产葡萄糖氧化酶的筛选

※生物工程食品科学2011, Vol. 32, No. 01 149

产葡萄糖氧化酶菌株的筛选及

发酵培养基的优化

摘要：从土壤中筛选出了一株产葡萄糖氧化酶较高的菌株，利用响应面法对该菌株的产酶培养基进行优化以提高产酶量。响应面法优化的发酵培养基组成为：葡萄糖109.41g/L、复合氮源(m(月示蛋白

胨):m((NH4)2SO4)=3:1)37.36g/L、

吐温-80 37.15g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4·7H2O 0.7g/L 和KCl 0.5g/L。采用该优化培养基所得葡萄糖氧化酶的活力为1.54U/mL，较优化前提高了31.6%。

关键词：葡萄糖氧化酶；酶活力；培养基优化；

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)系统名为β-D- 葡萄糖氧化还原酶(EC1.1.3.4)。它能专一地将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢[1]。葡萄糖氧化酶在食品、医药及生物等领域有着广泛的应用[2]。在食品工业中，葡萄糖氧化酶可用于除去食品中的葡萄糖，从而防止食品发生褐变或获得纯度较高的低聚糖[3-4]；可脱掉食品中的氧，以达到改善食品品质、延长食品货架期的目的；作为面粉改良剂溴酸钾的替代品，用作一种更为安全的面粉改良剂[ 5 ]。在发酵工业中，葡萄糖氧化酶的催化产物为葡萄糖酸，可用于生产葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌等。葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体在微生物中主要是黑曲霉和青霉属菌株。目前我国生产的工业酶制剂纯度普遍较低，长期以来依赖进口，因此寻找进口酶制剂的替代产品具有重要意义。响应面法可同时对影响生物产量的各因子水平及其交互作用进行优化与评价[6]，因此它可快速有效地确定多因子系统的最佳条件，该法已经广泛应用于各类培养基以及发酵条件的优化[7-9]。为了提高微生物产酶量，罗斌等[10]利用响应面法优化了乳酸杆菌产γ- 氨基丁酸的培养条件，提高了目的产物的生产量；Aghaie 等[11]利用响应面法优化了黑曲霉产有机酸的发酵条件，经过发酵条件的优化提高了有机酸的产量。本实验从土壤中进行高产葡萄糖氧化酶菌株的筛选，在此基础上利用响应面法对发酵培养基进行优化，以提高葡萄糖氧化酶的产量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品的采集

采样地点：福州文武雪峰农场；采样部位和深度：取样深度为0～10cm；采样季节为秋季；采样方法、数量：采用多点混合土样采集方法，每个混合土样由20 个样点组成，每个点的取土深度及质量均匀一致，每个混合样品取0 . 1 k g ，对采集样品进行编号待用。

1.1.2 培养基

平板分离培养基：底层培养基：葡萄糖80g/L、蛋白胨3g/L、(NH4)2HPO4 0.388g/L、KH2PO4 0.188g/L、MgSO4·7H2O 0.156g/L、CaCO3 3.5g/L、琼脂20g/L；上层培养基：葡萄糖8 0 g /L、可溶性淀粉1 0g /L、KI1.7g/L、去氧胆酸钠0.2g/L、磷酸缓冲液0.1mol/L、琼脂20g/L，pH5.6。种子培养基：NaNO3 2g/L、K2HPO41g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4 0.01g/L、蔗糖30g/L、琼脂20g/L。发酵培养基：葡萄糖80g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4·7H2O 0.7g/L、KCl 0.5g/L。

1.2 方法

1.2.1 高产葡萄糖氧化酶菌株的初筛根据Fiedure 显色法[12]，称取10g 采集来的土壤样品于经过灭菌(121℃、20min)处理的装有100mL 生理盐水且含有玻璃珠的250mL 锥形瓶中振荡30min。然后用

无菌水稀释成10-4、10-5 两个稀释度，分别用移液器吸取0.1mL涂布于预先配制并且灭菌的分离培养基中，28℃培养3d 后置于5℃冰箱中静置2d，然后在室温下存放至出现蓝色颜色圈。选取颜色圈中的菌株接种到种子培养基的斜面上培养。

