol. Med. 2014,18,(10):2009-2019
产品介绍 3D与2D培养的肿瘤细胞药敏性对比 ●药物种类：阿霉素 ●细胞类型：MCF-7 ●结果：3D培养的肿瘤细胞IC50（达到50%死亡 率时所需的药物浓度）是2D培养细胞的100倍 3D培养的细胞与体内真正的3D肿瘤组织有更强的生物学相关性，因此更能预测临床结果。 对于大多数抗肿瘤药物，3D培养的细胞的药敏性要低于2D培养的细胞。 用传统的2D培养细胞筛选出来的药物，通过动物实验后，能通过三期临床实验的只有10%。 而最终被证明有效的只有5%。造成了极大的实验成本浪费。
原代细胞培养和传代培养的方法及其
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
原代神经细胞培养方法精编版
原代神经细胞培养方法 精编版 MQS system office room 【MQS16H-TTMS2A-MQSS8Q8-MQSH16898】
神经细胞培养体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神 经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持 结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提 供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的 生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、 荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免 疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学 和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直 接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药 物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影 响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些 经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一. 鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒 置显微镜下观 察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1．材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一 次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气
室部蛋壳。 （3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置 灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。 （4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧 排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。 （5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料 培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。 2．结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, ，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini 的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。 1．材料和方法 取新生一天的大鼠(wistar种)和小鼠(昆明种)。用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤, 然后剪取一段脊髓,背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上,在解剖显
《细胞实验》02 原代细胞培养和传代培养的方法
原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时 也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去
三维细胞培养技术的发展与应用
三维细胞培养技术的研究与应用 【摘要】三维细胞培养技术是在二维细胞培养和动物实验模型的基础上发展起来的简单、有效的细胞培养方式。利用三维细胞培养技术可以更好的模拟体内微环境，为相关研究领域提供新的手段。目前，三维细胞培养技术在组织工程、肿瘤学、再生医学和干细胞生物学等研究领域均有应用。该文就近年来三维细胞培养技术的发展及应用进行综述。 【关键词】单层细胞培养;三维细胞培养;人工脉管 自Willhelm Roux于1885年从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养，单层细胞培养技术己有百余年的历史。一个多世纪以来，单层细胞培养有了蓬勃的发展，特别是在制药或者疫苗合成等产业化领域，通过细胞的快速分裂，从而高效率地制造产品。但在生命科学基础研究领域，对于细胞的体外培养，关注的不仅仅是它们的分裂生长，而更为重要的是它们经过传代后能否维持体内的性状。在很多情况下，单层细胞培养技术所取到的研究结果和体内的情况不符合，因为细胞在体外改变的环境下增生，逐渐丧失了原有的性状。动物实验完全在体内讲行,但由干体内的名种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化，难以研究单一过程。另外，我们在动物身上所观察到的结果，往往是最终呈现的表现，而非研究者最为关心的中间过程。显然，如何填补单层细胞培养和动物实验的鸿沟，一直是生命科学家思索的问题。尤其是在发育生物学领域，迫切需要建立一套细胞培养技术，既能生长传代，还能最大程度地维持体内性状，并分化产生新的组织结构，以便全面研究发育过程。随着组织工程的新兴发展，三维细胞培养技术就应运而生了. 1什么是三维细胞培养技术 体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境，该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。不同于传统的二维化单层细胞培养，三维细胞培养技术(TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞载体复合物。三维细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中，细胞外基质(ECM)蛋白充当生长支架，使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构，所创建的细胞生长环境，则最大程度地模拟体内环境.TDCC作为体外无细胞系统及单层细胞系统的研究与组织器官及整体研究的桥梁，显示了它既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。近几年三维细胞培养技术在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域得到了广泛的应用;同时在筛选新药的疗效分析和毒理实验方面，利用三维培养获得了和