1.2.2 高产葡萄糖氧化酶菌株的复筛

将初筛得到的斜面转接种于含有发酵培养基的摇瓶中继续培养5 d ，测定发酵液的酶活力。

1.2.3 粗酶液制备

将上述筛选出来的菌株接种于(孢子浓度104 个/mL)发酵培养基中，于3 0 ℃恒温摇床培养5 d ，摇床转速30 0r/min。发酵完毕后纱布过滤，菌丝体经研磨，磷酸钾缓冲溶液(50mmol/L，pH6.5)浸酶，得粗酶液。

1.2.4 酶活力的测定

葡萄糖氧化酶的酶活力测定采用郭晓贤等[ 1 3 ]的方法。取250mL 三角瓶，加入2% 葡萄糖磷酸缓冲液( pH5.6) 25mL 及1mL 粗酶液，立即于29℃振荡lh，然后加入0.1mol/L NaOH 溶液20mL 以终止反应，用0.1mol/L盐酸滴定剩余的NaOH，记录所消耗的盐酸体积(V0)；对照样在加酶液之前加入0.1mol/L NaOH溶液20mL，不必振荡，其他操作相同，记录所消耗的盐酸体积(V1)。酶活力单位定义：在上述实验条件下，每分钟催化氧化1μmol 葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位( U) 。计算公式为：GOD 酶活力=[(V1 －V0)×n ×c ×1000]/60

式中：c 为盐酸浓度(0.1mol/L)；n 为稀释倍数。

1.2.5 Box-Behnken 响应面设计

通过单因素试验结果确定三因素三水平的中心组合试验。拟合出一个二次多项式方程。该方程为描述响应变量与自变量的经验模型，对于三因素系统，模型可表述为[9-11]：

Y=b0+b 1X1+b2X2+b 3X3+b 11X1

2+b12X1X2+b 13X1X3+

b22X2

2+b23X2X3+b33X3

式中：X1、X2、X3 为由部分因素试验确定对响应值影响显著的3 种培养基组分的质量浓度/(g/L)；Y 为预测响应值，b 0 、b 1 、b 2 、b 3 、b 1 1 、b 1 2 、b 1 3 、b 2 2 、b23、b33 为方程系数。用软件Design-Expert 7.1.3 对试

验数据进行回归分析，其中回归系数的显著性用F 检验，方程的拟合性由确定系数R 2 确定。

1.2.6 模型验证

对拟合得到的多元函数进行简单的性状分析便可确定出其极值点以及取得极值的相应自变量的取值。再按照计算所得到的参数进行实验，以验证模型的可靠性，并确定最后的优化结果。

2 结果与分析

2.1 高产葡萄糖氧化酶菌株的筛选土壤是微生物的重要来源之一，经过对在不同地点取得的60 个土样进行初筛和复筛得到23 株具有产葡萄糖氧化酶能力的菌株，其酶活力如表1 所示。挑选所产酶

活力最高的一株进行后续实验，经过镜检观察其形态，发现它是一株霉菌，其孢子颜色为黑色，菌丝有隔，经鉴定其为黑曲霉，测得其酶活力为1.17U/mL。

2.2 葡萄糖质量浓度对产酶的影响

菌株编号酶活力/(U/mL) 菌株编号酶活力/(U/mL)

GOD-1 0.26 ±0.02 GOD-13 0.78 ±0.06 GOD-2 0.96 ±0.05 GOD-14 0.69 ±0.06

GOD-3 0.83 ±0.05 GOD-15 0.75 ±0.07 GOD-4 0.62 ±0.03 GOD-16 0.86 ±0.07

GOD-5 0.56 ±0.04 GOD-17 0.55 ±0.04 GOD-6 0.14 ±0.01 GOD-18 0.16 ±0.02

GOD-7 1.17 ±0.09 GOD-19 0.73 ±0.06 GOD-8 0.33 ±0.02 GOD-20 0.24 ±0.02

GOD-9 0.39 ±0.03 GOD-21 0.44 ±0.03 GOD-10 0.46 ±0.02 GOD-22 0.51 ±0.04

GOD-11 0.52 ±0.03 GOD-23 0.58 ±0.05 GOD-12 0.63 ±0.05

表1 土样中分离菌株的酶活力

碳源对微生物的生长和产酶有重要影响，郭晓贤等[ 1 3 ]分别以蔗糖、葡萄糖、淀粉、乳糖、可溶性淀粉和麦麸作为碳源，研究这些碳源对黑曲霉产葡萄糖氧化酶的影响，研究结果表明葡萄糖对黑曲霉产葡萄糖氧化酶的效果最佳。本实验考虑到葡萄糖既能作为发酵的碳源和能源物质，又能作为葡萄糖氧化酶产生的诱导物，因此直接研究葡萄糖质量浓度对产酶的影响。葡萄糖分别按照质量浓度40、60、

80、100、120、140g/L添加到发酵培养基中，测定粗酶液酶活力，结果见表2。在葡萄糖质量浓度为100g/L 时，发酵液的酶活力最高，这可能是由于葡萄糖质量浓度在高于100g/L 时，出现了葡萄糖效应所产生的抑制现象，而当葡萄糖质量浓度低于100g/L 时，葡萄糖的含量又不足以满足菌体生长

以及产酶所需要的能源和碳源。

2.3 氮源种类及质量浓度对产酶的影响

张婷等[14]分别研究了有机氮源和无机氮源对黑曲霉产葡萄糖氧化酶的影响，在其研究中有机氮源选用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、月示蛋白胨和胰蛋白胨，无机氮源选用(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2HPO4 和(NH4)2S3O8，研究结果表明在有机氮源中，月示蛋白胨对黑曲霉产葡萄糖氧化酶的促进效果最理想。在无机氮源中，(NH4)2SO4 对产酶的促进效果最明显。而郭晓贤等[13]的研究结果表明，与单一的有机氮源和无机氮源相比，将有机氮源和无机氮源以一定的比例联合使用作为培养基的复合氮源效果最佳。基于上述研究结果，本实验研究有机氮源(月示蛋白胨)和无机氮源((NH4)2SO4)的比例及最适添

加量，结果如表3 、4 所示。根据表中实验结果在后续响应面试验中选择m(月示蛋白胨): m((NH4)2SO4)为3:1，复合氮源质量浓度为35g/L 左右进行研究。

葡萄糖质量浓度/(g/L) 40 60 80 100 120 140

酶活力/(U/mL) 0.86 ±0.06 0.97 ±0.06 1.18 ±0.08 1.27 ±0.09 0.91 ±0.05 0.87 ±0.04

表2 葡萄糖质量浓度对酶活力的影响

Table 2 Effect of glucose concentration on enzyme activity

m(月示蛋白胨):m((NH4)2SO4) 1:1 2:1 3:1 4:1

酶活力/(U/mL) 1.19 ±0.09 1.21 ±0.08 1.26 ±0.07 1.23 ±0.06

表3 氮源比例对酶活力的影响

Table 3 Effect of ratio between two nitrogen sources on enzyme activity

复合氮源质量浓度/(g/L) 20 25 30 35 40 45

酶活力/(U/mL) 0.87 ±0.07 0.97 ±0.07 1.25 ±0.08 1.27 ±0.07 1.27 ±0.09 1.27 ±0.08

表4 复合氮源质量浓度对酶活力的影响

Table 4 Effect of complex nitrogen source concentration on enzyme activity

吐温-80 质量浓度/(g/L) 10 20 30 40

酶活力/(U/mL) 1.19 ±0.08 1.22 ±0.07 1.30 ±0.09 1.23 ±0.06

表5 吐温-80 质量浓度对酶活力的影响

Table 5 Effect of Tween-80 concentration on enzyme activity

38%、细胞壁上占34%、胞浆中占12%、黏质液中占16%[14]。因此，考虑通过添加吐温促使胞间质中的酶释放出来。张婷等[ 1 4 ]分别研究了向基础培养基中添加吐温-20、吐温-40 和吐温-80 考察吐温种类对发酵液酶活力的影响，实验结果表明选用吐温-80 效果最好[14]。本实验选择吐温-80 作为表面活性剂，分别添加10、20、30、40g/L，考察其对酶活力的影响，结果见表5。吐温-80 的添加质量浓度为30g/L 时对产酶的促进效果最好，这可能是由于在添加质量浓度达到30g/L 之前，细胞膜和细胞壁的通透性随着添加质量浓度的增大而逐渐提高，在30g/L 左右菌体产酶达到最大值，而当添加质

量浓度继续增大，过大的细胞膜和细胞壁的通透性影响了菌体细胞正常生命活动。因此，在后续响应面试验中选择在30g/L 左右进行研究。

2.4 吐温种类对产酶的影响

葡萄糖氧化酶在细胞合成过程中，分布于胞外的占

2.5 Box-Behnken 响应面设计优化培养基

采用Box-Behnken 响应面试验设计确定显著因素的最优水平，试验设计见表6，结果见表7，系数估计见表8、9。由Design-Expert 7.1.3 软件拟合得到多元回归

模型为：

Y=1.51+0.075X1+0.035X2+0.045X3－0.0025X1X2－0.017X1X3－

0.022X2X3 －0.56X1

2 －0.046X2

2 －0.036X3

结果表明，决定系数R2=0.9638，说明回归方程的拟合较好。模型的F=20.73，该值远远大于0.0003，表明回归方程的F 检验显著，所拟合的二次回归方程合适。能解释96.38% 响应值的变化，因而该模型拟合程度良好，实验误差小，该模型是合适的，可以用此模型进行分析和预测。由响应面回归分析和回归方程拟合绘制响应面图形(图1～3)。说明该模型能解释97.99% 响应值的变化，该模型拟合程度良好，实验误差小，该模型是适合的，可以用此模型对产葡萄糖氧化酶菌株的

发酵培养基进行分析和预测。

注：P ≤0 . 0 5 时模型差异显著。

来源平方和自由度均方F P

模型0.11 9 0.012 27.73 0.0003

误差总计0.00395 7 0.0005533

失拟误差0.00375 3 0.00125 25 0.0047

纯误差0.0002 4 0.00005

总计0.11 16

R2=0.9638 R2

Adj =0.9173

表8 回归模型方差分析表

Table 8 Analysis of variance (ANOVA) for the developed regression

equation

试验号X1 X2 X3 Y/(U/mL)

1 －1 1 0 1.37

2 －1 0 1 1.38

3 0 0 0 1.50

4 1 －1 0 1.45

5 0 0 0 1.51

6 0 0 0 1.52

7 0 －1 1 1.46

8 0 1 －1 1.44

9 0 －1 －1 1.30

10 0 1 1 1.51

11 1 1 0 1.49

12 1 0 1 1.52

13 －1 －1 0 1.32

14 0 0 0 1.51

15 1 0 －1 1.49

16 0 0 0 1.51

17 －1 0 －1 1.28

表7 Box-Behnken 响应面试验设计及结果

Table 7 Box-Behnken response surface design arrangement and

experimental results

编码因素水平

X1 葡萄糖80g/L 100g/L 120g/L

X2 复合氮源30g/L 35g/L 40g/L

X3 吐温-80 20g/L 30g/L 40g/L

表6 响应面试验因素水平表

Table 6 Factors and levels in response surface design

由表8 方差分析(ANOVA)可以看出，F回归=27.73 ＞

F0.01(9，4)=14.66，P=0.0003 表明模型高度显著，不同处理间的差异极显著；模型的调整确定系数R2

Adj=0.9173，

说明该模型能解释91.73%响应值的变化，因而该模型拟合程度良好，实验误差小，可以用此模型对实际的发酵情况进行分析和预测。

从表9 回归模型系数显著性检验可知：模型的一次

项x1(P ＜0.0001)、x2(P=0.0042)、x3(P=0.0011)、X1

2

(P=0.0018)、X2

2(P=0.0052)和X3

2(P=0.0166)极显著，其他

项不显著。多元回归模型Y=1 .51+0.07 5X1+0 .03 5X2+ 0.045X3－0.0025X1X2－0.017X1X3－0.022X2X3－0.056X1

2－

项估计值F P ＞F

X1 0.075 79.75 ＜0.0001

X2 0.035 17.37 0.0042

X3 0.045 28.71 0.0011

X1X2 －0.0025 0.044 0.8393

X1X3 －0.017 2.17 0.1841

X2X3 －0.022 3.59 0.1000

X1

2 －0.56 23.61 0.0018

X2

2 －0.046 15.96 0.0052

X3

2 －0.036 9.81 0.0166

表9 回归模型参数方差分析表

Table 9 Significance test of each regression coefficient of the developed regression equation

注：P ≤0 .0 5 时模型参数差异显著。

0.046X2

2 －0.036X3

2 可以优化为Y=1.51+0.075X1+0.035X2+

0.045X3 －0.056X1

2 －0.046X2

2 －0.036X3

2。

图1 葡萄糖和复合氮源质量浓度对酶活力影响的响应面图

Fig.1 Response surface plot showing the interactive effects of complex nitrogen source and glucose concentrations on enzyme activity

1.550

1.485

1.420

1.355

1.290

葡萄糖氧化

酶活力/(U/mL)

复合氮源质量浓度/(g/L)

1.00

0.50

0.00

－0.50

－1.00 －1.00

－0.50

0.00

0.50

1.00

葡萄糖质量浓度/(g/L)

图2 葡萄糖和吐温-80 质量浓度对酶活力影响的响应面图

Fig.2 Response surface plot showing the interactive effects of Tween-80 and glucose concentrations on enzyme activity

1.5500

1.4825

1.4150

1.3475

1.2800

葡萄糖氧化

酶活力/(U/mL)

吐温-80 质量浓度/(g/L)

1.00

0.50

0.00

－0.50

－1.00 －1.00

0.00

1.00

葡萄糖质量浓度/(g/L)

－0.50

0.50

图3 复合氮源和吐温-80 质量浓度对酶活力影响的响应面图

Fig.3 Response surface plot showing the interactive effects of complex

nitrogen source and Tween-80 oncentrations on enzyme activity

1.5300

1.4725

1.4150

1.3575

1.3000

葡萄糖氧化

酶活力/(U/mL)

吐温-80 质量浓度/(g/L)

1.00

0.50

0.00

－0.50

－1.00

0.00

1.00

复合氮源质量浓度/(g/L)

－0.50

0.50

－1.00

※生物工程食品科学2011, Vol. 32, No. 01 153由图1 ～3 可看出，X1、X2、X3 存在极值点，对Y 进行岭分析，Y 的最大估计值为1.54043U/mL，此时葡萄糖质量浓度为109.41g/L，复合氮源(m(月示蛋白胨):m((NH4)2SO4)＝3:1)质量浓度为37.36g/L、吐温-80质量浓度为37 .1 5g /L 时，该模型预测的最高酶活力为1.54 U/mL。

2.6 验证实验

为检验模型预测的准确性，在优化条件下进行3 组250mL 摇瓶发酵实验，分别为响应面试验优化的配比、单因素试验得出的较优配比和未优化的培养基，所得酶活力分别为1.54、1.48、1.17U/mL，验证实验所得酶活力与模型预测值非常接近，表明该模型能很好地预测实际的发酵情况，而且菌株利用响应面试验优化的培养基所产酶活力显著高于(P ≤0.01)单因素优化培养基和未优化的培养基所产酶活力。

3 结论

本研究从土壤中分离出一株高产葡萄糖氧化酶的黑曲霉，其产葡萄糖氧化酶的活力为1.17U/mL；采用响应面试验优化法得到的发酵培养基组成为：葡萄糖质量浓度109.41g/L，复合氮源(m(月示蛋白胨):m((NH4)2SO4)＝3:1)质量浓度37.36g/L、吐温-80 质量浓度37.15g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4·7H2O 0.7g/L 和KCl 0.5g/L，所得葡萄糖氧化酶的活力为1.54U/mL，较优化前提高了31.6%。